专利名称：一种嵌合病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种嵌合病毒，特别涉及一种嵌合了登革病毒保护性抗原的乙脑病毒感染性克隆。
背景技术：
登革热是被WHO喻为危害最为严重的被忽视的热带和亚热带传染病之一。据WHO统计，自1955年发现该病以来，WHO报告的登革病例增长了约30倍。目前，全球有近一半人口(35亿)生活在登革热的流行区域，每年发病例大约为5000万，但是目前全球还没有疫
苗可供使用。登革疫苗研发的关键难点是登革病毒按血清型分为四种，即登革I型、登革2型、登革3型、登革4型，并在流行区域交替出现。四个血清型之间虽然有交叉反应，但没有交叉保护或交叉保护很弱，持续时间很短，仅有数月。当感染某种血清型的登革病毒后，一般仅表现症状较弱的临床症状或无症状，如再被另一种血清型登革病毒感染，会出现抗体依赖的病理增强作用，表现为潜伏期短，临床症状明显加重，可能出现严重的出血、休克或死亡。因此必须研发能同时保护4个血清型登革 病毒的四价登革疫苗。由于4个血清型登革病毒生长特性差别大、免疫应答能力各异，要维持4个型登革疫苗之间一定的免疫反应水平的平衡具有一定的技术难度。因此，迄今没有安全有效疫苗上市。申请号:200910085231.6，发明名称:乙脑/登革嵌合病毒及其应用的专利申请是利用乙脑减毒疫苗株SA14-14-2为基因骨架，将登革2型病毒NGC株抗原基因prM_E替换乙脑疫苗株相应基因区域构建而成。由于该专利产品仅能在蚊子细胞C6/36上繁殖，该细胞不能用于人用疫苗的生产，且仅为乙脑/登革2型一种嵌合病毒，无法进行疫苗生产，存在很大缺陷。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的乙脑病毒感染性克隆，以该乙脑病毒感染性克隆为骨架的登革嵌合病毒，以及登革疫苗和新的细菌人工染色体。本发明乙脑病毒感染性克隆，其是包含乙脑病毒减毒株SA14-14-2基因组全长cDNA的重组载体。其中，所述重组载体是重组pACNR质粒或者重组细菌人工染色体，细菌人工染色体的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。其中，所述全长cDNA的5’端具有原核启动子。所述启动子为SP6。所述全长cDNA的3’端的转录终止位点为限制性内切酶酶切位点。所述限制性内切酶酶切位点为XhoI或Sail。优选地，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示。本发明嵌合病毒，它由前述乙脑病毒感染性克隆构建而成，其中prM-E基因为登革病毒prM-E基因。
其中，所述登革病毒是登革病毒1、2、3或4型。其中，所述登革病毒I型为登革病毒ThD0008_81株；所述登革病毒2型为登革病毒PU0-218株；所述登革病毒3型为登革病毒PaH881-88株；所述登革病毒4型为登革病毒814669 株。其中，所述登革病毒prM-E基因的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.4 7所示。所述嵌合病毒的核苷酸序列如SEQ ID N0.8 11任意一项所示。前述嵌合病毒在制备登革热疫苗中的用途。本发明还提供了一种登革热疫苗，它是由前述的嵌合病毒制备而成。本发明还提供给了一种核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的细菌人工染色体。本发明利用乙脑减毒疫苗株SA14-14-2和本发明细菌人工染色体，成功地构建了乙脑病毒感染性克隆，并以该感染性克隆为基因骨架，成功构建了含有登革I型、登革2型、登革3型或者登革4型病毒抗原基因prM-E的乙脑/登革嵌合病毒，这些嵌合病毒能在多种人用疫苗生产用细胞上生长繁殖，并且生长特性类似，可以用于四个血清型登革疫苗的生产，免疫原性强，产生的抗体的滴度高，具有良好的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本 发明的范围。
图1BAC载体改造(BAC53)后Hind III &Kpn I双酶切验证图，泳道1、2、3、4为挑选的4个克隆，M为DNA分子量标准DL15000)；图2JEV 5'半分子质粒PJEV5'构建的酶切鉴定结果，其中第I泳道是DNAmarker (DL15000);第2泳道是质粒载体pACNR;第3泳道是将Fl片段插入到载体pACNR后的pACNR-Fl克隆；第4泳道是将Fl片段和F3片段插入到载体pACNR后的pACNR_F13;第5泳道是将F1、F2和F3片段插入到载体pACNR后的5'半分子质粒pJEV5';第6泳道是对5'半分子质粒PJEV5'用限制内切酶AscI和KasI进行酶切验证的结果，第7泳道是对
半分子质粒PJEV5'用限制内切酶BglII和KasI进行酶切验证的结果，第8泳道是对半分子质粒PJEV5'用限制内切酶BglII和BspEI进行酶切验证的结果，第9泳道是对半分子质粒PJEV5'用限制内切酶AscI和Xhol进行酶切验证的结果，第10泳道是DNAmarker(DL2000)；图3pJFC全长质粒结构示意图，红色的箭头表示人为加入的启动子序列,AscI酶切位点为人为加入用于克隆构建，蓝色部分表示乙脑减毒疫苗株SA14-14-2全长cDNA ；图4pJFC全长质粒酶切鉴定结果，其中泳道I为DNA marker DL15000 ;泳道2为PJFC全长质粒；泳道3为pJFC经HindIII酶切的电泳图谱；泳道4为pJFC经BglII酶切的电泳图谱；泳道5为DNA marker DL2000 ；图5BAC53-JFC全长质粒酶切鉴定结果，其中泳道I为BAC53-JFC经NotI和XhoI酶切的电泳图谱；泳道 2 为 DNA marker DL2000 ；M 为 DNA markerDL15000 ；
图6RT-PCR 检测 rJEV 的电泳结果。泳道 I 为 DNAmarker ( λ DNA/HindlII)，泳道 2为DNA marker (DL2000)，泳道3为PCR扩增F123片段，泳道4为PCR扩增F45片段，泳道5为PCR扩增F67片段泳道6为PCR扩增F89片段，泳道7为PCR扩增FlO片段，泳道8为PCR扩增Fll片段；图7间接免疫荧光检测rJEV结果。其中A、B分别是减毒株JEV感染细胞后用JEVE单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；C、D分别是恢复病毒rJEV感染细胞后用JEV E单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；E、F分别是未感染的细胞对照用JEVE单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；图8r JEV与乙脑疫苗株JEV的蚀斑形态比较；图9乙脑/登革I型嵌合的5’半分子克隆pJDl-5’质粒电泳图；图10乙脑/登革 I型嵌合的5’半分子克隆pJDl-5’质粒用NotI和BglII双酶切的电泳图；图11乙脑/登革I型嵌合全长克隆的质粒pJDIFC电泳图；图12乙脑/登革I型嵌合全长克隆的质粒pJDIFC用NotI和XhoI双酶切的电泳图；图13乙脑/登革I型嵌合全长克隆的质粒PJDlFC分别用BamHI和XhoI单酶切的电泳图；图14乙脑/登革I型嵌合全长克隆的质粒PJDlFC体外转录产物的电泳图；图15乙脑/登革I型嵌合全长克隆的质粒PJDlFC体外转录产物转染细胞BHK21后的细胞病变，左边图为未转染的细胞对照，右边为转染后的细胞病变；图16嵌合病毒JDl在原代地鼠肾细胞上传代后的病变结果，左边为未感染的细胞对照，右边为感染后的细胞病变；图17嵌合病毒JDl的RT-PCR检定的电泳图，扩增片段1、2、3都和预期一致；图18乙脑/登革I型嵌合病毒JDl的蚀斑检测结果；图19乙脑/登革I型嵌合病毒JDl中登革病毒I型E蛋白表达Westernblot检测结果；图20乙脑/登革I型嵌合病毒JDl在原代地鼠肾细胞PHK上的生长特性检测结果;图21乙脑/登革I型嵌合病毒JDl的免疫原性检测结果；图22乙脑/登革2型嵌合全长克隆？邛2 (:酶切鉴定。1为0應111&46^01^15000);2为PJD2FC质粒；3为pJD2FC质粒HindIII酶切图谱；4为pJD2FC质粒BglII酶切图谱；5为PJD2FC质粒双酶切图谱(Ascl+Xhol) ;6为pJD2FC质粒双酶切图谱(BspEI+Xhol) ; 7为DNA marker(DL2000)；图23乙脑/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠肾细胞上的细胞病变，左边为未感染对照细胞，右边为JD2感染PHK细胞后的细胞病变；图24RT-PCR检测嵌合病毒JD2的电泳图。I为DNA marker (DL15000) ; 2为PCR扩增片段F123; 3为PCR扩增片段F45; 4为PCR扩增片段F67; 5为PCR扩增片段F89; 6为PCR扩增片段FlO; 7为PCR扩增片段Fl I ；图25间接免疫荧光检测乙脑/登革2型嵌合病毒JD2的实验结果。其中A、B、C是登革2型病毒感染细胞后分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；D、E、F是嵌合病毒JD2分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；G、H、I是乙脑恢复病毒rJEV分别用登革2型单克隆抗体、JEV E单克隆抗体和JEVNSl单克隆抗体检测的结果；J、K、L是未感染病毒的细胞分别用登革2型单克隆抗体、JEV的E单克隆抗体和JEV NSl单克隆抗体检测的结果；图26乙脑/登革2型嵌合病毒JD2蚀斑形态及大小；图27乙脑/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠肾细胞上的生长曲线；图28乙脑/登革2型嵌合病毒JD2的免疫原性检测结果；图29有8个碱基缺失的乙脑/登革3型嵌合5 ’半分子pJD3-5 ’双酶切(Kas I /Bgl II )鉴定电泳图；图30融合PCR扩增1-3446片段，消除缺失的8个碱基；图31乙脑/登革3型嵌合5’半分子BAC53JD3-5’双酶切鉴定电泳图，泳道I为BamH I单酶切，泳道2为Asc I /BamH I双酶切；图32用于构建含有SalI酶切位点的JEV 3’半分子pJEV_3’(Sal I )的JEV-Fll片段PCR扩增电泳
图33含SalI酶切位点的JEV3’半分子pJEV3’ (Sal I)酶切鉴定电泳图，泳道I是Xho I /Xba I双酶切，泳道2为Sall/Xbal双酶切；图34乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53JD3FC质粒用HindIII限制内切酶进行酶切鉴定的电泳图，泳道I为PJD3质粒，Ml为分子量标准DL 15，000, M2为分子量标准DL2, 000 ；图35乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53JD3FC质粒用XhoI限制内切酶进行酶切鉴定的电泳图，泳道I为PJD3质粒，M为分子量标准DL15，000 ；图36乙脑/登革3型嵌合全长克隆BAC53-JD3FC体外转录RNA电泳图，I为体外转录RNA，Ml为分子量标准DL15，000, M2为分子量标准DL2，000 ；图37PHK细胞的病变情况，与对照细胞相比(左)，感染了乙脑/登革3型嵌合病毒的细胞(右)出现明显CPE ；图38乙脑/登革3型嵌合病毒采用登革f登革4型特异检测引物的RT-PCR鉴定结果，只有登革3型检测引物扩增出长度为615bp的片段；图39乙脑/登革3型嵌合病毒的蚀斑检测结果，根据蚀斑计数得到的病毒滴度为5.931gPFU/ml ；图40乙脑/登革3型嵌合病毒生长曲线，根据结果MOI为0.001为最佳感染剂量;图41乙脑/登革3型嵌合病毒的Western blot鉴定。结果显示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相应位置可观察到清晰条带，乙脑病毒未见条带；图42乙脑/登革3型嵌合病毒JD3的免疫原性测定结果；图43乙脑/登革4型5’半分子克隆pJD4-5’质粒的电泳图谱。pJD4_5’half 质粒大小为6.3kb ；图44乙脑/登革4型5’半分子克隆pJD4_5’质粒的酶切鉴定图谱。pJD4_5’质粒经KasI和BglII双酶切为4.1kb和2.2kb片段；
图45乙脑/登革4型全长克隆pJD4FC质粒的电泳图谱。PJD4FC质粒大小为
13.6kb ；图46乙脑/登革4型全长克隆PJD4FC质粒的酶切鉴定图谱。pJD4FC质粒经BspEI和MluI双酶切为8.9kb和4.7kb片段；图47pJD4FC体外转录产物的电泳图谱；图48BHK21细胞的病变情况，与对照细胞相比(左)，转染了 PJD4FC体外转录物的细胞(右)出现明显CPE ；图49PHK细胞的病变情况，与对照细胞相比(左)，感染了乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的细胞(右)出现明显CPE ；图50乙脑/登革4型嵌合病毒的RT-PCR鉴定结果，采用4对引物分别扩增出长度为 2078bp、2155bp、820bp 和 1608bp 的片段；图51乙脑/登革4型嵌 合病毒的蚀斑检测结果，根据蚀斑计数得到的病毒滴度为5.991gPFU/ml ；图52乙脑/登革嵌合病毒在PHK细胞中的生长曲线；图53乙脑/登革嵌合病毒的Western blot鉴定。结果显示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相应位置可观察到清晰条带，乙脑病毒未见条带；图54乙脑/登革4型嵌合病毒JD4的免疫原性检测结果。具体实施实例实施例1:含JEV疫苗株SA14-14-2全长感染性全长cDNA克隆的构建、鉴定及重组病毒的恢复一、载体的改造(I)低拷贝质粒pACNR的改造分别溶解引物01igo-l(5’ -CGCGCCATTAGGCGCCTTATAGATCTAATGTCCGGATTATGGATCCTGATTGATCATTATTCTAGAATTAC-3’，下划线处依次为 Kas1、BglI1、BspE1、BamH1、Bell、XbaI识别位点，人工合成)和 01igo-2(5’ -TCGAGTAATTCTAGAATAATGATCAATCAGGATCCATAATCCGGACATTAGATCTATAAGGCGCCTAATGG-3’ ,与Oligo-Ι形成互补双链后，5’和3’端分别形成Ascl和Xhol酶切后粘端，人工合成)于100 μ I灭菌双蒸水中，各取10 μ I混合，加热到100°C后自然冷却，取2 μ I与用AscI和Xhol双酶切的pACNR于4°C连接过夜，转化感受态细胞T0P10(天根生化科技(北京)有限公司)，挑取氨苄青霉素抗性克隆抽提质粒做测序鉴定(上海英潍捷基生物技术有限公司)。测序结果表明:酶切位点被植入质粒的多克隆区，得到多克隆区位点经改造的pACNR质粒。(2) BAC53载体的改造首先以载体pBAC53e3.6序列为模板设计如下三对引物:BAC53F1:5-GAAGCTTGGATCCGCATGCGTCGACCTCGAGCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3 (划线部分为加入的部分多克隆酶切位点，依次为Hind III，BamH I，Bsiw I，Sal I和Xho I )BAC53R1:5-TTGGTACCTCTAGAACGCGTGGCTTCGCCCTGTCGCTCG-3 (划线部分为限制内切酶酶切位点，Kpn I和Mlu I，其中MluI为引入的酶切位点)BAC53F2:5~GGACGCGTTGAGCGAGGAAGCACCAGGGAAC~3 (划线部分为人为加入的限制内切酶酶切位点Mlu I)BAC53R2:5~TGAATATGAAGATCTGGTACCCATCCGTGA~3 (划线部分为限制内切酶酶切位点 Kpn I)BAC53F3:5~GGACGCGTCCTCAATGTATCACGGATGGGTACCAGATCT~3 (划线部分为限制内切酶酶切位点，Mlu I和Kpn I，其中其中MluI为引入的酶切位点)BAC53R3:
5-GGAAGCTTGGCGCCGGCGCGCCGCTAGCGCGGCCGCAGCGACACACTTGCATCGGATGC-3 (划线部分为加入的部分多克隆酶切位点，依次为Hind III，Kas I , Asc I和Not I )取2μ I pBAC53e3.6 质粒 DNA 为模板，分别用引物 BAC53F1 和 BAC53R1、BAC53F2 和BAC53R2、BAC53F3和BAC53R3配对扩增相应的PCR片段，分别命名为BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3。所用DNA聚合酶为美国NEB公司的PhusioiV超保真DNA聚合酶，扩增条件为:980C 2min 预变性；98°C 10sec,58°C 15sec,72°C 1.5min,30 循环；72°C IOmin0 扩增的 DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA进行加A反应:10 X LA buffer I μ I, dNTPl μ I, DNA7.5 μ 1，LA 0.5 μ I, 72。。30min.反应结束，直接与PR0MEGA公司的pGEM-T easy载体进行连接反应。2XRapid ligation buffer 5 μ I, pGEM-T easyl μ I,加 A 的 PCR 产物 3 μ 1，T4DNA ligase I μ 1，4°C连接过夜。连接产物转化感受态细胞T0P10，铺于含有100ug/ml的氨苄青霉素LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行测序鉴定。将测序正确的上述三个片段的克隆分别用限制内切酶HindIII和Mlul、MluI和 Kpnl、KpnI 和 HindIII 酶切消化，回收片段 BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3, T4DNAIigasel μ I, 4°C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH10B，铺于含有25ug/ml氯霉素的LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行测序鉴定，命名为BAC53，经测序，其序列如SEQ ID N0.1所示。用限制内切酶HindIII和Kpn I进行酶切验证，如图1所示，酶切图谱和理论一致。二、JEV减毒株SA14-14-2病毒cDNA的制备(I) JEV减毒株SA14-14-2病毒RNA的抽提JEV疫苗病毒(SA14-14-2株)由成都生物制品研究所有限责任公司生产，按说明书复溶，取400 μ I病毒液用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒(Highpure viral RNA kit)进行RNA的抽提(按说明书进行)，RNA保存于-80°C备用。(2 )病毒cDNA的逆转录将提取的病毒RNA (分别取11 μ I)分别用两条引物RR5 (5’ -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3’)和 RRl3 (5’ -AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3’)逆转录病毒 cDNA,所用试剂盒为 Invitrogen 公司 SuperS criptTMIII Reverse Transcriptase,引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成,方法参照试剂盒说明书进行。(3)病毒cDNA片段的PCR扩增及测序取病毒cDNA 2 μ I为模板，分别引物Fl和RU F2和R3、F4和R4、F5和R6、F7和R8、F9和R10、F11和Rll配对扩增相应的cDNA片段(引物信息见表1)，所用DNA聚合酶为TaKaRa公司的PrimeSTAR，用降落PCR(Touch-down PCR)进行扩增，扩增条件为:98°C2min ；98 °C IOsec, 58.5 O — 53.5 °C IOsec 72 °C kb/min, 10 循环；98 °C IOsec 53.5 °C IOsec,720C kb/min, 20循环；72°C IOmin0扩增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA进行加A反应:10XLAbufferl μ 1，dNTP I μ I, DNA 7.5 μ I, LA 0.5 μ I, 72°C 30min.反应结束，直接与 TaKaRa 公司的 T 载体 pMD19-T 进行连接反应。2 X ligation buffer 5 μ 1，pMD19_Tl μ 1，加A的PCR产物3 μ 1，ligasely 1，4°C连接过夜。连接产物铺于含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板，次日，挑取无色菌落增菌培养，抽提质粒进行酶切和测序鉴定。表I克隆所用引物
权利要求
1.一种乙脑病毒感染性克隆，其特征在于:它是包含乙脑病毒减毒株SA14-14-2基因组全长cDNA的重组载体。
2.根据权利要求1所述的病毒感染性克隆，其特征在于:所述重组载体是重组pACNR质粒或者重组细菌人工染色体，细菌人工染色体的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根据权利要求2所述的病毒感染性克隆，其特征在于:所述全长cDNA的5’端具有原核启动子。
4.根据权利要求3所述的病毒感染性克隆，其特征在于:所述启动子为SP6。
5.根据权利要求2所述的病毒感染性克隆，其特征在于:所述全长cDNA的3’端的转录终止位点为限制性内切酶酶切位点。
6.根据权利要求5所述的病毒感染性克隆，其特征在于:所述限制性内切酶酶切位点为 XhoI 或 Sail。
7.根据权利要求Γ6任意一项所述的病毒感染性克隆，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 或者 SEQ ID N0.3 所示。
8.一种嵌合病毒，其特征在于:它由权利要求Γ7任意一项所述乙脑病毒感染性克隆构建而成，其中prM-Ε基因为登革病毒prM-E基因。
9.根据权利要求8所述的嵌合病毒，其特征在于:所述登革病毒prM-E基因是登革病毒1、2、3或4型的prM-E基因。
10.根据权利要求9所述的嵌合病毒，其特征在于:所述登革病毒I型为登革病毒ThD0008-81株；所述登革病毒2型为登革病毒PU0-218株；所述登革病毒3型为登革病毒PaH881-88株；所述登革病毒4型为登革病毒814669株。
11.根据权利要求9所述的嵌合病毒，其特征在于:所述登革病毒prM-E基因的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.4 7所示。
12.根据权利要求8 11任意一项所述的嵌合病毒,其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0.8 11任意一项所示。
13.权利要求8 12任意一项权利要求所述的嵌合病毒在制备登革热疫苗中的用途。
14.一种登革热疫苗， 其特征在于:它是由权利要求8 12任意一项权利要求所述的嵌合病毒制备而成。
15.核苷酸序列如SEQID N0.1所示的细菌人工染色体。
全文摘要
本发明公开了一种乙脑病毒感染性克隆，它是包含乙脑病毒减毒株SA14-14-2基因组全长cDNA的重组载体；本发明还公开了一种嵌合病毒，以及该嵌合病毒的用途；以及一种SEQ ID NO.1所示的细菌人工染色体。本发明嵌合病毒能在多种人用疫苗生产用细胞上生长繁殖，并且生长特性类似，可以用于四个血清型登革疫苗的生产，并且，免疫原性强，产生的抗体滴度高，具有良好的应用前景，有较强的工业应用价值。
文档编号A61P31/14GK103205460SQ20121042074
公开日2013年7月17日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者李玉华, 吴永林, 杨会强, 李竹石, 杨健, 林华, 赵宇, 俞永新, 董关木 申请人:成都生物制品研究所有限责任公司, 中国食品药品检定研究院