专利名称：一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法
一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法技术领域
本发明属于管状组织工程支架的制备领域，特别涉及一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法。
背景技术：
人体中含有很多管腔状组织，如心血管、外周血管、神经导管、食道、肠道、胆管、尿道和骨等，修复这些组织的缺损经常要用到管状的组织支架。在这些管状组织的病变中，心血管疾病是威胁人类健康最严重的疾病之一，对缺损和严重病变的血管通常需施行移植手术。目前，临床上常用自体血管如大隐、乳内动脉作为移植物。但自体血管来源有限，且自体移植易对人体造成二次损伤。使用异体移植的支架易引起免疫排斥反应。目前比较成熟的方法是应用人工合成的血管假体如膨化聚四氟乙烯(ePTFE)和涤纶(Dacron)作为动脉替代物重建动脉。这些人造血管用于大、中动脉的替代效果令人满意，但是在用于小口径 (<6mm)血管替代时，由于人工血管管壁缺少内皮细胞，小口径血流速度缓慢导致移植早期急性血栓形成，移植后期吻合口内膜增生引起管腔狭窄直至闭塞，通畅率很难达到要求。基于组织工程技术构建的细胞_生物材料复合物,经体外构建后植入体内，与宿主血管组织融合和组织的重塑，恢复血管连续性和血液通畅，被认为是理想的血管替代物。
血管组织工程包括三维支架、种子细胞、必要的生长因子三个部分。其中，血管支架起着支撑细胞生长、引导组织再生、控制组织结构和释放活性因子等作用，是决定组织工程成败的关键因素之一。理想的血管支架应具备以下特点(1)仿生细胞外基质(ECM)的结构和功能；(2)良好的相容性和可控的降解率；(3)具有一定的孔隙结构；(4)具有与天然血管相匹配的力学性能，便于血液流动；(5)有活性生长因子的释放。目前临床上使用的血管支架各具优缺点，如合成的非降解材料不支持内皮细胞的粘附和生长，移植后支架在体内无法被吸收、降解，其构建的血管不是真正意义上的组织工程血管，而自体异体移植的血管由于其来源有限，无法满足需求。
理想的组织血管支架应能在愈合过程中随着支架的降解而重塑，从而形成一条与宿主主动脉具有相同机械性能和生物性能的新血管，除了在结构与功能的仿生外，还要有利于细胞的分化，识别，起到缺损血管的重塑过程。为了仿生天然血管的结构与功能，支架的，结构取决于制备方法。从微观上看，细胞外基质由纤维网状结构组成(其中胶原纤维的直径为50-500nm)，因此以亚微米或纳米纤维制备的细胞支架最大程度仿生人体内ECM的物理结构。制备纳米纤维的结构方法有很多，目前最主要的有静电纺丝和相分离法。用静电纺丝的方法可以形成长纳米纤维。如中国专利(申请号03137309. 7)公开了一种静电纺丝制备组织工程支架材料的方法和装置，这种方法具有材料来源广泛和易于成型的特点，但通常难以控制其孔隙结构，利用相分离方法在制备三维多孔支架方面具有一定的优势。相分离技术是制备聚合物多孔材料的重要方法，其过程是在一定条件下将聚合物溶解在适当的溶剂中，保持溶液温度高于相分离点，高分子链在溶剂中充分舒展；当温度下降到热力学不稳定区或有非溶剂存在时，溶液发生相分离，形成聚合物贫相和富相；在降温条件下，聚3合物富相区再将溶剂以冻干或置换的方式脱除，得到多孔聚合物材料。对于半晶态聚合物如PLLA，通过控制溶剂组合、聚合物浓度、热退火、溶剂交换和冷冻温度等条件可得到纳米纤维多孔支架。
在管状组织的重建过程中，支架必须提供较大的孔径以利用细胞的长入，粒子浙滤是最常用的致孔手段。如Ma课题组(Biomaterials，2010，31:7971-7977)用糖球作为致孔剂制备具有大孔连通的纳米纤维支架用于血管再生，但这种完全连通的大孔结构不仅牺牲了支架的力学强度，也存在血液渗漏的风险。S. Ramakrishna等 (Polymer, 2009，50:4128-4138)采用二氧六环和水为混合溶剂溶解PLLA，通过热致相分离制备了大孔纳米纤维支架，但单纯的PLLA支架脆性较大，难以提供常用管状组织修复过程中必需的韧性和弹性等力学强度。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，该方法操作简单、不需外加致孔剂、可大批量生产、制备成本较低，得到了管状支架具有孔径和孔隙率可调的多孔结构，有利于细胞的长入和新生组织的重建。
本发明的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，包括
(I)将左旋聚乳酸PLLA与其他聚合物于50_70°C溶解于溶剂中，得到均一的聚合物溶液；
(2)将上述聚合物溶液注入到管状模具中，迅速置于_4°C至_196°C的低温下使其发生相分离；然后取出，并退去管状模具外壳，将相分离后的聚合物凝胶与芯部模具一起浸泡于去离子冰水中10-30分钟，再取出芯部模具，并把继续将聚合物凝胶浸泡于去离子冰水中交换溶剂48-96小时,每天换2-5次去离子冰水,得到管状支架；
(3)最后将得到的管状支架冷冻干燥48-120小时，即得到具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
步骤(I)中所述的其他聚合物为聚ε-己内酯(PCL)、聚羟基乙酸(PGA)、 聚-β-羟丁酸(ΡΗΒ)、聚羟基烷基酸酯(ΡΗΑ)、聚癸二酸丙三醇酯(PGS)、聚己内酯-左旋聚乳酸共聚物(PCL-b-PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚氨酯(PU)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、尼龙(Nylon)、聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET)、胶原、明胶、丝蛋白、纤维蛋白原、纤维素、壳聚糖等中的一种。
步骤(I)中所述的左旋聚乳酸与其他聚合物的质量比为6-8:4_2。
步骤(I)中所述的溶剂为水、甲醇、乙醇、己烷、环己烷、叔丁醇、六氟异丙醇、三氟乙醇、1，4-二氧六环、四氢呋喃、N，N-甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷等中的一种或几种。
步骤(I)中所述的聚合物溶液中聚合物的总浓度为O. 02-0. 2g/mL。
步骤(2)中所述的管状模具由一端封闭的圆柱状外壳和带盖的杆状芯部构成，圆柱状外壳和杆状芯部的直径可调，因而制备的管状支架的厚度和内、外径可控。
本发明所得到的多孔纳米纤维管状支架的尺寸范围为内径2-6cm，厚度O.5-5mm。
本发明所述管状支架以PLLA为主体材料，得到的支架同时具有多孔结构和纳米纤维结构。
本发明公开了一种多孔纳米纤维支架制备技术，将一些弹性聚合物或生物相容性较好的聚合物添加到PLLA中，制备了多孔PLLA基复合纳米纤维管状支架，这些成分的加入不仅增加了支架的弹性，也可通过改变材料组成来调节支架的生物相容性和降解性能。由于两种聚合物凝胶化温度和时间的差异，部分低含量的聚合物因相分离而形成微球，经适当的处理即可获得多孔纳米纤维结构，这种多孔结构可为细胞长入提供足够空间，却不会由于孔道完全联通导致血液、尿液等的渗漏，其力学性能和微结构可控。更适合组织工程化管腔结构的构建。
本发明所述管状支架以生物可降解的左旋聚乳酸为主体材料，加入与其不相容的另一种聚合物，控制相分离过程使两种不相容材料形成“海岛”状结构，支架的孔径和孔隙率可根据两种聚合物的比例和相分离条件来调节。
本发明的管状组织工程支架可用于组织工程心血管、外周血管、神经导管、食道、 肠道、胆管、尿道和骨等管状组织的构建。采用热致相分离法制备的多孔纳米纤维管状支架，该方法具有设备要求低、制备过程简单和不需外加致孔剂等特点。制备的管状支架不仅具有类似于人体组织细胞外基质的纳米纤维结构，还具有孔径和孔隙率可调的多孔结构， 有利于细胞的长入和新生组织的重建。在相分离体系中加入具有较好力学强度的不相容聚合物能够提高支架的韧性和弹性，有利于构建管状组织工程化器官和组织。
有益效果
(I)本发明操作简单、不需外加致孔剂、可大批量生产、制备成本较低；
(2)本发明在相分离体系中加入具有较好力学强度的不相容聚合物能够提高支架的韧性和弹性，有利于构建管状组织工程化器官和组织；
(2)本发明制备的管状支架不仅具有类似于人体组织细胞外基质的纳米纤维结构，还具有孔径和孔隙率可调的多孔结构，有利于细胞的长入和新生组织的重建。
图I是制备的多孔纳米纤维管状支架的模具照片；
图2是制备的管状支架的光学照片图3是管状支架的电镜照片，(A)图为管状支架的横截面图，(B)图为局部放大的 SEM 图4是管状支架的红外光谱图，其中a是纯PLLA的红外光谱图，b是PLLA与PCL 比例为70:30的红外光谱图，c是纯PCL的红外光谱图5现实不同混合比例的两种材料制成支架的孔径大小及孔体积变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例I
以质量比PLLA :PCL=70:30，聚合物总浓度为O. 05g/mL条件下制备具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
(I)将PLLA与PCL以70:30比例于55 °C溶解于四氢呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-80°C使其发生相分离过程，过夜；
(3)从低温中取出，并退去模具外壳，把成凝胶状的聚合物与芯部模具一起置于去离子冰水中浸泡30分钟，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去离子冰水中交换溶剂2天， 每天换三次去尚子冰水；
(4)从去离子水中取出管状支架，冷冻干燥，即得到具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
实施例2
以质量比的PLLA PU=70:30,总聚合物浓度为O. lg/mL条件下制备多孔纳米纤维管状支架。
(I)将PLLA与PU以70:30比例于60°C溶解于四氢呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-100°C使其发生相分离过程，过夜；
(3)从低温中取出，并退去模具外壳，把成凝胶状的聚合物与芯部模具一起置于去离子冰水中浸泡30分钟，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去离子冰水中交换溶剂3天， 每天换三次去尚子冰水；
(4)从去离子水中取出管状支架，冷冻干燥，即得到具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
实施例3
以质量比的PLLA PLGA=60:40,总聚合物浓度为O. 15g/mL条件下制备多孔纳米纤维管状支架。
(I)将PLLA与PLGA以60:40的比例于70°C溶解于四氢呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-50°C使其发生相分离过程，过夜；
(3)从低温中取出，并退去模具外壳，把成凝胶状的聚合物与芯部模具一起置于去离子冰水中浸泡30分钟，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去离子冰水中交换溶剂3天， 每天换三次去尚子冰水；
(4)从去离子水中取出管状支架，冷冻干燥，即得到具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
权利要求
1.一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，包括(1)将左旋聚乳酸PLLA与聚合物于50-70°C溶解于溶剂中，得到均一的聚合物溶液；(2)将上述聚合物溶液注入到管状模具中，迅速置于-4°C至-196°C下使其发生相分离；然后取出，并退去管状模具外壳，将相分离后的聚合物凝胶与芯部模具一起浸泡于去离子冰水中10-30分钟，再取出芯部模具，并把继续将聚合物凝胶浸泡于去离子冰水中交换溶剂48-96小时，每天换2-5次去离子冰水，得到管状支架；(3)最后将得到的管状支架冷冻干燥48-120小时，即得到具有多孔结构的纳米纤维管状支架。
2.根据权利要求I所述的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于步骤 (I)中所述的聚合物为聚ε-己内酯、聚羟基乙酸、聚-β-羟丁酸、聚羟基烷基酸酯、聚癸二酸丙三醇酯、聚己内酯-左旋聚乳酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氨酯，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯、胶原、明胶、丝蛋白、纤维蛋白原、纤维素、壳聚糖中的一种。
3.根据权利要求I所述的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于步骤 (O中所述的左旋聚乳酸与聚合物的质量比为6-8:4-2。
4.根据权利要求I所述的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的溶剂为水、甲醇、乙醇、己烷、环己烷、叔丁醇、六氟异丙醇、三氟乙醇、1，4-二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷中的一种或几种。
5.根据权利要求I所述的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于步骤 (O中所述的聚合物溶液中聚合物的总浓度为O. 02-0. 2g/mL。
6.根据权利要求I所述的一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的管状模具由一端封闭的圆柱状外壳和带盖的杆状芯部构成，圆柱状外壳和杆状芯部的直径可调。
全文摘要
本发明涉及一种多孔纳米纤维管状支架的制备方法，包括(1)将左旋聚乳酸PLLA与其他聚合物溶解于溶剂中，得到聚合物溶液；(2)将上述聚合物溶液注入到管状模具中，迅速置于低温下使其发生相分离；然后取出，并退去管状模具外壳，将相分离后的聚合物凝胶与芯部模具一起浸泡于冰水中，再取出芯部模具，并把继续将聚合物凝胶浸泡于去离子冰水中交换溶剂，得到管状支架；(3)最后将得到的管状支架冷冻干燥48-120小时，即得。本发明操作简单、不需外加致孔剂、可大批量生产、制备成本较低；本发明制备的管状支架具有类似于人体组织细胞外基质的纳米纤维结构，还具有孔径和孔隙率可调的多孔结构，有利于细胞的长入和新生组织的重建。
文档编号A61L27/18GK102908208SQ201210384648
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者何创龙, 胡金伟, 程晓, 王伟忠 申请人:东华大学