专利名称：一种酸激活csp靶向抗菌肽及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽，具体地，涉及一种酸激活CSP靶向抗菌肽及其制备和应用。
背景技术：
龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生的慢性进行性破坏性感染性疾病
(樊明文2008; Kidd 2011).o who将其列为仅次于心血管病、肿瘤之后的第三大非传 染性重点防治疾病(Fontana . 2011).。变形链球菌{Streptococcus mutans是频病的主要致病菌 (Kiinbayashi — 2011>,为革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧，抑制其生长可
有效治疗龋(Giacaman . 2010, Marsh 2010)·°变形链球菌以生物膜(SM biofilm)的形式存在并致龋。以生物膜形式存在的细菌与以浮游态存在的细菌相比，在代谢特点和生理现象方面存在着众多明显的不同点，如对抗菌剂的敏感性、基因表达和信号传导、耐酸性等。细菌生物膜对多数抗菌剂有较强的抵
抗力，其抗性水平约为浮游态细菌的IO1-IO3倍(唐子圣.2006;张耀超2009;. 2011)。SM生物膜在红霉素和青霉素浓度为5000倍MIC作用I h时及浓度为1000倍MIC作用3 h时，未能被完全杀死；在洗必泰浓度为500倍MIC作用I h及浓度为100倍MIC作用3 h，也未
能被完全杀死_子圣.2006) ο类似地，Noiri等发现，牙龈卟啉菌单胞生物膜在160倍MIC
浓度的甲硝唑中仍能生长，其耐药机制与单个细菌迥然不同 moirt 2003)°细菌生物
膜耐药性的增强与其结构特点密切相关以生物膜形式存在的细菌，其生长速度显著低于浮游态细菌，常处于静止期，不易被常规的抗菌剂杀灭(Stewart. 2001)。而且，临床常用的抗菌剂如洗必泰、氟制剂等，还具有副作用并易导致细菌耐药、耐氟。抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有独特的抗菌机制、抗菌谱广、种类多、不易产生耐药性等特点。Batoni等报道，AMP主要通过膜攻击途径作用于生物膜内生长缓慢或不生长的细菌，从而抑制细菌及其生物膜的生长。此外，与传统抗生素相比，AMP还具有快速杀灭细菌的动力学
特征，将更适用于动态且快速变化的微生物群落(如生物膜) 咖勝^cn D。但
AMP的广谱抗菌性也容易造成菌群失调等不良后果(Eckert. 2006a)。同时，天然AMP具有生
物效能低、筛选难度高、蛋白水解不稳定等缺点.(Hale and Hancock 2007) (Taguchi. 2009)。特异性祀向抗菌妝(SpecificallyTargeted AntiMicrobial Peptides, STAMPs)是一种可设计并具有特异性的AMP，由靶向定位区域、AMP区域和(或)连接体区域组成。靶向定位区通过增高靶细菌表面AMP浓度(He . 2007),使AMP的特异性、杀伤效力和
动态性能全面提升 (Edceit 2006a, EckeH 2006b) ° SM感受刺激多肽(csp)是
、----------H.-- -------- ----- --*
SM密度感应系统(quorum- sensing, QS)中的菌种间特异性信号分子 ^(Qj 2005)
，具有介导SM进入基因感受态，影响SM的转化突变、遗传性状、粘附聚集等重要作用。Eckert等利用固相合成法将CSP与来自于羊髓的AMP novispirin GlO杂合成C16G2，可特异性破坏SM生物膜而将其杀灭，但不影响人口腔中正常菌群的生长，与单独使用novispirin GlO相比,其杀伤能力提高了 20倍以上,但是表现出了一定的细胞毒性及溶血
性 (Eckert. 2006a, Kaplan ^ 2011)°Meiittin是从蜂毒中提取发现的一 类闻破膜
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活性的抗菌肽，其对SM细菌的杀伤能力明显强于C16G2 (Kafkft 2011)°但是缺乏选择性以及高毒性限制了 melittin的临床应用。由于变形链球菌是厌氧细菌，因而代谢过程中产生大量的乳酸，从而导致其生存的微环境呈酸性。此外，因而我们利用这一特点，设计了一类酸激活的CSP靶向抗菌肽用2，3-二甲基马来酸酐(DMMAn)对抗菌肽melittin中赖氨酸的侧链氨基进行保护,从而使抗菌肽失去阳离子特征而降低活性。当pH低于6. 8时，DMMAn就可以从氨基上脱掉，使抗菌肽melittin恢复活性；将DMMAn保护的melittin通过二硫键与CSP祀向分子相连，以提高变形链球菌表面melittin的数量。这种新型的CSP祀向抗菌肽即可以通过CSP祀向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过DMMAn对氨基的保护而降低了 melittin的毒性。当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。细菌生物膜对多数抗菌剂有较强的抵抗力，其抗性水平约为浮游态细菌的101-103倍(唐子圣.2006;张耀超2009; . 2011)。SM生物膜在红霉素和青霉素浓度为5000倍MIC作用I h时及浓度为1000倍MIC作用3 h时，未能被完全杀死；在洗必泰浓度为500倍MIC作用I h及浓度为100倍MIC作用3 h，也未能被完全杀死(唐子圣.2006)。类似地，Noiri等发现，牙龈卟啉菌单胞生物膜在160倍MIC浓度的甲硝唑中仍能生长，其耐药机制与单个细菌迥然不同(Noiri. 2003)。细菌生物膜耐药性的增强与其结构特点密切相关以生物膜形式存在的细菌，其生长速度显著低于浮游态细菌，常处于静止期，不易被常规的抗菌剂杀灭(Stewart . 2001)。而且,临床常用的抗菌剂如洗必泰、氟制剂等,还具有副作用并易导致细菌耐药、耐氟。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种酸激活CSP靶向抗菌肽，它可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过2，3-二甲基马来酸酐(DMMAn)对氨基的保护而降低了抗菌肽melittin的毒性，当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案
一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3- 二甲基马来酸酐、抗菌肽meIittin、CSP靶向分子反应制成。具体地，所述2，3_ 二甲基马来酸酐的三个分子分别与抗菌肽melittin的三个赖氨酸侧链氨基反应后连接；所述CSP祀向分子通过二硫键连接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巯基上。本发明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽，通过以下步骤制备完成
(1)Psy-CSPci6 的合成
a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA树脂上,通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末；
b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸侧链巯基的活化将O.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将O. 04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V为I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的 Pys- CSPci6 ；
其反应式为
权利要求
1.一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成。
2.根据权I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述2，3-二甲基马来酸酐的三个分子分别与抗菌肽melittin的三个赖氨酸侧链氨基反应后连接。
3.根据权利要求I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，所述CSP靶向分子通过二硫键连接于抗菌肽melittin的N末端半胱氨酸的巯基上。
4.根据权利要求I所述的酸激活CSP靶向抗菌肽，其特征在于，通过以下步骤制备完成 (1)Psy-CSPci6 的合成 a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA树脂上,通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末； b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸侧链巯基的活化将O.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将O. 04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V为I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的 Pys- CSPci6 ； (2)DMMAn-melittin 的合成 a.抗菌肽melittin的固相合成采用Rink-AmideMBHA树脂上,通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin祀向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末； b.DMMAn-melittin 的合成将与 O. 04 mmol melittin 溶于 4ml 含有 IOOmM HEPES 和125mM NaOH的水溶液中，然后IOml含有O. 6 mmol 2，3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应O. 5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin ； (3)CSP靶向抗菌肽的合成将 O. 02 mmol Pys- CSPci6 与 0. 02 mmolDMMAn-melittin 溶于 2 ml 甲醇/ 水中，其 V/V为I: f 1:10，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物一具有酸激活特性的CSP革巴向抗菌肽化合物。
5.权利要求1-3任一项所述酸激活CSP靶向抗菌肽的制备方法，包括以下步骤 (1)Psy-CSPci6 的合成 a.祀向肽CSPa6的固相合成采用Rink-AmideMBHA树脂上,通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的靶向肽CSPa6;利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末； b.靶向肽CSPa6中半胱氨酸侧链巯基的活化将0.4 mmol 二硫二吡啶溶于2ml甲醇溶液中，然后将0.04 mmol Cys-MitP溶于Iml甲醇/水，其V/V为I: f 1:10，并滴加入上述二硫二吡啶的甲醇溶液中，反应10-16 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的 Pys- CSPci6 ； (2)DMMAn-melittin 的合成 a.抗菌肽melittin的固相合成采用Rink-Amide MBHA树脂上,通过经典的Fmoc固相化学合成方法合成N末端含有半胱氨酸的melittin祀向肽；利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末； b. DMMAn-melittin 的合成将与 O. 04 mmol melittin 溶于 4ml 含有 IOOmM HEPES 和125mM NaOH的水溶液中，然后IOml含有O. 6 mmol 2，3-二甲基马来酸酐的甲醇溶液滴加入上述含有melittin的水溶液中，反应O. 5 h，利用C18反向高效液相柱层析纯化，得到DMMAn-melittin ； (3)CSP靶向抗菌肽的合成将 O. 02 mmol Pys- CSPci6 与 O. 02 mmolDMMAn-melittin 溶于 2 ml 甲醇/ 水中，其 V/V为I: f 1:10，反应10-16 h，通过HPLC进行纯化，得到目标产物一具有酸激活特性的CSP革巴向抗菌肽化合物。
6.权利要求1-4任一项所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制备变形链球菌抗菌剂中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的酸激活CSP靶向抗菌肽在制备治疗龋病药物中的应用。
全文摘要
本发明提出了一种酸激活CSP靶向抗菌肽，由2，3-二甲基马来酸酐、抗菌肽melittin、CSP靶向分子反应制成。另外，本发明提出了酸激活CSP靶向抗菌肽的制备方法及两种应用。本发明提出的酸激活CSP靶向抗菌肽可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过2，3-二甲基马来酸酐(DMMAn)对氨基的保护而降低了抗菌肽melittin的毒性，当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。
文档编号A61K47/48GK102827288SQ20121031481
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者周建业, 张伟, 王记增, 林志伟, 陈熙明, 李志杰 申请人:兰州大学