兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂及制备方法与流程

本发明属于兽用药物制备技术领域，具体涉及一种兽用的艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂及其制备方法与应用。

背景技术：
由大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等引起的呼吸系统、泌尿系统及肠道的疾病，长久以来一直困扰着我国的畜牧养殖业，成为养殖业发展的一大障碍，给我国的养殖业带来了巨大的经济损失，为了控制此类疾病，国家投入了大量的物力和财力。磺胺类药物能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，在控制细菌性感染疾病中发挥了巨大的作用，对非产酶金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属、变形杆菌属、摩根菌属、志贺菌属等肠杆菌科细菌、淋球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌均具有良好抗菌作用，尤其是大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌，能有效控制抑制以上细菌引起的呼吸系统、泌尿系统等的疾病。目前磺胺类药物中抗菌最强而且较常用的为磺胺甲基异恶唑(SMZ)和甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim，TMP)制成的复方制剂，但是此复方制剂存在一些问题：在动物体内的生物半衰期相对较短，达不到长期抗菌的作用；表观分布容积小，不适合全身性感染的治疗。艾地普啉(ADP)是由瑞士的Roche公司首先研发合成出来的一种新型的动物专用抗菌增效剂(AntibacterialSynerists)，为二氢叶酸还原酶(dihydrofolatere-ductase，DHFR)抑制剂类抗菌增效剂，结构与TMP相似，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果。与TMP相比，ADP的组织渗透力和亲和力较强，给药后肌肉内的药物浓度高于血液中的；与纤维组织有很强的结合能力，消除半衰期比较短、生物半衰期长、生物利用度高、表观分布容积大、体内分布广泛，具有更为广阔的应用前景。磺胺类药物和DHFR抑制剂类抗菌增效剂在临床上通常呈协同作用，推测把ADP和SMZ做成复方制剂，如配伍得当，可以提高药物的抗菌活性、扩大药物的抗菌谱、降低药物的毒性、减少药物的用量、降低药物的成本等；能延长药物的半衰期，达到长期抗菌的作用；能增大药物的表观分布容积小，适合全身性感染的治疗，是目前国内外研制新兽药的一个有效 的方法，能为合理使用抗菌素、增强抗菌疗效、减少耐药菌的产生提供有力武器。

技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂及其制备方法与应用。本发明以艾地普啉(ADP)和磺胺甲基异恶唑(SMZ)为原料药，注射用水为溶媒，加入助溶剂丙二醇、三乙醇胺、抗氧化剂无水硫代硫酸钠和乳酸等辅料，成功研制出一种工艺简单、稳定高效的艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂。本发明的制剂具有达峰时间短，吸收快，表观分布容积大，适用于全身感染性治疗的特点。本发明通过以下技术方案实现：一种兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的制备方法，该注射液的有效成分为艾地普啉和磺胺甲基异恶唑，药物的溶剂体系主要为注射用水，与附加剂制成成盐体系，使艾地普啉和磺胺甲基异恶唑能有效溶解。再将各种辅料及其注射溶媒加入其中，持续搅拌得到艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂，其步骤包括：(1)向艾地普啉中加入少量注射用水，再加入乳酸成盐，得到成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑用三乙醇胺成盐，得到成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入助溶剂，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)的成盐体系1和步骤(3)的成盐体系2，并搅拌，使之充分溶解，得到混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得成品；其中，所述的艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的配方包括：艾地普啉和磺胺甲基异恶唑原料药，其在制剂中重量/体积百分比浓度分别为2％和10％；所述的助溶剂为丙二醇，其在制剂中重量/体积百分比浓度为50％；所述的溶媒为注射用水；所述的抗氧化剂为无水硫代硫酸钠，其在制剂中重量/体积百分比浓度为0.15％。申请人提供了一种兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂，按配方量的组分及配比如下：(1)艾地普啉原料药，占制剂中重量/体积百分比浓度2％；(2)磺胺甲基异恶唑原料药，占制剂中重量/体积百分比浓度10％；(3)注射用水(4)助溶剂为丙二醇，按重量/体积百分比浓度为50％(5)抗氧化剂为无水硫代硫酸钠，按重量/体积百分比浓度为0.15％；它是按照下述步骤制备得到的：(1)向艾地普啉中加入少量注射用水，再加入乳酸成盐，得到成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑用三乙醇胺成盐，得到成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入助溶剂，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)成盐体系1和步骤(3)的成盐体系2，并搅拌，使之充分溶解，得到混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得成品。本发明的艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂有效成分含量为96％～101％，总杂质不超过1.5％。本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂可应用于在畜禽呼吸道疾病感染中的治疗。本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的具体应用方法为：肌肉注射，一次量，每公斤体重艾地普啉5mg，磺胺甲基异恶唑25mg。本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂在猪体内的休药期为24d。本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)本发明制得的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂在猪体内具有较大的分布容积，较长的消除半衰期，相对生物利用度高。一次给药(肌肉注射)1mL/10kg(含有艾地普啉2mg，磺胺甲基异恶唑10mg)剂量可维持有效血药浓度1天，临床用量一般为1mL/10kg体重，严重病例可在1天后再注射一次。本发明得到的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂工艺简单，稳定性良好，质量可靠，可以提高药物的抗菌活性、扩大药物的抗菌谱、降低药物的毒性、减少药物的用量、降低药物的成本等；经肌肉注射后，在猪体内能维持较长时间的有效浓度，达到长期抗菌的作用；能增大药物的表观分布容积小，适合全身性感染的治疗。附图说明图1：是本发明有效成分磺胺甲基异恶唑的紫外吸收图谱。图2：是本发明有效成分艾地普林的紫外吸收图谱。图3：是猪空白血浆色谱图。图4：是猪空白血浆添加艾地普啉的样品色谱图。图5：是猪空白血浆添加磺胺甲基异恶唑的样品色谱图。图6：是猪肌肉注射本发明所得制剂后猪血浆中艾地普啉的色谱图。图7：是猪肌肉注射本发明所得制剂后猪血浆中磺胺甲基异恶唑的色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不以任何形式限制本发明要求保护的范围。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(w/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。试验中药物粒径形态观察使用常用的光学显微镜，粒径测定使用常用的显微镜测微尺，复方注射液的药物含量采用常用的高效液相色谱-紫外检测法。实施例1兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-1具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉原料药(0.2g)中加入少量注射用水(1mL)，再加入乳酸(295μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1340μl)城盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(4.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.005g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、 不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.9％和99.7％。实施例2兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-2具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(300μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1340μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系中加入丙二醇(5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.0075g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的100％和99.9％。实施例3兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-3具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(305μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1340μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(5.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.01g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.7％和99.9％。实施例4兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-4具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(295μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1360μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.01g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的100.1％和100.3％。实施例5兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-5具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(300μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1360μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(5.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.005g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.8％和99.7％。实施例6兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-6具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(305μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1360μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤2)的成盐体系2中加入丙二醇(4.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.0075g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方 注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.6％和100％。实施例7兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-7具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(295μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1380μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系1中加入丙二醇(4.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤4)的混合体系中加入抗氧化剂无水疏代硫酸钠(0.0075g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.8％和99.7％。实施例8兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-8具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉(0.2g)中加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(300μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1380μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(4.5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)用步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.01g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.9％和100.1％。实施例9兽用艾地普林-磺胺甲基异恶唑注射剂制备工艺-9具体工艺步骤如下：(1)向艾地普啉中(0.2g)加入少量注射用水1mL，再加入乳酸(305μl)成盐，即为成盐体系1；(2)将磺胺甲基异恶唑(1g)用三乙醇胺(1380μl)成盐，即为成盐体系2；(3)向步骤(2)的成盐体系2中加入丙二醇(5mL)，并搅拌，使之充分溶解，置室温下备用；(4)混合步骤(1)和步骤(3)的两种成盐体系，并搅拌，使之充分溶解，即为混合体系；(5)向步骤(4)的混合体系中加入抗氧化剂无水硫代硫酸钠(0.005g)，并搅拌，使之充分溶解；(6)用注射用水定容；(7)用普通滤纸和0.22μm的微孔滤膜进行粗滤、精滤，迅速灌装封口；(8)于100℃热压灭菌20min，检漏，灯检，包装即得产品。参照《中华人民共和国兽药典》2005版，对本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等项目进行检测，外观性状、不溶性颗粒、pH值、可见异物、热源检查等各项指标均符合要求，本发明的兽用艾地普啉和磺胺甲基异恶唑药物含量分别为投药量的99.8％和99.9％。实施例10应用实施例(本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的质量研究)外观性状：观察复方注射剂的外观，色泽，表明本品为无色或淡黄色澄明液体，pH值为 7.6左右。鉴定：(1)化学法。磺胺甲基异噁唑：取本品约0.1g，加水与0.4％氢氧化钠溶液各3mL，振摇使溶解，滤过，取滤液，加硫酸铜试液1滴，生成草绿色沉淀。艾地普林：取本品约20mg，加稀硫酸2mL溶解后，加碘试液2滴，生成棕褐色沉淀。(2)UV检测。磺胺甲基异噁唑：将样品溶解于甲醇，以甲醇作为参比溶液，在Agilent8453紫外分光光度计上测定，在270nm处有最大吸收(见图1)。艾地普林：将样品溶解于甲醇，以甲醇作为参比溶液，在Agilent8453紫外分光光度计上测定，在284nm处有最大吸收(见图2)。(3)色谱法。磺胺甲基异噁唑：按照含量检测方法进行HPLC检测，同时配制相同浓度的对照品溶液进行HPLC检测，记录两者的色谱图，发现本发明的兽用复方注射剂中SMZ与对照品溶液的保留时间一致。艾地普林：按照含量检测方法进行HPLC检测，同时配制相同浓度的对照品溶液进行HPLC检测，记录两者的色谱图，本发明的兽用复方注射剂中SMZ与对照品溶液的保留时间一致。可见异物：取供试品20支，擦净容器外壁，轻轻旋转和翻转容器使药液中存在的可见异物悬浮，置供试品于遮光板边缘处，在明视距离，分别在黑色和半色背景下，用目检视，均不少于5秒钟，未发现可见异物。不溶性微粒：取供试品，用水将容器外壁洗净，在层流净化台上小心翻转20次，使混合均匀，立即小心开启容器，用适宜的方法直接抽取每个容器中的全部溶液，沿滤器内壁缓缓注入经预处理的滤器(滤膜直径13mm)中，静置1分钟，缓缓抽滤至滤膜近干，再用微粒检查用水适量，沿滤器内壁缓缓注入，洗涤并抽滤至滤膜近干，然后用平头镊子将滤膜移置平皿上(必要时，可涂抹极薄层的甘油使滤膜平整)，微启盖子使滤膜适当干燥后，将平皿闭合，置显微镜载物台上。调好入射光，放大100倍进行显微测量，调节显微镜至滤膜格栅清晰，移动坐标轴，分别测定有效滤过面积上最长粒径大于10μm和25μm的微粒数。在显微镜下观察，制剂符合不溶性微粒检查的要求，每个供试品容器中含10μm以上的微粒不超过3000粒，含25μm以上的微粒不超过300粒。无菌检查法：按《2005年中华人民共和国药典第二部》附录XIH对本发明的兽用复方注射剂进行无菌检查。无菌检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。采用直接接种法，取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌、生孢梭菌的菌液各两管；取适宜装量的改良马丁培养基4管，分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各两管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，各试验管按相应规定的温度，培养3～5天。热原检查：按《2005年中华人民共和国药典第二部》附录XIIIA对本发明的兽用复方注射剂进行热原检查。每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温后15分钟内给药，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度(℃)。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔体温升高均低于0.6℃，但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。结果见表1在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和为0.81℃，低于1.4℃；复试的5只家兔中，体温升高均低于0.6℃，按药典计算，8只受试动物的升温总和为1.28℃，低于3.5℃，判为供试品的热原检查符合规定。表1热源实验结果装量差异：取供试品5支，开启时注意避免损失，将内容物分别用相应体积的干燥注射器及注射针头抽尽，然后注入经标化的量具内(量具的大小应使待测体积至少占其额定体积的40％)，在室温下检视。准确读取每个量筒中内容物的装量，并求平均值，平均装量不得少于标识装量的95％，每个量筒装量不得少于标识装量的93％。三批注射液的装量在96.4％～98.0％之间(如表2)，均值在96.7％～97.3％之间，均高于注射剂所规定的最低装量93％。有关物质：精密吸取本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂(约相当于SMZ50mg)置于100mL容量瓶中，加甲醇适量，超声振荡5min，使充分溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，精密吸取5mL，置于50mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；用流动相稀释供试品溶液100倍以作为对照溶液，HPLC检测。分别测定供试品溶液和对照溶液，记录色谱图至主成分保留时间的5倍，将供试品溶液色谱图中各杂质峰面积总和与对照溶液主峰面积进行比较。表2注射液的最低装量三批注射液中ADP的有关物质分别为1.41％、1.39％和1.43％，总杂质不超过1.5％。三批注射液中SMZ的有关物质分别为1.21％、1.38％和1.27％，总杂质不超过1.5％，结果见表3和4。表3本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方制剂中艾地普啉的有关物质检查含量测定：精密吸取本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂(约相当于SMZ50mg)置于100mL容量瓶中，加甲醇适量，超声振荡5min，使充分溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，精密吸取5mL，置于50mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。两种药物均按下列公式计算含量：C混＝C对·A样/A对C混：复方剂中药物的含量；C对：对照品的含量；A样：样品峰面积；A对：对照品峰面积。表4本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂中磺胺甲基异恶唑的有关物质检测三批复方注射剂中ADP的相对含量分别为96.8％、97.3％和98.4％，介于90～110％；SMZ的相对含量分别为98.5％、99.3％和101.4％，介于90～110％(表5)。表5本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的含量测定实施例11应用实施例(艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂的稳定性研究)影响因素试验：(1)高温试验：取同批复方ADP-SMZ注射剂，置密封洁净容器中，在60℃条件下放置10天，于第5天和第10天取样，检测有关指标。如供试品发生显著变化(如制剂含量下降5％)，则在40℃下同法进行试验。如60℃无显著变化，则不必进行40℃试验。(2)强光照射试验：取同批复方ADP-SMZ注射剂，置密封洁净容器中，在照度(4500±5001x)的条件下放置10d。分别于0、5、10d取样，按稳定性重点考察项目对复方ADP-SMZ注射剂 含量、性状、pH值等项目进行检测并记录。结果显示，制剂的颜色、性状、pH值、含量等重点检测项目的变化(见表6)，由此看出本发明的兽用艾地普啉磺胺甲基异恶唑复方注射剂在高温和强光条件下不稳定，不适宜在高温和强光条件下保存。表6ADP-SMZ复方制剂影响因素实验*有关物质按面积归一化法计算加速实验：取3批本发明制备的复方ADP-SMZ注射剂适量，模拟上市包装，在温度30℃±2℃、相对湿度60％±5％的条件下放置6个月。分别于0、1、2、3、6月末取样，按稳定性重点考察项目对复方ADP-SMZ注射剂含量、性状、pH值等项目进行检测并记录。注射液样品颜色、性状、pH值、含量等各项指标均无明显变化，表明本制剂对温度、湿度稳定(见表7)。表7本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑注射剂加速试验结果表7的说明：*有关物质按面积归一化法计算。长期稳定性试验：取3批本发明制备的复方ADP-SMZ注射剂适量，模拟上市包装，在温度25±2℃、相对湿度60±5％的条件下放置12个月。分别于0、3、6、9、12月末取样，按稳定性重点考察项目对复方ADP-SMZ注射剂含量、性状、pH值等项目进行检测并记录。12个月以后，仍需继续考察，分别与18、24、36月末取样进行检测，将结果与0月比较以确定药品的有效期(见表8)。表8本发明的兽用艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂长期试验结果*有关物质按面积归一化法计算。有效期的计算：按长期试验测定的数值，以标示量％对时间做直线回归，得到回归方程。求出各时间点标示量的计算值，计算出标示量95％单侧可信限的置信区间，按回归方程分别求出各时间点标示量的计算值(y′)，再计算标示量(y′)95％单侧可信限的置信区间，y′±z式中tn-2为概率为0.05，自由度为n-2的t单侧分布值，可从统计学中查到，n为组数。X0为给定自变量，为自变量X的平均值。Q＝Lyy-bLxy；b为直线斜率；Lyy为y的离差平方和；Lxy为xy的离差乘积之和。Lyy＝∑y2-(∑y)2/N，Lxy＝∑xy-∑x∑y/N计算出y′-z值，以时间对y′-z值进行直线回归，得到置信区间下限值回归方程，取y′-z＝90(即一般含量合格最低要求)，计算出药物的有效期。本长期稳定性试验只检测了9个月，根据中花人民共和国农业部对制剂稳定性试验要求的规定，计算ADP-SMZ复方注射剂的有效期，经计算得出三批样品中ADP和SMZ的回归方程见表9。表9三批本发明制备的制剂中艾地普啉和磺胺甲基异恶唑的下限值回归方程实施例12应用实施例(艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂在猪体内的生物利用度试验)选18头健康杜长大三元杂交(杜洛克×长白×大约克，为全国推广的商用品种)商品猪(20±5kg)，给药前1d称重。将18头猪随机分成A、B、C3组，每组6头，按3交叉3周期设计进行试验(见表10)。表10生物利用度实验中交叉试验设计肌肉注射给药。给药后采集前腔静脉血液3～5mL，经提取净化后，高效液相色谱法测定血浆中艾地普啉和磺胺甲基异恶唑的含量。本试验建立了ADP和SMZ的检测方法。血浆中的内源性物质对ADP和SMZ均无干扰，杂质与药物峰分离良好，色谱图见图3、4、5、6、7。给药后，各采样点艾地普啉和磺胺甲基异恶唑的平均血药浓度见表11；用药动学软件Winnorlin的非房室模型对数据进行拟合，药动学参数见表12；艾地普啉水溶液、磺胺甲基异恶唑水溶液和复方制剂中艾地普啉和磺胺甲基异恶唑在18头猪中的平均血药浓度时间曲线见图7。表1118头猪肌注艾地普啉和磺胺甲基异恶唑水溶液及艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂后各采样点的平均血药浓度(Mean±S.D.，μg/mL)表11说明：ND：低于定量限或未检出：未测定或未采样表12Winnorlin非房室模型拟合药动学参数注：表中λz：末端消除速率常数；T1/2λz：消除半衰期；Tmax：达到峰浓度的时间；Cmax：峰浓度；AUCall：药时曲线下面积；Vz：表观分布容积；CLz：消除速率常数；MRT：平均滞留时间。18头猪肌肉注射本发明制备的复方制剂后，ADP的Tmax和T1/2λ分别为1.06±0.16h、12.96±1.10h，比水溶液短；Cmax为1.79±0.10μg/mL，比水溶液低。SMZ的Tmax为1.94±0.17h，比水溶液短；T1/2λ为4.84±0.93h，比水溶液的长，Cmax为15.47±0.81μg/mL，比水溶液低。与水溶液相比，复方制剂的药物达峰时间短，吸收更快；表观分布容积增大，峰浓度降低，消除速率加快，但是都不明显，由此可以看出，ADP与SMZ合用后，对ADP和SMZ的吸收和分布没有太大的影响。实施例13应用实施例(艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂在猪体内的残留消除规律实验)20头健康猪常规饲养7d后，肌肉注射本发明制备的艾地普啉-磺胺甲基异恶唑复方注射剂(艾地普啉5mg/kg，磺胺甲基异恶唑25mg/kg)，注射1次，并标记注射部位。于给药后的1，3，6，15，30d分别屠宰，每次随机屠宰4头，分离背最长肌、肝脏、肾脏、注射部位肌肉和腹部脂肪。样品经提取净化后，高效液相色谱法测定各组织中艾地普啉和磺胺甲基异恶唑的含量。根据欧洲药品管理局(EMEA)制定的艾地普啉和磺胺甲基异恶唑在猪各组织中的最高残留限量(MRL)，采用EMEA推荐的方法，使用WT1.4软件以双侧95％置信限计算这两种药物在各组织中的休药期。20头猪单次肌肉注射复方制剂后，ADP和SMZ在各个采样时间点及各种组织中的平均浓度见表13。停药后各种组织中总残留的消除方程、半衰期和休药期见表14。表13本发明制备的复方制剂在猪可食性组织中的残留量ND：未检出。ADP残留主要集中于肝脏和肾脏中，在四种可食性组织中，肝脏中药物浓度高于其他组织中浓度，给药后30天，在五种组织中均检测不到。假定ADP在猪肝脏、肾脏、肌肉、皮脂的最高残留限量分别为50μg/kg，通过WDT公式计算出ADP在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射位点中的t1/2分别为83.5、86.6、81.5、84.5和67.3h，ADP在肝脏中消除最慢，肾脏中消除最快；在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射位点的休药期分别为21、24、24、18和23d。表14本发明制备的复方制剂在猪各组织中残留消除方程、半衰期和休药期SMZ残留主要集中于肝脏和肾脏中，在四种可食性组织中，肝脏中药物浓度高于其他组织中浓度，其次为肾脏，给药后30天，仅在注射位点检测到药物浓度。SMZ在猪肝脏、肾脏、肌肉、皮脂的最高残留限量分别为100μg/kg，通过WDT公式计算出SMZ在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射位点中的t1/2分别为48.1、47.5、60.5、73.7和75.3h，除注射位点外，SMZ在脂肪中消除最慢，肌肉中消除最快；在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和注射位点的休药期分别为16、15、18、20和31d。