专利名称：猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学皮肤组织工程技术领域，特别是涉及猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法。
背景技术：
近些年来，随着工业的发展，人身事故伤害也不可避免地呈递增趋势，另外人们在生活和工作中对自身形象的要求也不断提高，因此需要进行皮肤修复的人更是越来越多。现有技术中，在创面修复领域，已发现真皮能够促进组织的修复，减少愈合过程中瘢痕的形成，因此真皮组织的选择、提取、制备以及应用一直是皮肤修复领域的研究热点。
但是，由于真皮组织在修复过程中很容易出现一系列的免疫排斥反应，产生免疫排斥反应的原因主要来自于细胞，由此就推动了对真皮组织的无细胞化技术的研究。而现有技术中限于自体皮以及异体皮的来源极为有限，异种(如猪等)脱细胞真皮就成为了当今皮肤修复技术研究的一大主题。现有技术中，猪脱细胞真皮基质的制备方法主要有酶消化法、高渗盐-SDS法、平衡盐溶液法等。而在实际操作中发现高渗盐-SDS法中十二烷基硫酸钠(SDS)作为去污剂脱除细胞时，强度过大，会造成部分支架结构的破坏。因此，通常选用较温和的TritonX-IOO非离子型表面活性剂进行后期细胞脱除。平衡盐溶液法由于要辅以较繁琐的物理方法处理，如Y射线照射、反复冻融等。使得处理过程比较复杂，处理时间也相对较长，相对于其他化学方法处理时间过长，费时费力。且平衡盐溶液法处理中会使真皮中的胶原蛋白和基质膜受到相当程度的损伤。酶消化法也存在操作复杂，不易控制等缺陷。
因此针对现有技术的不足，提供一种细胞去除彻底、真皮纤维支架完整、可制备具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率的异种脱细胞真皮基质包被胶原的应用产品及其制备技术以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法，该发明具有细胞去除彻底、真皮纤维支架完整、所制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率的特点。
本发明的目的通过以下技术措施实现。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，包括下列步骤
(1)清洗，具体是将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；
(2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；
(3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；
(4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片进行超声清洗，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存；
(5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，灌装密封；或者 将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，进行冻干处理，将冻干物密封包装。上述步骤(I)具体是，将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。上述步骤(2)具体是，将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 0-3. OU/mL DispaseII溶液中浸泡，并在3-6°C条件下消化40-60小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮；然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。优选的，上述步骤(2)具体是，将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 5U/mLDispaseII溶液中浸泡，并在4°C条件下消化48小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮； 然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。上述步骤(3)具体是，将步骤(2)得到的皮片在体积分数为0.3-0.8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。优选的，上述步骤(3)具体是，将步骤(2)得到的皮片在体积分数为O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。上述步骤(4)具体是，将步骤(3)得到的皮片放在超声波清洗机中，在50-150小时z的频率下震荡洗涤4-8小时，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存。上述步骤(5)胶原包被具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为1-5 mg/mL的I型胶原中，灌装密封制得成品；或者
将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为1-5 mg/mL的I型胶原中，置于_20°C至_50°C条件下冷却1-5小时，然后在-20°C至_50°C循环冻干20-50小时，接着进行室温回温5_10小时.，然后将冻干物密封包装制得成品。更佳的，上述步骤(I)之前还包括取皮步骤，具体是将健康白猪的整张皮浸泡于O. 1%新洁尔灭溶液中，消毒15-30分钟，用镊子夹除猪皮上残留的毛，用取皮刀取O. 3mm-0. 5mm厚的皮片。本发明同时提供一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料，该猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料通过上述的方法制备而成。本发明的一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法，制备方法包括下列步骤(1)清洗，具体是将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片进行超声清洗，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存；(5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，灌装密封；或者将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，进行冻干处理，将冻干物密封包装。本发明采用DispaseII >TritonX-100系统，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。此外，本发明增加I型胶原包被步骤，可根据具体情况适用于不同的创面，适用性强，敷用效果好。
具体实施例方式结合以下实施例对本发明作进一步描述。实施例I。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，包括下列步骤。( I)清洗，具体是将皮片在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤。 (2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮，然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤。(3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液进一步去除真皮细胞成分，然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤。(4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片进行超声清洗，然后浸泡于PBS磷酸缓冲盐溶液中暂存。(5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，灌装密封制得成品O本发明采用Dispasell、TritonX-IOO系统,此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长，采用该系统细胞去除彻底。此外，本发明增加I型胶原包被步骤采用浸泡灌装密封形式，使用时为湿态，有利于干燥创面的保湿湿润。 实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例2。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，具体包括下列步骤。(I)清洗，将皮片在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。(2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 0-3. OU/mLDispaseII溶液中浸泡，并在3_6°C条件下消化40-60小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮；然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。(3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片在体积分数为O. 3-0.8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。(4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片放在超声波清洗机中，50-150HZ震荡洗涤4-8小时，然后浸泡于PBS磷酸缓冲盐溶液中暂存。(5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为1-5 mg/mL的I型胶原中，灌装密封制得成品。本发明采用Dispasell、TritonX-IOO系统,此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。此外，本发明增加I型胶原包被步骤采用浸泡灌装密封形式，使用时为湿态，有利于干燥创面的保湿湿润。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例3。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，包括下列步骤。(I)清洗，将皮片在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。(2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 5U/ml Dispasell溶液中浸泡，并在4°C条件下消化48小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮；然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。(3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片在体积分数为O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在PBS磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。 (4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片放在超声波清洗机中，50-150HZ下震荡洗涤4-8小时，然后浸泡于PBS磷酸缓冲盐溶液中暂存。(5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为I -5 mg/mL的I型胶原中，灌装密封制得成品。本发明采用Dispasell、TritonX-IOO系统,此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。此外，本发明增加I型胶原包被步骤采用浸泡灌装密封形式，使用时为湿态，有利于干燥创面的保湿湿润。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例4。—种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，包括下列步骤。首先进行取皮，具体是选取3月龄健康的白猪，屠宰、剥皮、脱毛，将整张皮泡在O. 1%新洁尔灭溶液中，消毒15分钟，用镊子夹除猪皮上残留的毛，取皮刀取O. 3mm厚8cm X 8cm的皮片。接着进行如下步骤
(I)清洗将取好的皮片在PBS中洗涤10分钟。(2)分离表皮与真皮用IL的烧杯配制400ml 2. 5U/mL的Dispasell溶液,将皮片浸泡在溶液里，4°C条件下消化48小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，快速分离表皮与真皮。然后再在PBS溶液中洗涤10分钟，清洗干净。(3)脱细胞配制400ml O. 5%的TritonX-IOO溶液，将皮片浸泡在溶液中，室温下持续震荡48小时，进一步去除真皮细胞成分。然后再在PBS溶液中洗涤10分钟。(4)超声清洗将处理好的皮片放在超声波清洗机中，浸泡在PBS中，在50-150HZ频率下震荡洗涤5小时。(5)1型胶原包被将猪脱细胞真皮基质浸泡在浓度为I -5 mg/mL I型胶原中，灌装密封制得成品。本发明采用Dispasell、TritonX-IOO系统，此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。此外，本发明增加I型胶原包被步骤采用浸泡灌装密封形式，使用时为湿态，有利于干燥创面的保湿湿润。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例5。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其他方法与实施例I至4中任意一种相同，不同之处在于步骤(5) I型胶原包被的方式不同。本实施例中，步骤(5) I型胶原包被具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，进行冻干处理，将冻干物密封包装制得成品。本实施例采用冻干方式，在使用时适于应用于渗液较多的创面，有利于吸收导出的渗液。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例6。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其他方法与实施例I至 4中任意一种相同，不同之处在于步骤(5) I型胶原包被的方式不同。本实施例中，步骤(5) I型胶原包被具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为I-5 mg/mL的I型胶原中，置于_20°C至_50°C条件下冷却1_5小时，然后在-20°C至_50°C循环冻干20-50小时，接着进行室温回温5-10小时，然后将冻干物密封包装制得成品。本实施例采用冻干方式，在使用时适于应用于渗液较多的创面，有利于吸收导出的渗液。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例7。一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，包括下列步骤。首先进行取皮处理，具体是选取3月龄健康的白猪，屠宰、剥皮、脱毛，将整张皮泡在O. 1%新洁尔灭溶液中，消毒15分钟，用镊子夹除猪皮上残留的毛，取皮刀取O. 3mm厚8cm X 8cm的皮片。接着进行如下步骤
(I)清洗将取好的皮片在PBS中洗涤10分钟。(2)分离表皮与真皮用IL的烧杯配制400ml 2. 5U/mL的Dispasell溶液，将皮片浸泡在溶液里，4°C条件下消化48小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，快速分离表皮与真皮。PBS洗涤10分钟，清洗干净。(3)脱细胞将皮片浸泡在400ml体积分数为O. 5%的TritonX-100中，室温下持续震荡48小时，进一步去除真皮细胞成分。PBS清洗10分钟。(4)超声清洗将处理好的皮片放在超声波清洗机中，浸泡在PBS中，50-150HZ震荡洗涤5小时。(5) I型胶原包被冻干将猪脱细胞真皮基质浸泡在浓度为I -5 mg/mL I型胶原中，在_20°C至_50°C遇冷1-5小时，再在_20°C至_50°C循环冻干20-50小时，室温回温5-10小时，将冻干物密封包装制得成品。本发明采用Dispasell、TritonX-100系统，此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。此外，本发明增加I型胶原包被步骤采用冻干方式，在使用时适于应用于渗液较多的创面，有利于吸收导出的渗液。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
实施例9。
一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料，采用如上实施例I至8中任意一种方式制备而成。该猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料，采用Dispasell、TritonX-100系统制备，细胞去除彻底，更重要的是此系统性质温和，处理过程中对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保证纤维支架的完整性，有利于后期上皮细胞的粘附与生长。该复合敷料采用I型胶原包被，采用浸泡灌装密封形式，使用时为湿态，有利于干燥创面的保湿湿润；采用冻干方式，在使用时适于应用于渗液较多的创面，有利于吸收导出的渗液。实践证明，该方法制备的产品具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范 围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于，包括有下列步骤 (1)清洗，具体是将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤； (2)分离表皮与真皮，具体是将步骤(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤； (3)脱真皮细胞，具体是将步骤(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤； (4)超声清洗，具体是将步骤(3)得到的皮片进行超声清洗，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存； (5)胶原包被，具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，灌装密封制得成品；或者 将步骤(4)得到的皮片浸泡于I型胶原中，进行冻干处理，将冻干物密封包装制得成品O
2.根据权利要求I所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(I)具体是，将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。
3.根据权利要求2所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)具体是，将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 0-3. OU/mL DispaseII溶液中浸泡，并在3-6°C条件下消化40-60小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮；然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。
4.根据权利要求3所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(2)具体是，将步骤(I)得到的皮片在浓度为2. 5U/mLDispaseII溶液中浸泡，并在4°C条件下消化48小时，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮；然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟，清洗干净。
5.根据权利要求3所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)具体是，将步骤(2)得到的皮片在体积分数为O. 3-0. 8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。
6.根据权利要求5所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)具体是，将步骤(2)得到的皮片在体积分数为O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小时，进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤10-15分钟。
7.根据权利要求5所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(4)具体是，将步骤(3)得到的皮片放在超声波清洗机中，在50-150HZ的频率下震荡洗涤4-8小时，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存。
8.根据权利要求7所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(5)胶原包被具体是将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为I -5 mg/mL的I型胶原中，灌装密封制得成品；或者 将步骤(4)得到的皮片浸泡于浓度为1-5 mg/mL的I型胶原中，置于_20°C至_50°C条件下冷却1-5小时，然后在-20°C至_50°C循环冻干20-50小时，接着进行室温回温5_10小时，然后将冻干物密封包装制得成品。
9.根据权利要求I至8任意一项所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法，其特征在于所述步骤(I)之前还包括取皮步骤，具体是将健康白猪的整张皮浸泡于O. 1%新洁尔灭溶液中，消毒15-30分钟，用镊子夹除猪皮上残留的毛，用取皮刀取O.3mm-0. 5mm厚的皮片。
10.一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料，其特征在于通过如权利要求I至9中任意一项所述的猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料的制备方法制备而成。
全文摘要
一种猪脱细胞真皮基质包被胶原的复合敷料及其制备方法，制备方法包括(1)清洗，将皮片在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(2)分离表皮与真皮，将皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型胶原和纤维黏蛋白，分离表皮与真皮，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(3)脱真皮细胞，将皮片浸泡在TritonX-100溶液进一步去除真皮细胞成分，然后再在磷酸缓冲盐溶液中洗涤；(4)超声清洗，然后浸泡于磷酸缓冲盐溶液中暂存；(5)胶原包被，将皮片浸泡于I型胶原中灌装密封；或者浸泡于I型胶原中进行冻干处理，将冻干物密封包装制得成品。本发明细胞去除彻底，纤维支架完整，适用性强，敷用效果好。
文档编号A61L15/40GK102921034SQ20121050983
公开日2013年2月13日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者迟妍妍, 雷静, 钟翠红, 盛晓晓, 黄冬晶 申请人:广州创尔生物技术有限公司