专利名称：负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
在癌症化疗中面临的一个主要问题是化疗药物缺乏对肿瘤细胞或组织的选择性或靶向性，这样药物容易对正常的细胞和组织造成损害。阿霉素(doxorubicin，D0X)属蒽环类抗肿瘤药物，具有抗瘤谱广、抗瘤活性强的特点，在临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤。但是阿霉素的半衰期短，对正常细胞和组织，特别是心脏、神经、骨髓产生严重毒副作用，从而限制了其在临床上的使用[Minotti, G. , et al. , Pharmacological Reviews,2004. 56: p. 185-229.]，因此，肿瘤靶向输送阿霉素在治疗中是必要的。叶酸由于分子量小，免疫原性低，易于修饰，稳定性好，与叶酸受体的结合能力强等优点[Leamon，C. P.，et al. , Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56: p. 1127 - 1141.],因而被广泛地修饰在负载抗肿瘤药物纳米粒子的表面，使其具有肿瘤主动靶向的功能。通过肿瘤表面过度表达的叶酸受体与叶酸的识别、结合和所调节的内吞作用，可以降低抗肿瘤药物对正常组织的伤害，提高药物的抗肿瘤效果[Lu, Y.，et al. , Journal of Controlled Release,2003. 91: p. 17 - 29. ; Lu, Y.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews, 2004. 56:p. 1161-1176.]。由白蛋白制备的纳米粒子，因具有良好的生物相容性、生物降解性和理想的药代动力学而被广泛地研究作为抗癌药物的载体。目前已经有一些关于白蛋白和阿霉素纳米粒子的专利公开和文章发表。在有关的专利中，有的是通过超声雾化方法制备的白蛋白纳米粒子，具有被巨噬细胞吞噬而到达肝和脾的特点[中国专利申请号200910066561];有的是通过水包油或者油包水的方法制备白蛋白_阿霉素纳米粒子[中国专利申请号02114356.0];有的是通过共价键连接阿霉素到白蛋白上[中国专利申请号200680034375.3];也有的是通过超声波、微流化以及高压均质技术将白蛋白结合到阿霉素脂质囊泡上[中国专利申请号200810147342. 0]，或者将白蛋白水溶液和阿霉素有机溶液进行乳化制备的[200810147344. X];另外，还有利用白蛋白和小分子糖一半乳糖复合物制备的阿霉素纳米粒子[中国专利申请号200410046650. 6,200410046676. 0，200680034375. 3]。到目前为止，我们还没有发现表面接有叶酸同时负载阿霉素的白蛋白纳米粒子的报道。在载阿霉素的纳米粒子表面接有葡聚糖可以使纳米粒子避免被巨噬细胞吞噬而成功地输送到革巴向病灶[Liu, Z. G. , et al. , Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A，2007. 83A: p. 806-812. ; Couvreur, P.，et al.，European Journalof Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004. 58: p. 327-341. ; Labarre， D., etal.，Pharmaceutical Research, 1998. 15: p. 1046-1050.]。除此而外，在载药纳米粒子的表面修饰葡聚糖还可以增加纳米粒子在水溶液中的稳定性。到目前为止，我们还没有发现表面接有葡聚糖和葡聚糖-叶酸同时负载阿霉素的白蛋白纳米粒子的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分散性好，稳定性好，具有肿瘤靶向释放药物功能的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法和应用。本发明提供的负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂，是一种以葡聚糖和葡聚糖-叶酸为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子溶液。所得到的纳米粒子溶液在肿瘤靶向输送药物的应用。本发明提供的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂的制备方法，具体步骤如下
(1)在无水二甲基亚砜(DMSO)溶液中以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂和N，N’ 二环己基碳二亚胺(DCC)为偶合剂，通过酯化反应将叶酸(FA)接枝到葡聚糖(DEX)分子上，得到葡聚糖-叶酸共价复合物；
(2)通过MaiIIard反应,将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；(具体可按照专利号为2007100400288提出的方法，通过Maillard反应制备白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物；Maillard反应过程为将葡聚糖-叶酸共价复合物和自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，将溶液混合均匀以后调节PH值，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中进行Maillard反应后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物)；
(3)负载阿霉素在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调节混合溶液的pH在6. 8 8. 8之间，然后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部，共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成纳米粒子的外壳。本发明利用阿霉素在PH改变条件下自身的疏水性发生变化以及阿霉素与白蛋白之间的静电和疏水作用，形成以白蛋白和阿霉素为核的纳米复合物；最后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部。加热温度和/或者加热时间的增加将使白蛋白的交联程度增加因而导致阿霉 素的释放速率降低。一般加热温度在60°C以上(优选为60°C--100°C)，加热时间至少30分钟(优选为30—1000分钟)。共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成了纳米粒子的外壳，使得纳米粒子在水溶液中保持稳定。本发明的制备条件是
(1)葡聚糖的分子质量从2000到100000；
(2)白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是动物白蛋白，如牛血清白蛋白；
(3)在葡聚糖-叶酸复合物中，叶酸的摩尔接枝度为1% 10%之间；
(4)在制备白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物的Maillard反应中，葡聚糖-叶酸复合物与葡聚糖的摩尔比在0.005:1 2:1之间，白蛋白与总葡聚糖(包括葡聚糖-叶酸复合物和单独的葡聚糖)的摩尔比在5:1 1:20之间；
(5)在负载阿霉素的过程中，白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物中的白蛋白浓度在0.5 50 mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比在10:1 1:10之间。本发明可以得到高效负载阿霉素的白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子，阿霉素的包埋量和包埋效率分别可以达到14%和90%以上。动态光散射结果表明纳米粒子的水合半径在14 100 nm之间并保持长期稳定(附图I)。透射电镜结果表明纳米粒子具有类似球形的外貌并且具有很好的分散性(附图2)。在药物释放方面，与自由阿霉素相比，载阿霉素纳米粒子具有明显的缓释性质(附图3和附图4)，纳米粒子在pH 7. 4条件下释放阿霉素的速率很小，而降低pH值可以显著增加阿霉素的释放速率。由于肿瘤细胞的PH值低于正常细胞，纳米粒子的这个性质有利于其进入肿瘤细胞以后释放阿霉素。荷瘤小鼠的实验表明，接有叶酸的阿霉素纳米粒子在肿瘤抑制和延长荷瘤小鼠生命方面具有明显的优势肿瘤抑制率达到88. 9%，生命延长率达73. 8%。
图I.新鲜制备和存放35天的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子溶液的水合半径分布。图2.阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子经磷钨酸溶液负染以后的电子显微镜照片。图3.自由阿霉素(free D0X)、加热30分钟(min)和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖(D0X/BSA-DEX)纳米粒子及加热30分钟和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸(0( /854-0￡乂- 4)纳米粒子在？85(0.01 mol/L 7. 4磷酸缓冲液+ 0. 15 mol/L NaCl)中累计释放阿霉素曲线。图4.自由阿霉素(free D0X)、加热30分钟(min)和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖(D0X/BSA-DEX)纳米粒子及加热30分钟和60分钟制备的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸(D0X/BSA-DEX-FA)纳米粒子在0. I mol/L pH 5. 0醋酸缓冲液中累计释放阿霉
素曲线。图5.叶酸(A)、葡聚糖(B)和葡聚糖-叶酸复合物(C)的FTIR光谱图。图6.叶酸(A)、葡聚糖(B)和葡聚糖-叶酸复合物(C)在DMS0-d6溶剂中的1H NMR图。
具体实施例方式实施例I.称取叶酸斤八)0.45868、队^二环己基碳二亚胺(00)0.21448和4-二甲氨基吡啶(DMAP)O. 1271g置于烧瓶中，加入25mL无水二甲基亚砜(DMSO)溶液，在30°C和氮气的气氛下避光活化叶酸的羧基30分钟，然后加入分子量为10 kDa的葡聚糖(DEX)
I.0012g，反应20小时。反应结束后先抽滤除去沉淀，然后用截留分子量为3500的透析袋对10 mmol/L pH 7. 4磷酸缓冲液透析,除去没有反应的叶酸。然后再对去离子水透析,透析期间离心(12000rpm，30min)除去沉淀。最后将纯化后的葡聚糖_叶酸(DEX-FA)复合物冻干备用。所合成的DEX-FA共价复合物用傅立叶转换红外光谱(FTIR，附图5)及核磁共振(1H NMR，附图6)对其结构进行了表征。通过对叶酸分子中苯环上7. 63ppm位置的两个H与葡聚糖异头碳上4. 9ppm位置的一个H进行峰面积比较，得到叶酸的摩尔取代度为5. 0%，即每100个葡萄糖单元中有5个连接了叶酸。实施例2.将牛血清白蛋白(BSA)用去离子水溶解，配制成10 mg/mL的白蛋白溶液。然后将实施例I制备的10 kDa葡聚糖-叶酸复合物和10 kDa自由葡聚糖加入到白蛋白溶液中，白蛋白与总的葡聚糖的摩尔比为1:4。葡聚糖-叶酸和自由葡聚糖的摩尔比在0:1 2:1区间，将溶液混合均匀以后调节pH值到8.0，然后将溶液冷冻干燥。将冻干后的固体粉末称重后放入烧杯中置于装有KBr饱和溶液的密闭容器中(容器内相对湿度为79%)，在60 °C下进行48小时Maillard反应后得到BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物。将BSA-葡聚糖-叶酸共价复合物用去离子水溶解，然后加入盐酸阿霉素水溶液，阿霉素与白蛋白的质量比为1:4，白蛋白的最终浓度是5 mg/mL，溶液的pH值约为5 6之间。待溶液混合均匀后，用NaOH溶液调节混合溶液的pH到7.4形成阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米复合物，然后将此纳米复合物溶液置于80°C水浴中加热60分钟，就可以得到阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子水溶液。纳米粒子的水合半径(Rh)和多分散系数(PDI)通过动态光散射分析得到，测量时溶液被稀释到白蛋白浓度为0. I mg/mL。在纳米粒子溶液中的自由阿霉素通过超滤与纳米粒子分离(超滤截留分子量50 kDa)，超滤液中的阿霉素浓度利用紫外-可见光谱在480 nm的吸收测定。阿霉素在纳米粒子中的包埋效率和包埋量通过以下公式计算
权利要求
1.一种负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为(1)在无水二甲基亚砜溶液中以4-二甲氨基吡啶为催化剂，以N，N’二环己基碳二亚胺为偶合剂，通过酯化反应将叶酸接枝到葡聚糖分子上，得到葡聚糖-叶酸共价复合物；(2)通过MaiIIard反应,将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白_葡聚糖-叶酸复合物；(3)负载阿霉素在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调节混合溶液的pH在6. 8 8. 8之间，然后将混合溶液加热，使白蛋白变性并发生分子间交联，从而将阿霉素固定在纳米粒子的内部，共价连接到白蛋白上的葡聚糖和葡聚糖-叶酸复合物组成纳米粒子的外壳。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他动物血清白蛋白。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述的葡聚糖的分子量在2000 100000 之间。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于(I)在葡聚糖-叶酸共价复合物中，叶酸的摩尔接枝度为1% 10% ；(2 )在Mai I Iard反应中，葡聚糖-叶酸共价复合物与葡聚糖的摩尔比在O. 005:1 2:1 之间，白蛋白与总葡聚糖的摩尔比在5:1 1:20之间；(3)在负载阿霉素的过程中，白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物中的白蛋白浓度为O. 5 50 mg/mL，阿霉素与白蛋白的质量比为10:1 1:10，加热温度在60 °C 100 °C，加热时间是 30 1000分钟。
5.由权利要求1-4所述方法制备得到的负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂，是一种以葡聚糖和葡聚糖-叶酸为壳，白蛋白和阿霉素为核的纳米粒子的溶液。
6.根据权利要求5所述的负载阿霉素的白蛋白纳米粒子制剂在靶向输送药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体为负载阿霉素并具有叶酸受体靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂及其制备方法。本发明通过Maillard反应，将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；然后在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调整溶液pH值以后加热制备得稳定的具有叶酸受体靶向功能的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子。本发明得到的负载阿霉素的白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子，阿霉素的包埋量和包埋效率分别可以达到14%和90%以上；动态光散射结果表明纳米粒子的水合半径在14～100nm之间并保持长期稳定；透射电镜结果表明纳米粒子具有类似球形的外貌并且具有很好的分散性。该纳米粒子可在靶向输送药物方面广泛应用。
文档编号A61P35/00GK102973512SQ20121050379
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月2日 优先权日2012年12月2日
发明者姚萍, 郝和群 申请人:复旦大学