专利名称：具有fret效应的还原敏感型荧光纳米胶束及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因及药物载体领域，特别是涉及一种具有FRET效应的还原敏感型荧光纳米胶束及其制备方法。
背景技术：
突光共振能量转移(FluorescenceResonance Energy Transfer, FRET)技术作为一种经典的荧光技术，与荧光成像技术结合，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面具有广泛的应用。FRET是指在两个不同的荧光基团中，当作为供体的荧光基团与作为受体的荧光基团的吸收光谱有一定重叠，并且这两个荧光基团的距离在广10纳米时，荧光能量由供体分子向受体分子转移。使得供体分子的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体分子发射的荧光却大大增强。近年来，具有环境响应性的智能型自组装形成的聚合物胶束作为药物载体在生物医学领域显示了良好的应用前景，引起了越来越多科学工作者的关注。智能型聚合物纳米胶束利用某些链段对环境的敏感性，在相应条件下使其发生降解、聚合物结构的相转变或体积相转变等，从而达到控制药物释放的目的。目前，已合成了多种基于一种或多种环境响应型的智能化的聚合物纳 米胶束，如Jun Chen等合成了一种pH值和还原敏感双重响应的聚合物，用于细胞内的阿霉素运输，有效地增强了阿霉素在细胞内的释放。但是，同时具有FRET效应和还原敏感响应的荧光纳米胶束一直未见报道。
发明内容
基于此，有必要提供一种同时具有FRET效应和还原敏感响应的荧光纳米胶束及其制备方法。一种具有FRET效应的还原敏感型荧光纳米胶束的制备方法，包括:制备聚乙二醇-聚己内酯(mPEG-PCL);将mPEG-PCL溶于四氢呋喃(THF)中，加入三乙胺(TEA)并搅拌，再加入对硝基苯氯甲酸酯(4-nitrophenyl chlorformate, PNC),室温搅拌反应过夜，经纯化处理得到mPEG-PCL-PNC ；将胱胺二盐酸盐(cystamine dihydrochlochloride)溶于二甲基亚讽(Dimethylsulfoxide, DMS0)和吡啶的混合液中，室温搅拌4小时，将所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亚砜，混合所述胱胺二盐酸盐和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35 50 V下连续搅拌反应2 3天，在重蒸水中透析3 4天，收集透析产物，冷冻真空干燥后得到mPEG-PCL-s-s-NH2 ；将所述HiPEG-PCL-S-S-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC),所述 mPEG-PCL-s-s-NH2 与 FITC 的摩尔比为1: f 1: 5，常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，转移至重蒸水中继续透析2 3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC ；
将所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入改性4- 二甲胺偶氮苯-4'-羧酸(Dabcyl),所述mPEG-PCL-s-s-NH2与所述改性Dabcyl的摩尔比为1:1 1:5,常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，转移至重蒸水中继续透析2 3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl ；将所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分别溶于四氢呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC与mPEG-PCL-s-s-Dabcy的质量比为1:1 1:3的比例混合得到混合溶液，在搅拌的过程中滴加重蒸水，将滴加了重蒸水的混合溶液转移到重蒸水中透析2 3天，得到具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束。在其中一个实施例中，所述改性Dabcyl通过以下步骤制备:将Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入体积为所述二甲基甲酰胺的5 10倍量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下搅拌反应过夜，离心取上清，得到改性Dabcyl。在其中一个实施例中，所述制备mPEG-PCL包括步骤:将
权利要求
1.一种具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括:制备 mPEG-PCL ； 将所述mPEG-PCL溶于四氢呋喃中，加入三乙胺并搅拌，再加入PNC，室温搅拌反应过夜，经纯化处理得到mPEG-PCL-PNC ； 将胱胺二盐酸盐溶于二甲基亚砜和吡啶的混合液中，室温搅拌4小时，将所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亚砜，混合所述胱胺二盐酸盐和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35 5(TC下连续搅拌反应2 3天，在重蒸水中透析3 4天，收集透析产物，冷冻真空干燥后得到 mPEG-PCL-s-s-NH2 ； 将所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入FITC，所述mPEG-PCL-s-s_NH2与所述FITC的摩尔比为1: f 1: 5，常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析f 2天，转移至重蒸水中继续透析2 3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC ； 将所述mPEG-PCL-s-s-NH2溶于二甲基甲酰胺中，加入改性Dabcyl，所述mPEG-PCL-s-s-NH2与改性Dabcyl的摩尔比为1:1 1: 5，常温下搅拌，反应过夜，在二甲基甲酰胺中透析广2天，转移至重蒸水中继续透析2 3天，真空冷冻干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl ;及 将所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分别溶于四氢呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC与mPEG-PCL-s-s-Dabcy的质量比为1:1 1:3的比例混合得到混合溶液，在搅拌的过程中滴加重蒸水，将滴加了重蒸水的混合溶液转移到重蒸水中透析2 3天，得到具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述改性Dabcyl通过以下步骤制备:将Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入体积为所述二甲基甲酰胺的5 10`倍量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下搅拌反应过夜,离心后取上清,得到改性Dabcyl。
3.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述制备mPEG-PCL包括步骤: 将d用氢化钙干燥，减压蒸馏；取甲基化的聚乙二醇，于80°C抽真空I小时；往所述甲基化的聚乙二醇中加入辛酸亚锡和干燥的在氮气保护下140°C反应8小时后，加入氯仿溶解反应产物，再用正己烷沉淀，抽滤，真空干燥后得到mPEG-PCL。
4.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述mPEG-PCL与所述三乙胺的摩尔比为300:1 100:1。
5.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述mPEG-PCL与所述PNC的摩尔比为0.1: f 1:1。
6.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述mPEG-PCL-PNC与胱胺二盐酸盐的摩尔比为0.01: f 0.1:1。
7.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述纯化处理为将反应过夜的反应液经离心除去三乙醇胺盐酸盐，取上清液，加入体积为所述上清液的I(T20倍的冰乙醚，抽滤，将固体物溶于四氢呋喃中，加入体积为所述四氢呋喃的1(T20倍的冰乙醚，抽滤。
8.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述在搅拌的过程中滴加重蒸水的体积为所述混合溶液的体积的1/2 1。
9.根据权利要求1所述的具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述将滴加了重蒸水的混合溶液转移到重蒸水中透析2 3天中采用透析袋进行透析，所述透析袋为截留分子量为10001500的透析袋。
10.一种具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束，其特征在于，包括mPEG-PCL-s-s-FITC 和 mPEG-PCL-s-s-Dabcyl，其中，具有 FRET 效应的供体 FITC 和受体Dabcyl 通过共价交联接合到mPEG-PCL-s-s_NH2上，且所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl 的质量比为 1:1 1:3。
全文摘要
本发明涉及一种具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束及其制备方法。该具有FRET效应的还原敏感型聚合物纳米胶束包括mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl，其中，具有FRET效应的供体FITC和受体Dabcyl通过共价交联接合到mPEG-PCL-s-s-NH2上，且所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl的质量比为1:1～1:3。
文档编号A61K9/107GK103102479SQ201210568269
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者蔡林涛, 石碧华, 刘朋, 龚萍, 王碧 申请人:深圳先进技术研究院