专利名称：一种保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及组织工程用生长因子载体的构建，尤其涉及一种以磺化壳聚糖为原料，具有保护生长因子活性和缓慢释放生长因子性能的尺寸均一的微球载体的制备方法。
背景技术：
组织工程是一个涉及医学、化学、生物学、材料学等多学科、多领域的研究课题。组织工程的三要素包括支架、细胞和活性因子。生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长、分化等多效应的多肽类物质，对不同种类细胞具有一定的专一性。生物因子是多细胞生物中细胞间交流的基础，是强有力的细胞行为的调节剂，具有调节细胞的增殖、迁移、分化及蛋白表达等功能，在组织的发育、再生与修复过程中具有重要的作用。生长因子虽然是组织工程不可或缺的重要部分，但由于生长因子价格昂贵，活性半衰期短的特点，限制了其应用，不能满足组织工程的要求。因此，如何保护生长因子活性，有效调控生长因子的释放是实现其在组织或器官再生与修复中应用的关键。生长因子载体可以实现生长因子的有效传递，释放后的生长因子通过和细胞膜表面的受体作用，激活胞内信号通路，进而调节细胞的增殖和分化等功能。传统的生长因子载体主要通过乳化作用制备，其中生长因子和有机溶剂的直接接触导致生长因子较低的利用率。生长因子载体包括微球、纳米粒子和胶束等多种类型。由于纳米粒子和胶束的尺寸太小，易被细胞吞噬，而微米级的生长因子载体可以减少细胞的吞噬作用，提高细胞外生长因子的有效浓度，从而实现生长因子的有效传递，保证组织修复与再生过程中所需的生长因子浓度和活性。生长因子载体的尺寸均一性可以使生长因子均匀分布，避免局部生长因子过量的负作用。因此，粒径尺寸适中且均一的载体可以保证生长因子的活性浓度和均匀分布。壳聚糖是一种带有多氨基的多糖类物质，其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖类似，具有良好的生物相容性且来源广泛、成本低廉。磺化壳聚糖是一类带有磺酸基团的壳聚糖衍生物。研究表明，通过磺化壳聚糖上带负电的磺酸基团和生长因子上的带正电的赖氨酸残基或精氨酸残基的特异性相互作用，可以有效保持生长因子的构象，从而延长生长因子的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种以具有良好生物相容性的磺化壳聚糖为原料，简单高效地制备具有生长因子活性保护性能的磺化壳聚糖微球的方法，为组织或器官的再生修复过程中生长因子的活性保护和可控传递提供合适的载体。本发明的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤
(O以体积百分比浓度1°/Γ8%的司班-80或者司班-85为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在5 15 kPa的压力下将质量体积百分浓度为O. 5°/Γ6%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体
3石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/75 1/15 ；
(2)加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 0259Γ0. 05%的醛类化合物的溶液，在20 °C 60 °C下交联反应I 1Γ24 h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，水洗，冷冻冻干，得到保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。本发明中，所述的磺化壳聚糖是指脱乙酰度在50%以上、在3、6位引入磺酸基团的壳聚糖。所述的醛类化合物可以是丁二醛、戊二醛或多聚甲醛。本发明中，优选司班-80或者司班-85的体积百分比浓度为3°/Γ5%。本发明步骤(2)优选交联反应的温度为25 0C 37 °C，反应时间为4 tTlO h。本发明中，所述的生长因子可以是转化生长因子(TGF-β )、骨形成蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子或内皮细胞生长因子。本发明的优点
本发明以磺化壳聚糖为原料，通过膜乳化的方法制备磺化壳聚糖微球，对微球进行化学交联，得到具有保护生长因子活性性能的磺化壳聚糖微球。该方法避免了生长因子和有机溶剂的直接接触，提高了生长因子的有效利用率。该方法采用的磺化壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性，来源广泛，制备简单，价格低廉。采用的膜乳化方法制备的微球尺寸均一，大小可调，可重复性高，产品可控，可批量生产。本发明制备的磺化壳聚糖微球适用于成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子等多种生长因子活性保护和缓释，在皮肤、软骨、骨、血管、神经和肌腱等组织或器官的再生与修复中具有广阔的应用前景。
图I为磺化壳聚糖微球的扫描电镜图2为磺化壳聚糖微球的粒径分布图3为磺化壳聚糖微球的细胞毒性；
图4为吸附有TGF-β I的磺化壳聚糖微球的扫描电镜图5为磺化壳聚糖微球吸附TGF-β I前后表面电势变化图6为磺化壳聚糖微球吸附TGF-β I后的释放曲线；
图7为磺化壳聚糖微球吸附TGF-β I后，不同储存时间对TGF-β I活性的影响；
图8为胶原II的基因相对表达量；
图9为聚蛋白聚糖的基因相对表达量；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做详细的说明
实施例I:
以体积百分比浓度4%的司班-80为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在10 kPa的压力下将质量体积百分浓度为I. 5%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/30。加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 0375%的戊二醛溶液，在37 °C下交联反应4 h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，除去未反应的戊二醛的醛基，水洗，冷冻冻干，得到可以保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。磺化壳聚糖微球的形貌如图1，磺化壳聚糖微球的粒径分布如图2。将不同量的磺化壳聚糖微球(0、1、2、5、10 μ g)加入到细胞种植密度为I X IO4细胞/孔的96孔板中，分别在1、2、3、5和7天时统计细胞活性。考察磺化壳聚糖微球的细胞毒性(图3)，结果证明，磺化壳聚糖微球的细胞毒性较小。实施例2:
以体积百分比浓度1%的司班-85为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在5 kPa的压力下将质量体积百分浓度为1%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/75。加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 025%的多聚甲醛溶液，在37 0C下交联反应I h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，除去未反应的戊二醛的醛基，水洗，冷冻冻干，得到可以保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。将2 μ g磺化壳聚糖微球加入到100 ng/ml转化生长因子(TGF-β I)溶液中，37°c下震荡吸附O. 5 h，静置30 min，既得吸附TGF-βΙ的磺化壳聚糖微球。图4为吸附TGF-β I的磺化壳聚糖微球的形貌。图5为磺化壳聚糖微球吸附TGF-β I前后的表面电势。实施例3
以体积百分比浓度8%的司班-85为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在15 kPa的压力下·将质量体积百分浓度为3%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/15。 加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 05%的丁二醛溶液，在25°C下交联反应24 h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，水洗，冷冻冻干，得到保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。将2 μ g吸附TGF- β I的磺化壳聚糖微球加入666. 7 ng/ml的TGF- β I溶液，震荡吸附30 min，静置30 min，6000 rpm离心，弃上清液，加入120 μ I的PBS (O. 1% BSA)溶液，在1、2、3、5、7、10、14和16天时，离心收集上清液，再加入120 μ I的PBS (O. 1%BSA)溶液，待样品完全收集后，Elisa试剂盒检测上清液中TGF-β I的浓度，绘制TGF-β I的释放曲线，如图6所示，由图可见，磺化壳聚糖微球可以在一定程度上避免暴释，具有缓慢释放TGF-β I的作用。将2 μ g吸附TGF- β I的磺化壳聚糖微球加入666. 7 ng/ml的TGF- β I溶液，震荡吸附30 min，静置30 min, 6000 rpm离心，弃上清液，加入120 μ I的PBS (O. 1%BSA)溶液，分别在1、3、5、7、10和14天时，离心弃上清液，再加入120 μ I的PBS (O. 1%BSA)溶液，震荡释放4 h，离心取上清液，Elisa试剂盒检测TGF- β I的浓度，得到TGF- β I在磺化壳聚糖微球内的储存时间对TGF- β I活性的影响，如图7所示。由图可见，磺化壳聚糖微球具有延长生长因子的半衰期和保护生长因子的活性的作用。实施例4
以体积百分比浓度4%的司班-80为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在10 kPa的压力下将质量体积百分浓度为I. 5%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/50。加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 0375%的戊二醛溶液，在37 °C下交联反应12 h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，水洗，冷冻冻干，得到保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。将6 μ g的磺化壳聚糖微球(SCMs)，5 ng/ml的TGF- β I和吸附等量TGF- β I的6 μ g磺化壳聚糖微球(TGF-β 1/SCMs)分别加入到细胞密度为3 X IO4细胞/孔的12孔板中，设置空白对照组(Blank)，培养14天后，检测细胞中分泌的II型胶原(图8)和聚集蛋白聚糖(图9)的基因相对表达量，证明磺化壳聚糖微球具有保护生长因子活性的功能。·
权利要求
1.一种保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (O以体积百分比浓度1°/Γ8%的司班-80或者司班-85为乳化剂，采用外压式膜乳化器，在5 15 kPa的压力下将质量体积百分浓度为O. 5°/Γ6%的磺化壳聚糖水溶液分散到液体石蜡中，磺化壳聚糖水溶液和液体石蜡的体积比为1/75 1/15 ； (2)加入与磺化壳聚糖水溶液等体积的体积百分比浓度为O. 0259Γ0. 05%的醛类化合物的溶液，在20 °C 60 °C下交联反应I 1Γ24 h后，依次用石油醚、异丙醇和水洗涤，再加入过量的硼氢化钠溶液，水洗，冷冻冻干，得到保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。
2.根据权利要求I所述的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于所述的磺化壳聚糖是脱乙酰度在50%以上、在3、6位引入磺酸基团的壳聚糖。
3.根据权利要求I所述的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于所述的醛类化合物是丁二醛、戊二醛或多聚甲醛。
4.根据权利要求I所述的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于司班-80或者司班-85的体积百分比浓度为3°/Γ5%。
5.根据权利要求I所述的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于步骤(2)交联反应的温度为25 0C 37 °C，反应时间为4 tTlO h。
6.根据权利要求I所述的保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法，其特征在于所述的生长因子是转化生长因子、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子或内皮细胞生长因子。
全文摘要
本发明公开了一种保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球的制备方法。该方法以磺化壳聚糖为原料，通过膜乳化的方法制备磺化壳聚糖微球，进一步经过化学交联，得到保护生长因子活性的磺化壳聚糖微球。本发明制备的磺化壳聚糖微球可以保护生长因子的活性，延长生长因子的活性半衰期，且对生长因子具有一定的缓释作用。本发明制备的磺化壳聚糖微球生物相容性好、尺寸稳定、降解速率可控、重复性好，可用于成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子等多种生长因子活性保护和缓释，在皮肤、软骨、骨、血管、神经和肌腱等组织或器官的再生与修复中具有广阔的应用前景。
文档编号A61L27/54GK102921039SQ201210416189
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者马列, 李菲菲, 李博, 高长有 申请人:浙江大学