专利名称：一种鹅绒藤提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鹅绒藤提取物，本发明同时涉及该提取物的制备方法及其在治疗炎症相关疾病方面的应用，属生物医药领域。
背景技术：
鹅绒藤(Cynanchum chinense R. Br.)为萝摩科鹅绒藤属植物，生于灌木丛，路边，河畔或田埂上，民间药用其根及新鲜茎的乳汁，根可祛风解毒、健胃止痛，茎乳外敷治疗疣赘，二者具有不同的用途。有文献报道鹅绒藤全草水提物对试验动物具有抗惊厥、中枢抑制作用和镇静催眠等作用，其中含有蛋白酶、黄酮等成分(马艳，周凤琴.民间药鹅绒藤化学成分、药理及临床应用研究概况.中华中医药学刊，2010,28 :289-291.),但总体研究报道较少。发明人在前期研究中首次发现鹅绒藤提取物具有一定的抗炎活性，作为一种可再生利用的植物资源，具有进一步研究和开发利用潜力，因而对其提取物中化学成分和含量进 行研究，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺和质量可控的鹅绒藤提取物。本发明提供的鹅绒藤提取物制备方法包括以下工艺步骤(I)选取鹅绒藤属植物药材地上部分，采用水或乙醇-水混合溶媒进行提取，浓缩为浓缩液，加适量水稀释，过滤，得鹅绒藤提取液；(2)由(I)所得鹅绒藤提取液，采用预处理好的大孔树脂或聚酰胺进行吸附，先用水或0-20%乙醇洗脱，再用40-95%乙醇洗脱，收集40-95%乙醇洗脱液，合并后经浓缩，干燥，即得。所述工艺步骤⑴中鹅绒藤药材选自鹅绒藤属植物(参见苟占平，杨永建，赵汝能.甘肃鹅绒藤属药用植物资源调查.中草药，2001,32:69-71)。所述鹅绒藤药材采用本发明所述分析方法检测，应含有小麦黄素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷，优选鹅绒藤药材还含有山奈酹-3-0-β -D-卩比喃葡萄糖苷、小麦黄素,更优选鹅绒藤(Cynanchum chinense R. Br.)。所述提取溶媒可采用常规的水或乙醇-水混合溶媒提取，其中优选50-80%乙醇混合溶媒提取。所述工艺步骤⑵中，所述吸附剂可选用大孔树脂或聚酰胺，其中优选非极性或弱极性大孔树脂。洗脱时先用水洗或0-20%乙醇洗脱除去杂质，再用40-95%乙醇洗脱，其中优选采用50-80%乙醇进行洗脱。所述鹅绒藤提取物中，主要含有小麦黄素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷，其含量大于30mg/g ;此外还含有小麦黄素、山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少两种成份。本发明同时对所述鹅绒藤提取物的抗炎作用进行了考察。采用二甲苯致小鼠急性耳肿胀模型试验，结果表明鹅绒藤乙醇提取物(500mg/kg)、大孔树脂精制提取物(150mg/kg)、聚酰胺精制提取物(150mg/kg)三种样品灌药给药均具有一定的抗炎作用。因而所述鹅绒藤提取物具有一定抗炎活性，可以作为药物或药物组合物应用于相关抗炎药品中。本发明内容通过大量实验研究和工艺优化分析完成，并对提取物中活性成分进行了分离鉴定，其中化合物小麦黄素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素为首次从鹅绒藤属植物中分离得到，并首次对该属植物中小麦黄素-7-0- β -D-葡萄糖 醛酸苷、山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷、小麦黄素进行了定性定量分析，研究结果具有独创性，并可应用于鹅绒藤药材及其提取物和相关产品的质量控制。以下述具体实施例进行说明。
附图为实施例2中鹅绒藤大孔树脂提取物的液相色谱图(检测波长310nm)。图中，色谱峰1-3依次为I山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷，2小麦黄素-7-0-β -D-葡萄糖
醛酸苷，3小麦黄素。
具体实施例方式本发明所述的鹅绒藤提取物是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。实施例I :鹅绒藤的提取鹅绒藤地上部分于2010年采自新疆自治区石河子市郊(批次CC20100901)，经鉴定为鹅绒藤(Cynanchum chinense R. Br.)地上部分莖叶。取鹅绒藤地上部分粉末3kg,用8倍量70%乙醇溶液回流提取(2hX3次)，提取液合并，减压浓缩为流浸膏提取物A(3L)，备用。经HPLC分析，其中小麦黄素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次为3. 12,0. 061mg/g。实施例2 :鹅绒藤提取物的制备取实施例I中提取物2L，用水6L分散，调pH7_9，过滤，滤液上AB_8大孔树脂柱(1000X 100mm i. d.，柱体积2. 0L/BV)，依次用水和10 %、95 %乙醇(各8L)洗脱，95 %乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，得鹅绒藤提取物B，共106g。经HPLC分析，其中小麦黄素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次为50. 32、I.161mg/g。含量测定采用Agilent 1260 Infinity Series高效液相色谱仪；DAD检测器,检测波长 360nm ;色谱柱为 Cosmosil AR-II-C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流速 ImL · min S 柱温35。。。流动相为O. 6%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(O 12min, 18% B ; 12 15min，18% B — 20% B ;15 30min，20% B)。对照品小麦黄素_7_0-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的回归方程分别为Y = 601. 36Χ+22. 659 (r = O. 9999)、Y =976. 16X+27. 976 (r = O. 9997)，线性范围分别为 I. 188-9. 504 μ g, O. 08712-0. 8712 μ g。鹅绒藤提取物B的HPLC色谱图参见附图。实施例3 :鹅绒藤提取物的制备取实施例I中提取物O. 8L，用水2. 2L分散，调pH7_9，过滤，滤液上聚酰胺柱(600X40mm i. d.，柱体积400mL/BV)，依次用水和20%、95%乙醇(各8L)洗脱，95%乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，得鹅绒藤提取物C，共32g。经HPLC分析，其中小麦黄素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量依次为67. 36、I. 32mg/g。 实施例4 :鹅绒藤提取物中有效成分分离鉴定取实施例I中鹅绒藤提取物B(30g)，经减压硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(50 1-1 1)，氯仿-甲醇(10 1-1 I)系统梯度洗脱，依次获得Fr. I-Fr. 18、Fr. 19-Fr. 30流分。Fr. 6经氯仿重结晶得到十六烧酸化合物I (32mg) ；Fr. 9经甲醇重结晶得到化合物2(32mg) ；Fr. 11中结晶得到化合物3 (80mg) ；Fr. 12重结晶得化合物4 (25mg)；Fr. 15流分经LX2000树脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脱，S^hadex LH-20甲醇洗脱，得到化合物5 (15mg)，化合物6 (12mg) ；Fr. 16通过LX2000树脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脱，50%甲醇洗脱部位，经甲醇重结晶得到化合物7 (30mg) ；Fr. 18流分经LX2000树脂柱甲醇-水(3 7-7 3)梯度洗脱，Sephadex LH-20甲醇洗脱，得到化合物8 (15mg)。Fr. 22-26合并，经LX2000树脂甲醇-水(2 8-7 3)梯度洗脱，得到化合物9 (50mg)。化合物结构鉴定采用NMR、HRESIMS等波谱学技术，和已知物数据对照，鉴定各化合物依次为十六烷酸(1)，水杨酸(2)、β-谷甾醇(3)、β-胡萝下苷(4)、芹菜素(5)、山奈酌· (6)、小麦黄素(7)、山奈酌·-3-0-β-D-卩比喃匍萄糖昔(8)、小麦黄素-7-0-β-D-匍萄糖醛酸苷(9)。其中化合物5、8、9首次从本属植物中分离得到；1、2、5 9为首次从本植物中分离得到。化合物7-9测试数据如下。化合物7:化合物 VIII 黄色针晶(甲醇),1H-Nmr(Dmso^oomHz) δ 2.97(ih, s’5-0H)，7· 31 (2H, s, H_2'，6' )，6· 97 (1H, s’ H_3)，6· 55 (1H, d, J = 2. OHz, H_8)，6· 20 (1H,d, J = 2. 0Hz, H-6) ,3. 88 (6H, s，2X_0CH3)。13C-匪 R (DMSO，100MHz) δ :181. 8(C_4)，164. 2 (C-7)，163. 7 (C_2), 161. 4 (C_9)，157. 4 (C_5)，148. 2 (C_3 '，5 ' )，139. 8 (C_4 ')，120. 4(C-1 ' )，104.3(C-2 '，6 ' )，103. 7 (C—10)，103. 6 (C_3)，98. 9 (C_6)，94. 2 (C_8)，56. 4 (-OCH3) 0以上数据与文献基本一致(吴海峰，宋志军，朱华结，等.藏药红花绿绒蒿的化学成分.天然产物研究与开发，2011，23 :202)，鉴定为小麦黄素。化合物8 :黄色结晶(甲醇)，Molish反应阳性，薄层酸水解检出葡萄糖，IH-匪R(DMS0，400MHz) δ 12. 62(1H, s，5-0Η)，10. 88(1Η，br s，7-0Η)，10. 20(1Η，br s,4' -OH), 8. 03 (2H, d, J = 8. 8Hz, H-2 ;，6' ) ,6. 87 (2H, d, J = 8. 8Hz, H-3 ;，5')，
6.43 (1H, d, J = I. 9Hz, H_8)，6. 20 (1H, d, J = I. 9Hz, H-6)，5. 46 (1H, d, J = 7. 2Hz,H-l" )。13C-NMR(DMS0，100MHz) δ 177. 4 (C-4), 164. 2 (C-7) ,161.1 (C-5), 159. 8 (C-4;)，156. 3 (C-9), 156. 2 (C-2), 133. 2 (C-3), 130. 7 (C-2 ;，6' ),120.4(01' ),115.0(03'，5' )，103. 9(C-10)，100. 9(C-1" )，98. 6 (C_6)，93. 5 (s，C_8)，74. 2 (C_2" ), 76. 4 (C-3;/ )，77. 3 (C-5 " ), 69. 9 (C-4 " )，60.8(C_6")。以上数据与文献基本一致(翁裕馨，刘占厚，陈湘宏.达乌里胡枝子化学成分研究.安徽农业科学，2011，39 :15281)，鉴定为山奈酚-3-0- β -D-吡喃葡萄糖苷。化合物9 :黄色粉末(甲醇)，IH-NMR (DMS0,400ΜΗζ) δ :12. 95 (1H, s，5_0H)，
7.36 (2H, s，H-2'，6' ),7. 04 (1H, s’ H_3)，6. 91 (1H，d, J = 2. IHz, H_8)，6. 49 (1H，t, J=2. IHz, H-6), 5. 25 (1H, d, J = 7. 2Hz, H_l" )，3. 89 (6H, s，2X_0CH3)。13C_NMR(DMS0，100MHz) δ :181. 9(C-4)，169. 9 (C-6 " ),164. I(C-2),162.5 (C-7), 161. I(C-5),156. 8 (C-9), 148. 2 (C-3 '，5 ' )，140.2(C_4 ' )，120.2(C_1 ' ), 105. 4 (C-IO),104. 7 (C-2 ' ,6 ' ), 103. 8 (C-3), 99. 4 (C-6), 99. 3 (C-l " )，95. 0 (C_8)，75. 7 (C_5 ")，75. 2 (C-3 ;/ ),72.8 (C-2 ;/ ),71. 2 (C-4 ;/ )，56. 4 (-OCH3)。以上数据与文献基本一致(Jun-Gang Yin, Cheng-Shan Yuan, Zhong-Jian Jia. A new iridoid and other chemicalconstituents from Pedicularis kansuensis forma albifIora Li. Arch Pharm Res,2007，30 :431-435)，鉴定为小麦黄素_7_0- β -D-葡萄糖醛酸苷。实验例I :鹅绒藤提取物的抗炎作用考察取20_25g小鼠50只，雌雄各半，分为鹅绒藤提取物A组(500mg/kg)、鹅绒藤提取物B组(150mg/kg)、鹅绒藤提取物C组(150mg/kg)、吲哚美辛对照组(20mg/kg)和模型组五组，预灌药一周。最后一次灌药2小时后，用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳，半小时后处死小鼠，用直径6_打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平称重。取下的右耳减 去左耳重量为肿胀度，计算对照组和给药组的均值与标准差，t检验比较组间差异显著性。按下式求出肿胀抑制率肿胀抑制率(％ ) = [I-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]X 100%结果鹅绒藤提取物A组(500mg/kg)、鹅绒藤提取物B组(150mg/kg)、鹅绒藤提取物C组(150mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症有一定的抑制作用，肿胀抑制率依次为17. 6,24. 1,26. 3(% )。
权利要求
1.一种鹅绒藤提取物，特征在于所述鹅绒藤提取物由以下步骤制备获得 (1)选取鹅绒藤属植物药材地上部分，采用水或乙醇-水混合溶媒进行提取，浓缩为浓缩液，加适量水稀释，过滤，得鹅绒藤提取液； (2)由(I)所得鹅绒藤提取液，采用预处理好的大孔树脂或聚酰胺进行吸附，先用水或0-20%乙醇洗脱，再用40-95%乙醇洗脱，收集40-95%乙醇洗脱液，合并后经浓缩，干燥，即得。
2.根据权利要求I的鹅绒藤提取物，特征在于所述鹅绒藤提取物中含有小麦黄素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷中至少一种成份。
3.根据权利要求2的鹅绒藤提取物，特征在于所述鹅绒藤提取物中还含有小麦黄素、山奈酚-3-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少两种成份。
4.根据权利要求2的鹅绒藤提取物，特征在于所述鹅绒藤提取物中小麦黄素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷含量大于30mg/g提取物。
5.根据权利要求I的鹅绒藤提取物，特征在于所述步骤(I)中采用50-80%乙醇进行提取。
6.根据权利要求I的鹅绒藤提取物，特征在于所述步骤(2)中采用大孔树脂进行吸附。
7.根据权利要求I的鹅绒藤提取物，特征在于所述步骤(2)中采用聚酰胺进行吸附。
8.根据权利要求I的化合物，特征在于所述步骤(2)中优选采用50-80%乙醇进行洗脱。
9.根据权利要求I的鹅绒藤提取物及其组合物在药品中的应用，特征在于所述鹅绒藤提取物具有抗炎作用。
全文摘要
本发明公开了一种鹅绒藤提取物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤(1)选取鹅绒藤属植物药材地上部分茎叶，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤；(2)提取液采用大孔树脂或聚酰胺进行吸附，用乙醇-水混合溶媒进行梯度洗脱，收集相应目标产品洗脱部位，浓缩，干燥，即得。所述鹅绒藤提取物中含有小麦黄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，含量大于30mg/g；并含有小麦黄素、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚中至少两种成份。本发明所述植物资源可再生利用，工艺路线经济合理、效率高、能耗低，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。所述鹅绒藤提取物具有抗炎作用，可应用于相关抗炎药品中。
文档编号A61P29/00GK102846689SQ20121038471
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者刘江云, 陈虹, 冯建勇, 杨世林 申请人:苏州世林医药技术发展有限公司