专利名称：：一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗的制备及其应用，属于畜牧兽医
技术领域：
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背景技术：
：仔猪腹泻(Diarrhea)是由某些特定血清型的产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxingenicE.coli,ETEC)引起的,在导致初生仔猪死亡的数量中占有很大的比重，严重危害着养猪业的健康发展，并且每年给养殖户造成了巨大的经济损失。仔猪腹泻多为急性突发、传染性强，临床症状表现为排出稀度很高的黄色便样，严重时成水样，继而导致仔猪身体脱水、死亡。导致仔猪腹泻致病性ETEC的致病因子分为粘附素和肠毒素两大类，整个致病过程需要二者共同作用，缺一不可，是仔猪腹泻抗原研究的主要两大类。现有研究表明，能引起仔猪腹泻的ETEC菌毛类型主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41四种粘附素，而产生的肠毒素类型则包括耐热性肠毒素(Heat-stableenterotoxin,ST)和/或不耐热性肠毒素(Heat-labileenterotoxin,LT)。上述四种菌毛类型和两种肠毒素类型是仔猪腹泻疫苗的主要毒力因子，也是仔猪腹泻疫苗学研究的焦点。在防治仔猪腹泻疫苗的开发和利用方面大致可以分为菌毛疫苗和肠毒素疫苗，目前国内常用的是“三价苗”，即将三种不同菌毛类型的ETEC菌培养灭活来使用，再就是一些基因工程疫苗，将菌毛基因或者肠毒素基因导入宿主细胞，进行重组表达，制备成为相应的疫苗。但是由于受地域限制，ETEC的菌毛类型随地域不同变化很大，根据流行病学调查显示在我国能引起仔猪腹泻ETEC的菌毛类型主要是K88、K99、987P、F41，因此目前还没有一种能够普遍适用于各个地区的普适性疫苗，这个问题是目前防治仔猪腹泻研究的瓶颈。想要解决这一问题，在防治仔猪腹泻的疫苗中不但要包含主要菌毛抗原还要包含肠毒素抗原，在细菌粘附以及产生毒素的两个主要致病阶段进行阻断。目前国内尚无这种涵盖了主要毒力因子抗原的复合多价疫苗，这也是本发明研究重点突破的地方。
发明内容本发明提供了一种用于预防仔猪腹泻的包含有多种肠毒素蛋白抗原和菌毛蛋白抗原的多价复合疫苗。本发明要解决的生产问题是现有养殖生产中针对仔猪腹泻的疫苗含有的抗原较单一、免疫保护率较低、疫苗使用受地域限制；本发明可以有效解决一直困扰抗仔猪腹泻疫苗研发受地域限制、保护率低等问题，使本发明可以在大范围地区内普及使用，而且获得较高的免疫保护率。本发明的技术方案如下一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，包括重组三价肠毒素蛋白SLS、提取纯化的K88菌毛蛋白、K99菌毛蛋白和F41菌毛蛋白复合。各组分的浓度配比如下重组三价肠毒素SLS蛋白0.5-丨.5mg/mlK88菌毛蛋白0.1-1.0mg/mlK99菌毛蛋白O.1-1.0mg/mlF41菌毛蛋白O.l-1.Omg/'ml上述的重组三价肠毒素SLS蛋白是基因重组蛋白，SLS蛋白溶液分子量大小为23kDa，纯度达95%以上。上述的K88菌毛蛋白是对标准K88菌株培养并采用热振荡法获得并纯化的，其分子量大小为26kDa，K88菌毛等电点3.92，其蛋白纯度达95%以上。上述的K99菌毛蛋白是对标准K99菌株培养并采用热振荡法获得并纯化的，其分子量大小为17kDa，K99菌毛等电点9.75，其蛋白纯度达95%以上。上述的F41菌毛蛋白是对标准K88菌株培养并采用热振荡法获得并纯化的，其分子量大小为29.5kDa，F41菌毛等电点4.6，其蛋白纯度达95%以上。经过一系列安全性试验和免疫保护试验，证明本发明对于预防仔猪腹泻，是一种高效抗仔猪腹泻ETEC疫苗，确保疫苗具有可靠的安全性和良好的免疫原性。上述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗采用如下方法制备，具体步骤如下1、将含有重组三价肠毒素的重组菌PET30-SLS在TSB培养基中培养至0D_=0.6，加入诱导剂IPTG，诱导表达3-6h，收集菌体细胞，再重悬超声破碎获得包涵体沉淀；包涵体沉淀经洗涤、8M尿素变性溶解、梯度稀释透析复性、超滤浓缩等步骤，获得高纯度、高浓度的SLS重组蛋白溶液。2、采用改良Minca培养基对标准菌毛菌株K88、K99、F41进行培养；在改良Minca培养基中分别接种K88、K99、F41标准菌株，培养24h以后，菌液60°C温浴振荡，IOOOOrpm离心获取上清液粗蛋白，并分别等电点纯化，超滤离心后获得各种菌毛蛋白溶液。3、将提取制备的SLS蛋白和多种菌毛蛋白混合，确定最终混合溶液中SLS蛋白的浓度为lmg/ml、K88菌毛蛋白浓度为O.5mg/ml、K99菌毛蛋白浓度为O.5mg/ml、F41菌毛蛋白浓度为O.5mg/ml。然后加入弗氏完全佐剂与混合蛋白溶液等体积混合、乳化,制备成为成品疫苗。4、依次采用固体LB平板、实验小鼠、实验仔猪对疫苗进行无菌检验、安全检验和效力检验，证明本发明疫苗可以安全有效的使用。5、选取健康怀孕母猪，于产前35-40天注射本发明疫苗，产前两周进行加强免疫，另取相同数目的怀孕母猪不注射疫苗作空白对照；每周定期对妊娠母猪采血，间接ELISA检测母猪血清抗体效价。6、母猪产仔后，分别统计实验组、空白组腹泻仔猪数目，计算仔猪腹泻率；采集免疫母猪初乳，间接ELISA检测初乳中相应抗体效价。本发明将上述疫苗中的各抗原成分经SDS-PAGE、ffestern-blot检测证明产品中含有目的蛋白，而且获得比较高的纯度；通过固体LB平板、免疫小鼠、免疫仔猪检测，证明了其免疫原性以及安全性。本发明疫苗免疫妊娠母猪后，在免疫后几周内血清抗体逐步升高，最高可达1:20000;经过免疫的母猪产仔后的仔猪腹泻率明显下降，免疫保护率高达90%;免疫母猪产仔后，初乳中的抗体效价也明显比空白组高出很多倍。图1是疫苗中菌毛(K88为例)抗原蛋白的SDS-page电泳图。图2是疫苗中SLS抗原蛋白的SDS-page电泳图。图3是母猪初乳中特异性抗体效价的直方图。具体实施例方式以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。一、疫苗的制备1、标准菌毛菌株一级菌种培养及菌种鉴定将标准K88菌毛、K99菌毛、F41菌毛菌株接种于改良Minca培养基，37°C过夜培养后，用相应的(K88、K99、F41)菌毛抗血清进行血液凝集实验，凝集反应达“++++”，纯检合格。取菌液加50%甘油等比冻存于_70°C冰箱。2、二级菌种培养以及抗原蛋白的提取及鉴定(I)重组肠毒素蛋白SLS的提取将三价肠毒素重组菌pET30-SLS接种于TSB培养基中，37°C下进行振荡培养。酶标仪检测菌液OD6tltl=O.6时，加入IPTG(终浓度为1禮)，诱导表达3_6h后，5000rpm离心获得菌体。菌体重悬后，采用超声破碎法将细胞破碎，离心获得包涵体沉淀，包涵体沉淀经洗涤液TE1、TE2、TE3洗涤纯化后，并于8M尿素中变形溶解。依次采用梯度稀释法、透析法使变形蛋白溶液中的SLS蛋白复性，并采用超滤离心法将蛋白溶液浓缩。(2)菌毛抗原蛋白的提取将一级培养纯化的标准K88菌株接种于改良Minca培养基中，于37°C振荡培养24h,5000rpm离心获得菌体。菌体重悬后在60°C水浴锅中温浴30min,期间每IOmin镟润振荡一次，等菌毛充分脱落后，IOOOOrpm离心获得上清液，即为菌毛粗提液。调节菌毛粗提液的pH为K88菌毛蛋白的等电点(pH4.0)，静置2h离心获得菌毛蛋白沉淀，重悬后获得纯化的K88菌毛蛋白。K99菌毛蛋白、F41菌毛的制备方法与K88相似，再分别获得这两种菌毛蛋白溶液。(3)重组肠毒素蛋白SLS及菌毛抗原的鉴定采用BCA法分别检测制备的四种抗原蛋白的浓度，采用SDS-PAGE方法检测四种抗原蛋白的纯度，检测结果见附图。3、疫苗的制备及性状考察将各抗原蛋白溶液混合，加入铝佐剂，控制各抗原蛋白终浓度为权利要求1中的要求浓度，分装密闭保存。制备疫苗外观呈乳白色，为均匀水相，长时间放置稳定不分层。二、疫苗的安全性试验1、无菌检测采用LB固体平板进行无菌检测，按照《中华人民共和国兽药典》的规程，最终检验平板上并无菌生长。2、实验小鼠安全性检测取3-5只30g左右的健康小鼠，分别进行腹腔注射本疫苗，观察小鼠生长状况，最终检验小鼠未出现异常，均能正常生长。3、实验仔猪安全性检测取3-5头80g左右的健康仔猪，分别颈部肌肉注射本疫苗，观察仔猪生长状况，最终检验子这未出现异常，均能正常生长。三、疫苗的免疫效果1、疫苗的使用2、选取10头健康怀孕母猪，于产前35-40天注射本发明疫苗，产前两周进行同等剂量加强免疫，另取10头同批次怀孕母猪不注射疫苗作空白对照；注射方式采取耳后颈部左右两侧两点注射。3、免疫母猪所产仔猪生长状况的检测待母猪分娩后，在3d到7d内统计免疫组和非免疫对照组的腹泻仔猪数量，并且统计总产仔数量。用SPSS软件进行分析，并计算各组仔猪腹泻率，分析显出性差异。(见表I)表I各组产仔数目及腹泻率混合疫苗组对照mrim10398出生7天内腹泻头数932仔猪腹泻率(％)8.7%32,6%3、间接ELISA对免疫母猪血清以及初乳抗体效价的检测自一免后第Id每隔一周分别采取免疫组和对照组的血样，采用间接ELISA法检测血清中相应的抗体效价，并用SPSS对比分析，绘制曲线趋势图，判断抗体含量的变化趋势;待母猪分娩后，分别采取免疫组和对照组母猪初乳，采用间接ELISA法检测乳清中抗体的含量，SPSS分析各组差异性，并绘制直方图。结果参见附图。上述直观腹泻统计结果以及ELISA数据很明确地说明了本发明涉及的疫苗能够产生高水平的针对仔猪腹泻致病菌抗原的抗体，相比空白对照组在临床攻毒下为新生仔猪提供了很好的保护，大大减少了腹泻仔猪数量，达到了本研究的预期，从菌毛和肠毒素多个层面提供了抗体保护，为疫苗的高效实用和广泛实用奠定了实践基础。权利要求1.一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，其特征在于包括以下几种免疫抗原重组三价肠毒素SLS蛋白0.5-1.5mg/ml1(88菌毛蚩|O.1-1.Omg/mlK99菌毛I'I0.1-1.0mg/mlF41菌.蛋|L.|O.1-1.0mg/ml。2.根据权利要求1所述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，其特征还在于，上述的重组三价肠毒素SLS蛋白的分子量大小为23kDa，纯度达95%以上。3.根据权利要求1所述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，其特征还在于，上述的K88菌毛蛋白的分子量大小为26kDa，K88菌毛等电点3.92，其蛋白纯度达95%以上。4.根据权利要求1所述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，其特征还在于，上述的K99菌毛蛋白的分子量大小为17kDa，K99菌毛等电点9.75，其蛋白纯度达95%以上。5.根据权利要求1所述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗，其特征还在于，上述的F41菌毛蛋白的的分子量大小为29.5kDa，F41菌毛等电点4.6，其蛋白纯度达95%以上。6.权利要求1-5任一所述的一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗的制备方法，包括如下步骤(O制备采用的重组三价肠毒素SLS蛋白为三价重组蛋白，是不耐热性肠毒素LTB、耐热性肠毒素STa及STb基因经融合，载入原核质粒并转化宿主细胞；(2)表达重组三价肠毒素SLS蛋白的重组菌在TSB培养基中接种培养至0D_=0.6，加入IPTG，继续培养3-6h，细胞破碎获得包涵体，再洗涤、溶解、复性、纯化、浓缩获得SLS蛋白溶液；(3)改良MINCA培养基中分别接种K88、K99、F41标准菌株，培养24h以后，菌液60°C温浴振荡，获取上清液粗蛋白，等电点纯化，获得菌毛蛋白溶液；(4)调整各蛋白浓度至权利要求书1-5任一所述的浓度配比，各种蛋白混合后，加入铝佐剂或者油佐剂，采用疫苗混合器混合均匀，制备为成品疫苗。全文摘要一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗及其制备方法，属于畜牧兽医
技术领域：
。本发明采用基因工程重组表达的重组三价肠毒素SLS蛋白结合国内常见致病菌K88、K99、F41菌毛抗原蛋白，与佐剂乳化均匀后，制备成了包含有肠毒素蛋白抗原以及多种菌毛抗原蛋白的复合疫苗。本发明囊括了ETEC致病环节的两个重要致病因子肠毒素和菌毛，对ETEC引起腹泻的各个过程都进行了保护，第一步阻断了ETEC的生长，第二步对少数生长的ETEC产生的肠毒素进行中和，从各个层面控制了腹泻的发生，使疫苗不受地域限制，使用范围更广、保护率更高。本发明的疫苗投放使用后，获得了高达95%的保护率，免疫效力比市场使用疫苗高出5倍以上，安全可靠。文档编号A61K39/108GK103007267SQ20121054096公开日2013年4月3日申请日期2012年12月13日优先权日2012年12月13日发明者徐永平,张恒慧,金礼吉,尤建嵩,李晓宇申请人:大连理工大学