靶向交叉呈递的树突状细胞的疫苗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及靶向树突状细胞的重组融合蛋白及其用途。特别地，本发明涉及包含抗体组件和靶向组件的融合蛋白，和此类融合蛋白引发免疫应答的用途。
【专利说明】靶向交叉呈递的树突状细胞的疫苗体
[0001]与相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2012年9月23日提交的未决的美国临时专利申请号61/538，186的优先权，其内容以其整体通过引用并入。
发明领域
[0002]本发明涉及靶向树突状细胞的重组融合蛋白及其用途。特别地，本发明涉及包含革巴向组件、抗原、接头区和抗体组件的融合蛋白(疫苗体(vaccibodies)),和此类同型二聚体融合蛋白或编码此类融合蛋白的DNA引发免疫应答的用途。
[0003]发明背景
DNA接种是技术上简单的诱导免疫应答的方法。然而，小动物中的成功在临床试验中仍未再现。目前寻求增加DNA疫苗的效力的若干策略。
[0004]蛋白抗原对抗原呈递细胞(APC)的靶向可以改善T细胞和B细胞应答。重组免疫球蛋白(Ig)分子非常适合于该目的。例如，短抗原表位可以替换Ig恒定结构域中的β链之间的环，而靶向抗原递送通过用对于APC上的表面分子特异性的可变(V)区装配重组Ig而获得。然而，此类策略不适合含有未鉴定表位的更大抗原，此外具有短T细胞表位的重组Ig分子未能引发针对构象表位的抗体。为了克服这些局限性，已生成基于靶向Ig的同型二聚体DNA疫苗(疫苗体)，其表达大小至少550 aa的传染性或肿瘤抗原，并维持构象表位。
[0005]由于效力的缺乏，迄今为止没有DNA疫苗批准用于人类使用。另外，不存在可用于几种传染病的有效疫苗。特别地，没有治疗性DNA癌症疫苗已批准用于人类使用。
[0006]需要的是具有改进效力的DNA疫苗。
[0007]发明概述
本发明涉及靶向树突状细胞的重组融合蛋白及其用途。特别地，本发明涉及包含靶向组件、抗原、接头区和抗体组件的融合蛋白(疫苗体)，和此类同型二聚体融合蛋白或编码此类融合蛋白的DNA引发免疫应答的用途。
[0008]相应地，本发明的实施方案提供了融合多肽、编码多肽的核酸以及编码融合多肽的载体和包含载体的细胞，其中所述融合多肽包含靶向单元和抗原单元，所述靶向单元包含与人或小鼠XclI或Xcl2的氨基酸序列(例如如由SEQ ID NO 1、2或3描述的)具有至少80%序列同一性(例如至少85%、90%、95%、99%或100%同源性)的氨基酸序列，所述靶向单元和所述抗原单元通过二聚化基序连接。在一些实施方案中，融合多肽优选与交叉呈递的DC上的Xcrl结合。在一些实施方案中，人或小鼠Xcll或Xcl2的变体或同源物显示出比天然人或小鼠Xcll或Xcl2更高的对于Xcrl的亲和力。
[0009]在一些实施方案中，抗原单元是抗原scFv、细菌抗原、病毒抗原或者癌症相关抗原或癌症特异性抗原。在一些实施方案中，接头例如(G4S)3接头连接抗原scFv中的VH和VL0在一些实施方案中，抗原scFv来源于由骨髓瘤或淋巴瘤细胞产生的单克隆Ig。在一些实施方案中，抗原单元是端粒酶或其功能部分。在一些实施方案中，端粒酶是hTERT。在一些实施方案中，抗原单元是黑素瘤抗原。在一些实施方案中，黑素瘤抗原是酪氨酸酶、TRP-1或TRP-2。在一些实施方案中，抗原单元是前列腺癌抗原。在一些实施方案中，前列腺癌抗原是PSA。在一些实施方案中，抗原单元是宫颈癌抗原。在一些实施方案中，宫颈癌抗原选自E1、E2、E4、E6、E7、L1和L2。在一些实施方案中，抗原单元来源于细菌。在一些实施方案中，细菌来源的抗原单元是结核病抗原。在一些实施方案中，细菌来源的抗原单元是布鲁氏菌病抗原。在一些实施方案中，抗原单兀来源于病毒。在一些实施方案中，病毒来源的抗原单元来源于HIV。在一些实施方案中，HIV来源的抗原单元来源于gpl20或Gag。在一些实施方案中，抗原单元选自流感病毒血凝素(HA)、核蛋白和M2抗原；和单纯疱疹2抗原糖蛋白D。
[0010]在一些实施方案中，多肽作为二聚体存在。在一些实施方案中，二聚化基序包含铰链区和任选的促进二聚化的另一个结构域，例如免疫球蛋白结构域，任选通过接头连接。在一些实施方案中，二聚化结构域包含人IgG3 二聚化结构域(hCH3)。在一些实施方案中，铰链区具有形成一个、两个或几个共价键的能力。在一些实施方案中，共价键是二硫键。在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基末端C结构域，或与所述C结构域基本上同源的序列。在一些实施方案中，羧基末端C结构域来源于IgG。在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。在一些实施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用同型二聚化的能力。在一些实施方案中，非共价相互作用是疏水性相互作用。在一些实施方案中，二聚化结构域不包含G2结构域。在一些实施方案中，二聚化基序由通过接头与人IgG3的Ch3结构域连接的铰链外显子hi和h4组成。在一些实施方案中，连接铰链区和促进二聚化的另一个结构域例如免疫球蛋白结构域的接头是G3S2G3SG接头。在一些实施方案中，抗原单元和二聚化基序通过接头例如GLSGL接头连接。在一些实施方案中，与天然同型二聚体蛋白质的亲和力相比较，优选的变体同型二聚体蛋白质具有增加的对于Xcrl趋化因子受体的亲和力。
[0011]在一些实施方案中,本发明提供了编码上文描述的疫苗体的核酸分子。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子包括在载体中。在一些实施方案中，本发明提供了包含载体的宿主细胞。在一些实施方案中，配制根据本发明的核酸分子用于向患者施用，以诱导所述患者中同型二聚体蛋白质的产生。
[0012]在一些实施方案中，根据本发明的疫苗包含药学上可接受的载体和/或佐剂。在一些实施方案中，本发明提供了针对癌症或传染病的疫苗，其包含免疫有效量的如上所述的同型二聚体蛋白质或编码单体蛋白质的核酸分子，所述单体蛋白质可以形成上文描述的同型二聚体蛋白质，其中所述疫苗能够引发T细胞和/或B细胞免疫应答(优选两者)，并且其中同型二聚体蛋白质含有对于所述癌症或传染病特异性的抗原单元。
[0013]在一些实施方案中，由根据本发明的疫苗或药物组合物治疗的癌症是多发性骨髓瘤或淋巴瘤、恶性黑素瘤、HPV诱导的癌症、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和/或肝癌。在一些实施方案中，由根据本发明的疫苗或药物组合物治疗的传染病选自流感、疱疹、CMV、即￥、耶￥、布鲁氏菌病、!11￥、肥￥-2和结核病。
[0014]本发明进一步提供了包含融合多肽的试剂盒。
[0015]本发明的另外实施方案提供了诱导免疫应答的方法，其包括在使得个体生成对抗原单元的免疫应答的条件下给所述个体施用本文描述的疫苗组合物。
[0016]在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于制备如上所述的同型二聚体蛋白质的方法，该方法包括将编码单体蛋白质的核酸分子引入细胞群内，所述单体蛋白质可以形成上文描述的同型二聚体蛋白质；培养细胞群；和收获并纯化表达自细胞群的同型二聚体蛋白质。
[0017]另外的实施方案在本文中描述。
[0018]附图简述
图1显示Xcll靶向的疫苗体的结构和功能。(A)具有作为靶向单元的小鼠Xcll、二聚化结构域和病毒抗原单元的疫苗体结构。(B)使用本发明的实施方案的融合蛋白的靶向示意图。Xcl1-疫苗体结合表达Xcrl的DC亚群，其随后将在MHC-1上的病毒抗原的肽呈递给CD8+ T细胞，因此诱导能够杀死病毒感染细胞的细胞毒性T细胞应答。
[0019]图2显示由来自非淋巴和淋巴器官的DC亚群的XCRl表达。A，限定每个器官中的DC亚群的门控策略。B-J，显示代表C57BL/6J和XCRl_bGal小鼠的多个器官的DC亚群中的XCRl表达的bgal酶促活性的直方图(除了其中使用重组XCLl-mCherry的E之外)。B，表皮。C，真皮。D-F，CLN。F，通过在C57BL/6J小鼠中的bGal+细胞百分比扣除XCRl-bGal小鼠中的bGal+细胞百分比来计算bGal+细胞的百分比。G，CLN驻留⑶Ilb+和⑶8a+ DC(左图)以及CLN-mig CDllb+、CD1032和CD103+ DC (右图)中的CADMl表达。H，肝、肺和肠。I，来自MedLN和MLN的Mig-DC亚群。J，来自脾、MedLN和MLN的LT驻留DC亚群。
[0020]图3显示Xcll靶向的疫苗体的表征。A)疫苗体在体内作为由靶向单元(Xcll)、二聚化单元(hCH3)和抗原单元(mCherry)组成的二聚化蛋白质表达。为了生成推定不结合Xcrl的突变体，我们生成其中半胱氨酸(cystein)ll突变为丙氨酸(CllA)的突变Xcll。Xcll靶向和假定的非靶向CllA突变型疫苗体在293E细胞中表达，并且通过B)使用针对mCherry的抗体的蛋白质印迹，和C)使用针对Xcll的抗体的ELISA进行分析。D)Xcll_和Xcll (CllA)-mCherry疫苗体与从脾中分离的驻留⑶8a+ DC (左图^POTllb+ DC的结合。与Xcll-mCherry、Xcll (CllA) -mCherry 一起孵育的DC和不与疫苗体一起孵育的DC。E)Xcll-和Xcll (CllA)-mCherry与从Xcrl 7小鼠中分离的CD8a+ DC的结合的缺乏。
[0021]图4显示针对靶向Xcll的HA疫苗体的体液免疫应答。对单独的HA、NIP-HA (对于半抗原NIP特异性的非靶向疫苗体)和CllA突变体进行比较。a)就抗HA抗体分析免疫后14天获得的血清样品。b)在免疫后第14天，进一步就IgGl和IgG2a同种型分析血清免疫球蛋白应答。监控Balb/c小鼠中的IgG2a c)和IgGl d)的血清水平共18周，其中血清样品在第1、3、5、7、10、14和18周时收集。e)当滴定Balb/c小鼠中的Xcll-HA疫苗体DNA时的IgG2a血清应答。括号中的数目指示用于免疫小鼠的DNA总量。
[0022]图5显示对于在MHC-1分子Kd上呈递的HA肽IYSTVASSL特异性的⑶8+ T细胞的五聚体染色。a)从引流淋巴结中分离的细胞对⑶8表达(Rl)进行门控，并且分析PE缀合的IYSTVASSL五聚体的结合。右上象限中的数目指示五聚体阳性⑶8+ T细胞的百分t匕。b)包括所有对照的五聚体染色概要。我们观察到与NIP-HA或CllA-HA接种的小鼠相比较，在Xcll-HA接种的小鼠中的五聚体阳性⑶8+ t细胞中的显著增加(曼-怀二氏(Mann-ffhi tney))。
[0023]图6显示Xcll-HA疫苗体保护小鼠不受流感A/PR/8/34 (HlNl) (PR8)的致死攻击。a)在用Xcll-HA、C11A-HA、HA或NaCl免疫后，将小鼠在免疫后14天用5x致死剂量的PR8进行攻击，并且监控重量减轻。实验在第7天时结束。b)在a)中第7天的重量数据概要，其还包括NIP-HA对照。在用Xcll-HA以及非靶向对照NIP-HA和CllA-HA接种的小鼠之间观察到重量中的显著差异。c)在免疫后14天用5x致死剂量的PR8攻击前,用于免疫小鼠的Xcll-HA DNA的滴定。括号中的数目指示用于免疫小鼠的DNA总量。d)在免疫后26周用PR8病毒进行攻击小鼠，并且监控重量减轻直至攻击后第9天。
[0024]图7提供了表I。
[0025]图8是比较鼠以及人Xcll和人Xcl2疫苗体的表达和分泌的图。
[0026]图9a和9b是比较在用Xcll和Xcl2疫苗体免疫后的免疫应答的图。
[0027]图1Oa和1b是比较在用Xcll和Xcl2疫苗体免疫后14天用流感病毒攻击后的重量减轻的图。
[0028]定义
如本文使用的，术语“免疫应答”指通过个体的免疫系统的应答。例如，免疫应答包括但不限于下述中的可检测的改变(例如增加)=Toll受体活化、淋巴因子(例如细胞因子(例如Thl或Th2型细胞因子)或趋化因子)表达和/或分泌、巨噬细胞活化、树突状细胞活化、T细胞活化(例如CD4+或CD8+ T细胞)、NK细胞活化和/或B细胞活化(例如抗体生成和/或分泌)。另外的免疫应答实例包括免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽))与MHC分子的结合和诱导细胞毒性T淋巴细胞("CTL")应答，诱导针对免疫原性多肽来源于其的抗原的B细胞应答(例如抗体产生)、和/或T辅助淋巴细胞应答、和/或迟发型超敏反应(DTH)应答，免疫系统细胞(例如T细胞、B细胞(例如任何发育阶段的(例如浆细胞)的增殖(例如细胞群的生长)，和抗原由抗原呈递细胞的增加的加工和呈递。免疫应答可以是针对个体的免疫系统识别为外源的免疫原(例如来自微生物(例如病原体)的非自身抗原或识别为外源的自身抗原)。因此，应当理解，如本文使用的，“免疫应答”指任何类型的免疫应答，包括但不限于先天性免疫应答(例如Toll受体信号传递级联的活化)、细胞介导的免疫应答(例如由T细胞(例如抗原特异性T细胞)和免疫系统的非特异性细胞介导的应答)和体液免疫应答(例如由B细胞介导的应答(例如经由抗体生成和分泌到血浆、淋巴液和/或组织液内)。术语“免疫应答”意指包含个体的免疫系统响应抗原和/或免疫原的能力的所有方面(例如针对免疫原(例如病原体)的初次应答以及获得性(例如记忆)应答，其为适应性免疫应答的结果)。
[0029]如本文使用的，术语“免疫”指在暴露于能够引起疾病的微生物(例如病原体)时，免患疾病的保护(例如疾病体征、症状或病况的预防或减弱(例如抑制))。免疫可以是先天性的(例如非适应性(例如非获得性)免疫应答，其在不存在先前暴露于抗原的情况下存在)和/或获得性的(例如在先前暴露于抗原后由B和T细胞介导的免疫应答(例如其显示出对抗原增加的特异性和反应性))。
[0030]如本文使用的，术语“免疫原”指能够在个体中引起免疫应答的试剂(agent)(例如微生物(例如细菌、病毒或真菌)和/或其部分或组分(例如蛋白质抗原))。在一些实施方案中，免疫原引起针对免疫原(例如微生物(例如病原体或病原体产物))的免疫。
[0031]术语“测试化合物”指任何化学实体、药剂、药物等等，其可以用于治疗或预防身体功能的疾病(disease)、病(illness)、病(sickness)或病症,或另外改变样品的生理或细胞状态。测试化合物包含已知和潜在治疗性化合物。测试化合物可以使用本发明的筛选方法通过筛选确定为治疗性的。“已知治疗性化合物”指已显示(例如通过动物试验或施用于人的先前经验)在此类治疗或预防中有效的治疗性化合物。
[0032]如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一种意义上，它可以指组织样品。在另一种意义上，它意在包括得自任何来源的样本或培养物，以及生物制品。生物样品可以得自动物(包括人)，并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括但不限于血液制品，例如血浆、血清等等。这些实例不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。怀疑含有人染色体或与人染色体相关的序列的样品可以包含细胞、从细胞中分离的染色体(例如中期染色体的扩展(spread))、基因组DNA (在溶液中或与固体支持物结合，例如用于DNA印迹分析)、RNA (在溶液中或与固体支持物结合，例如用于RNA印迹分析)、cDNA (在溶液中或与固体支持物结合)等等。怀疑含有蛋白质的样品可以包含细胞、组织部分、含有一种或多种蛋白质的提取物等等。
[0033]当“氨基酸序列”在本文中叙述，以指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和相似术语例如“多肽”或“蛋白质”不意在使氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的、天然氨基酸序列。
[0034]如本文使用的，术语“肽”指经由肽键或经修饰的肽键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。如本文使用的，术语“二肽”指经由肽键或经修饰的肽键连接的两个氨基酸的聚合物。
[0035]术语“野生型”指当从天然存在的来源中分离时，具有该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最频繁观察到且因此任意指定为基因的“正常”或“野生型”形式的基因。相比之下，术语“经修饰的”、“突变体”和“变体”指当与野生型基因或基因产物相比较时，展示在序列和或功能性质中的修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。注意到可以分离天然存在的突变体；这些通过下述事实得到鉴定:当与野生型基因或基因产物相比较时，它们具有改变的特征。
[0036]如本文使用的术语“片段”指这样的多肽，与天然蛋白质相比较，其具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余氨基酸序列与由全长cDNA序列推导的氨基酸序列中的相应位置相同。片段通常长至少4个氨基酸，优选长至少20个氨基酸，通常长至少50个氨基酸或更长，并且跨过对于组合物与其多种配体和/或底物的分子间结合所需的多肽部分。
[0037]如本文使用的，术语“纯化的”或“待纯化”指从样品中去除污染物。例如，抗原通过去除污染蛋白质进行纯化。污染物的去除导致样品中抗原(例如本发明的抗原)百分比中的增加。
[0038]术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。变体包括分别在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置处的插入、取代、颠换、截短和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽”、“变体”和“变体酶”意指具有这样的氨基酸序列的多肽/蛋白质，所述氨基酸序列已从天然Xcll的氨基酸序列进行修饰。变体多肽包括与Xcll具有某一百分比例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性的多肽。
[0039]“变体核酸”可以包括与能够和本文呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，变体序列与在严格条件例如50°C和0.2X SSC( IX SSC = 0.15 M NaCU0.015 M柠檬酸钠，pH 7.0)下能够与本文呈现的核苷酸序列杂交的序列互补。更特别地，术语变体包括在高度严格条件例如65°C和0.1X SSC下能够与本文呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。变体核酸的解链温度(Tm)可以比野生型核酸的Tm低约1、2或:TC。变体核酸包括与编码Xcll或编码单体蛋白质的核酸具有某一百分比例如80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的多核苷酸，所述单体蛋白质可以形成根据本发明的同型二聚体蛋白质。
[0040]如本文使用的术语“同型二聚体蛋白质”指包含通过氢键键合、离子(带电荷)相互作用、实际共价二硫键键合或这些相互作用的一些组合而保持为单个的、二聚体蛋白质的两条各自相同的氨基酸链或亚基的蛋白质。
[0041]如本文使用的术语“二聚化基序”指在抗原单元和靶向单元之间的氨基酸序列，其包含铰链区和可以促成二聚化的任选第二结构域。该第二结构域可以是免疫球蛋白结构域，并且任选地铰链区和第二结构域通过接头连接。相应地，二聚化基序作用于连接抗原单元和靶向单元，但还含有促进两个单体蛋白质二聚化成根据本发明的同型二聚体蛋白质的铰链区。
[0042]如本文使用的术语“靶向单元”指将具有其抗原的蛋白质递送给靶细胞(例如交叉呈递的树突状细胞)的单元。
[0043]术语“铰链区”指例如通过一个或多个链间共价键例如一个或多个二硫键的形成，促进二聚化的同型二聚体蛋白质的肽序列。铰链区可以是Ig来源的，例如Ig例如IgG3的铰链外显子hl+h4。
[0044]发明详述
本发明涉及靶向树突状细胞的重组融合蛋白及其用途。特别地，本发明涉及包含靶向组件、抗原、接头区和抗体组件的融合蛋白(疫苗体)，和此类同型二聚体融合蛋白或编码此类融合蛋白的DNA引发免疫应答的用途。
[0045]树突状细胞(DC)在不同解剖学位置中行使其免疫岗哨(immune sentinels)的功能。位于非淋巴组织(NLT)的实质中的DC被称为间质DC (int-DC)。这些DC输送组织抗原至引流淋巴结(LN)，其中它们被称为迁移DC (mig-DC)。在小鼠皮肤中，DC构成表皮朗格汉斯细胞(LC)和真皮DC的三个主要亚群:CDllbhiCD24 DC、CDllb_CD24+CD1032 DC和CDllbCD24+CD103+ DC (1)，下文被称为 CDllb+ DC、CD103 DC 和 CD103+ DC (表 I)。尽管LC和所有真皮DC亚群从皮肤组成性迁移至皮肤LN (CLN)，但⑶103+ DC突出作为用于将角化细胞来源的Ag呈递给CLN中的⑶8 T细胞的最有效力亚群(I)。该能力暗示淋巴组织(LT)-驻留⑶8a+ DC用于交叉呈递的高效率(I)。⑶103+ int_DC也在其他解剖学位置例如肺和肠中发现。⑶103+ int-DC和LT-驻留⑶8a+ DC的发育选择性依赖于共同的一组转录因子(2，3)。因此，这些小鼠DC群可以属于独特的一类⑶8a+型DC (I)。
[0046]⑶8a+型DC存在于人和绵羊中，其中它们的鉴定基于其与小鼠脾⑶8a+ DC共享的独特转录指纹的表达(4，5)和其对于Ag交叉呈递的效率(5 - 9)。已发表了将DC分入与组织和物种无关的五个主要亚群的通用分类法:单核细胞来源的炎性DC、LC、类浆细胞DC、⑶IIb+型DC和⑶8a+型DC (I)。趋化因子受体XCRl由在小鼠脾、人血和绵羊淋巴中的CD8a+型DC特异性表达(4-7，10)。Xcrl的功能首先由R.Kroczek的团队揭开(10)，其显示了 CD8+ T细胞交叉引发取决于它们在实验模型(其中在体内施用与抗CD205 Ab偶联的OVA或表达OVA的同种异体前B细胞)中分泌Xcrl配体XCLl的能力。在单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染时，也发现在⑶8a+ DC上的Xcrl表达对于⑶8+T细胞应答的优化诱导是关键的(6)。
[0047]融合蛋白疫苗的实例包括例如WO 2004/076489、US20070298051、EP920522、Fredriksen AB 等人(Mol Ther 2006 ;13:776_85)以及 Fredriksen AB 和 Bogen B (Blood2007 ；110:1797-805);其每一个以其整体通过引用合并入本文。本发明的实施方案提供了重组融合蛋白，其包括靶向Xcrl的Xcll或Xcl2趋化因子(例如疫苗体)。本发明的实施方案的疫苗体提供了针对抗原的增强免疫应答特别是CD8+ T细胞应答的优点。
[0048]众多研究已显示将抗原靶向抗原呈递细胞(APC)增强免疫应答。然而，并非全部APC均具有诱导CD8+ T细胞的能力。近期出版物指示Xcrl在具有该能力的交叉呈递的DC上专一地表达。虽然寻求其他靶向方法以便将抗原靶向交叉呈递的DC(例如靶向DEC205)，但这些受体通常也在其他APC群上表达。经由Xcll或Xcl2的靶向因此确保高度特异性靶向方法。
[0049]因此，本发明的实施方案提供了包含与免疫球蛋白和/或免疫原融合的人或小鼠Xcll或Xcl2的融合蛋白。Xcll和Xcl2将融合多肽靶向受体Xcrl。Xcll由Genbank登记号NM_002995 (人核酸)和NM_008510 (小鼠核酸)描述。本发明的实施方案进一步利用Xe 11的变体、同源物和模拟物(下文更详细地描述的)。
[0050]人和小鼠Xcl I多肽的序列由
ν?Π?'?ν?.Ι?Ι^Χ?'νΝΙ-ΟΙ^ΚΙ.Ρν^ΚΙΚΙ?Ι?ν?'Χ?ΛΜΚΛν?Ι-'νΤΚΚ?ΙΙ.ΚΚ'ΛΙ?ΡΙ?ΛΚ?ννΚAAIKl'VIMiKAXl'KKNMAfflVPI'iiAQR^rSl'Al'riJiX； (SEQ ID NO:1 ;小鼠)和ViKliVSIiKRlX'VSIJl'QRl-FVSRIKl'Til'niCLSLRAVini'KRCil.KVt'ADPQA'nVVRI)
VVRSMI>RK.SXTRN^MIQI'KFIXITQQSTMVWri；I'Ct (SEQ ID NO: 2 ;人)描述。人 Xcl2 的氨基酸序歹I」由 VCKltVSHRRIX'VSI/ll'QK1.PVSRlKl'TITil-X1.SI^AVIIi'rKKiH.KVC'ADPQAI'WVRDVVHSMIWKSNTRNNMjyTKFIXTrQQSTNTAVT1.TC? (SEQ ID NO:3 ;人)和核酸序列ΛΤ(1Λ15Λ( --Χ ?Χ WR:( ?Χ;(!α+Γ?Γ( ?Τ(;?:Λ‘Γ( T1: ;<:Τ( ?+Γ—ΓΓ,Μ.Τ( K --ΑΓΛΤΓ《;ΤCM ?ΛΛ< ?<'ιΤ(Π'Λ(ΜΚ；Λ(ΓΓ--ΛΛ< ;?ΧΤΓΛΓΛΤΛ< ?( ?Λ(?(;ΛΓΓΤ? ;—『(7TCJAi ?( *( ?ΓΛΓΤΛΓC X ?( K 'C LM.?( ；C X 'AC ?ΠΜ K 'Λ? ΙΑΛ?Ι 'AAdAVi ?'Λ? 'AC *( VViX 'AC XJC ?ΛΛΙ K H:'TC X Tl*
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TCiIt !AC VCn ?Λ< ?ΧΜ Κ?'Λ? t (SEQ ID NO:4 ;人)描述。天然 Xcl2 表达具有 21 个氨基酸的信号序歹 |J: M K1.1.11.Al J X ?IC *ΗΙ:ΓΛ YIVI ;:t H SI ?) NO: 51。
[0051]本发明的实施方案的示例性融合蛋白显示于图1中。在一些实施方案中，融合蛋白包含作为靶向单元的Xcll (Xcl2可以代替Xcll)、人IgG3 二聚化结构域(hCH3)和由抗原组成但不限于抗原的抗原单元。二聚化导致疫苗分子就靶向单元(Xcll或Xcl2)和抗原而言是二价的。本发明并不限于特定机制。实际上，机制的理解不是实践本发明所需的。但是，考虑将疫苗体靶向交叉呈递的DC上的Xcrl诱导MHC-1上的病毒肽呈递给⑶8+ T细胞。一旦活化，后者随后可以杀死呈递相同肽/ MHC复合物的病毒感染的细胞或其他靶向的细胞。
[0052]在本发明的实施方案开发过程期间进行的实验证实:当与使用流感病毒血凝素(HA)作为抗原单元的非靶向疫苗体疫苗体相比较测试时，Xcll/2靶向的疫苗体作为DNA疫苗表现更佳。Xcll/2靶向的疫苗体诱导更强的IgG2a抗体应答，和在小鼠中针对致死流感感染的更佳保护(参见例如实施例1和图4-6)。
[0053]本文描述的实验生成疫苗体构建体，其含有作为靶向单元的Xcll，并组合有荧光蛋白质mCherry以及来自流感病毒的病毒抗原血凝素(HA)。最初,评估Xcll-mCherry疫苗体的表达和分泌。对从淋巴结或皮肤富集的DC分析结合。Xcll-mCherry仅观察到与⑶8+驻留DC和⑶103+迁移DC结合，其两者均已知在MHC-1上交叉呈递抗原(图2_3)。为了评估在疫苗设定中的Xcll靶向的效应，我们使用Xcll-HA疫苗体给小鼠接种，并且随后收获血清样品以评估IgG水平。Xcll-HA诱导强且持久的IgG2a应答。接下来，评估Xcll-HA保护小鼠不受流感病毒的致死攻击的能力。在用25 Pg DNA的单次接种后，用Xcll-HA接种的小鼠完全获得保护免受病毒，并且我们能够滴定用于免疫小鼠的DNA量下至4.16 μδ,并且仍获得完全保护。这指示Xcll/2靶向提供了用于诱导保护性免疫应答的有效力的方法。
[0054]根据本发明的融合蛋白疫苗(例如疫苗体)可以是基于重组Ig的同型二聚体疫苗，每条链由直接连接至Ig铰链和CH3的靶向单元构成，其组合诱导共价同型二聚化。
[0055]优选构建包含Xcll/2多肽(包括其变体)和不同抗原单元的融合蛋白且作为功能蛋白表达。特别地，本发明涉及Xcll/2及其天然同种型在融合疫苗中的利用，以将抗原递送靶向至抗原呈递细胞。在特别优选的实施方案中，抗原呈递细胞是交叉呈递的树突状细胞或呈递Xcrl的其他APC。在本发明内包括的是编码融合蛋白的DNA疫苗，所述融合蛋白将抗原递送靶向在专门的抗原呈递细胞(APC)上的Xcll/2受体(Xcrl)。在优选实施方案中，考虑将疫苗体靶向交叉呈递DC上的Xcrl诱导在MHC-1上的病毒肽对⑶8+ T细胞的呈递。一旦活化，后者随后就可以杀死呈递相同肽/MHC复合物的病毒感染的细胞。
[0056]根据本发明的重组蛋白质可以是用于疫苗(包括癌症疫苗)的人抗体样分子。这些分子也称为疫苗体，结合APC且引发T细胞和B细胞免疫应答。此外，考虑疫苗体与APC 二价结合，以促进强免疫应答的更有效诱导。疫苗体优选包含单体单元的二聚体，其由对APC上的表面分子具有特异性的靶向单元组成，所述靶向单元通过二聚化基序例如铰链区和C Y 3结构域与抗原单元连接，后者在COOH末端或NH2末端中。本发明还涉及编码该重组蛋白质的DNA序列，涉及包含这些DNA序列的表达载体，包含所述表达载体的细胞系，涉及优选通过借助于疫苗体DNA、疫苗体RNA或疫苗体蛋白质的免疫治疗哺乳动物，和最后涉及包含此类分子的药剂和试剂盒。
[0057]可以构建根据本发明的蛋白质中的二聚化基序，以包括铰链区和免疫球蛋白结构域(例如C Y 3结构域)，例如羧基末端C结构域(Ch3结构域)、或与所述C结构域基本上同源的序列。铰链区可以是Ig来源的，并且通过形成一个或多个链间共价键例如一个或多个二硫键促成二聚化。另外，它充当结构域间的柔性间隔区，其允许两个靶向单元与以可变距离表达的APC上的两个靶分子同时结合。免疫球蛋白结构域通过非共价相互作用例如疏水性相互作用促成同型二聚化。在优选实施方案中，CH3结构域来源于IgG。这些二聚化基序可以与其他多聚化基序(例如来自其他Ig同种型/亚类)交换。优选地，二聚化基序来源于天然人蛋白质例如人IgG。
[0058]应当理解二聚化基序可以具有就抗原单元和靶向单元而言的任何定向。在一个实施方案中，抗原单元在二聚化基序的COOH末端中，而靶向单元在二聚化基序的N末端中。在另一个实施方案中，抗原单元在二聚化基序的N末端中，而靶向单元在二聚化基序的COOH末端中。
[0059]通过引用在此并入的国际申请WO 2004/076489公开了可以根据本发明使用的核酸序列和载体。
[0060]根据本发明的蛋白质可以适合于针对任何起源的任何多肽的免疫应答的诱导。包括特异性表位的具有足够长度的任何抗原序列可以用作根据本发明的蛋白质中的抗原单元。因此，在一些实施方案中，抗原单元包含具有至少9个氨基酸的氨基酸序列，所述至少9个氨基酸对应于编码此类抗原单元的核酸序列中的至少约27个核苷酸。此类抗原序列可以来源于癌症蛋白质或传染原。此类癌症序列的实例是端粒酶，更具体而言hTERT、酪氨酸酶、TRP-1/ TRP-2黑素瘤抗原、前列腺特异性抗原和独特型。传染原可以具有细菌起源例如结核病抗原和来自布鲁氏菌病的0MP31，或具有病毒起源，更具体而言HIV来源的序列如例如gpl20来源的序列，来自HSV-2的糖蛋白D，和流感病毒抗原如血凝素、核蛋白(nuceloprotein)和M2。此类序列在疫苗体形式中的插入还可以导致免疫应答的两臂的活化。或者，抗原单元可以是抗体或其片段，例如来源于由骨髓瘤或淋巴瘤细胞产生的单克隆Ig的C末端scFv，其在患有B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的患者中也称为骨髓瘤/淋巴瘤M组分。
[0061]例如通过肌内或皮内注射连同或不连同随后的电穿孔，本发明的疫苗体蛋白质、疫苗体DNA或疫苗体RNA可以用于个体的免疫。
[0062]根据本发明的蛋白质的靶向单元通过与趋化因子受体结合将蛋白质靶向APC。在特别优选的实施方案中，趋化因子受体是Xcrl。
[0063]根据本发明的融合蛋白的多个单元可以经由标准分子生物学方法可操作地连接，并且DNA转染到合适宿主细胞例如NSO细胞、293E细胞、CHO细胞或C0S-7细胞内。转染子产生且分泌重组蛋白质。
[0064]本发明进一步涉及包含根据本发明的基于上述重组体的蛋白质、DNA/RNA序列或表达载体的药剂。适当时，该药剂另外包含药学上可接受的载体。合适的载体和此类药剂的制剂是本领域技术人员已知的。合适的载体是例如磷酸盐缓冲的普通盐溶液、水、乳状液例如油/水乳状液、湿润剂、无菌溶液等。药剂可以口服或肠胃外施用。肠胃外施用的方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内(intrathekal)、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。合适剂量由主治医师确定并且取决于不同因素，例如患者的年龄、性别和重量，施用种类等。此外，本发明涉及针对癌症或传染病的疫苗组合物，其包含免疫有效量的编码本发明分子的核酸或其简并变体，其中所述组合物能够引发T细胞和B细胞免疫应答。
[0065]本发明还涉及用于诊断、医疗或科学目的的包含疫苗体DNA、RNA或蛋白质的试剂盒。
[0066]本发明进一步涉及制备本发明的重组分子的方法，其包括将包含本发明的分子的载体转染到细胞群内；培养细胞群；收集从细胞群表达的重组蛋白质；和纯化所表达的蛋白质。
[0067]上述核苷酸序列可以优选例如在特异性启动子的控制下，插入适合于基因疗法的载体内，并且引入细胞内。在优选实施方案中，包含所述DNA序列的载体是病毒，例如腺病毒、牛痘病毒或腺伴随病毒。逆转录病毒是特别优选的。合适逆转录病毒的实例是例如MoMuLV或HaMuSV。为了基因疗法的目的，根据本发明的DNA/RNA序列还可以以胶状分散体的形式转运到靶细胞。它们包含例如脂质体或脂质复合物(lipoplexes)。
[0068]本发明还包括多肽或多肽内的结构域或基序的用途，所述多肽与本文限定的一种或多种氨基酸序列，或与具有本文限定的特定性质的多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性。本发明特别包括与Xcll/2具有一定程度的序列同一性的肽，或其同源物。此处，术语“同源物”意指与本发明的氨基酸序列或本发明的核苷酸序列具有序列同一性的实体，其中本发明的氨基酸序列优选是Xcl 1/2的氨基酸序列。
[0069]在一个方面，同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码多肽，其保留功能活性和/或增强Xcll/2多肽的活性。
[0070]在本文背景下，认为同源序列包括这样的氨基酸序列，其可以与本发明的序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。通常，同源物将包含与本发明的氨基酸序列相同的活性位点及其他功能序列。尽管同源性还可以以相似性(例如具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)的方式加以考虑，但在本发明的背景下，优选以序列同一性的方式表达同源性。
[0071]序列同一性比较可以通过肉眼或更通常地借助于可容易获得的序列比较程序进行。这些商购可得的计算机程序使用复杂的比较算法，以比对最佳反映进化事件的两条或多条序列，所述进化事件可以导致两条或多条序列之间的一种或多种差异。因此，这些算法用评分系统运行，所述评分系统对相同或相似氨基酸的比对奖分，并且对缺口的插入、缺口延伸和非相似氨基酸的比对罚分。比较算法的评分系统包括:
i )每次插入缺口的罚分指定(缺口罚分)， i i )每次现有缺口延伸额外位置的罚分指定(延伸罚分)，
iii)在相同氨基酸比对时的高分指定，和
iv)在不相同氨基酸比对时的可变分指定。
[0072]大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用此类软件用于序列比较时，优选使用缺省值。
[0073]对于不相同氨基酸比对给出的得分根据评分矩阵(也称为取代矩阵)进行指定。在此类取代矩阵中提供的得分反映下述事实:在进化过程中一个氨基酸由另一个取代的可能性改变，并且依赖待取代的氨基酸的物理/化学性质。例如，与由疏水性氨基酸取代相比较，极性氨基酸由另一个极性氨基酸取代的可能性更高。因此，评分矩阵将指定相同氨基酸的最高得分，不相同但相似氨基酸的更低得分，和不相同不相似氨基酸的甚至更低得分。最频繁使用的评分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等人(1978)，Jones等人(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff 和 Henikoff (1992))和 Gonnet 矩阵(Gonnet 等人(1992))。
[0074]用于执行此类比对的合适计算机程序包括但不限于Vector NTI (InvitrogenCorp.)以及 ClustalV、ClustalW 和 ClustalW2 程序(Higgins DG 和 Sharp PM (1988)、Higgins等人(1992)、Thompson等人(1994)、Larkin等人(2007)。不同比对工具的选择可得自ExPASy Proteomics服务器。可以进行序列比对的另一个软件实例是BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)),其可得自美国国家生物技术信息中心(Nat1nal Center for B1technology Informat1n)的网页(Altschul 等人(1990)J.Mol.B1l.215 ;403_410)。
[0075]一旦软件已产生比对，就能够计算％相似性和％序列同一性。软件通常将这作为序列比较的部分且生成数字结果。
[0076]在一个实施方案中，优选使用ClustalW软件用于进行序列比对。优选地，用Clustalff的比对用下述配对比对参数进行:
【权利要求】
1.融合多肽，其包含靶向单元和抗原单元，所述靶向单元包含与SEQID NO 1、2或3具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的融合多肽，其中所述靶向单元和所述抗原单元通过二聚化基序连接。
3.权利要求1或2中任一项的融合多肽，其中所述抗原单元选自抗原scFv、细菌抗原、病毒抗原和癌症相关抗原或癌症特异性抗原。
4.权利要求1-3中任一项的融合多肽，其中所述靶向单元包含与SEQID NO 1、2或3具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1-3中任一项的融合多肽，其中所述靶向单元包含与SEQID NO 1、2或3具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1-3中任一项的融合多肽，其中所述靶向单元包含SEQID NO 1、2或3的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的融合多肽，其中所述多肽作为二聚体存在。
8.权利要求1-7中任一项的融合多肽，其中所述二聚化结构域包含人IgG3二聚化结构域(hCH3)。
9.权利要求1-8中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽与交叉呈递的DC上的Xcrl彡口 口 ?
10.核酸分子，其编码权利要求1-9中任一项的融合多肽。
11.疫苗，其包含融合多肽或编码权利要求1-9中任一项的融合多肽的核酸。
12.权利要求11的疫苗，其中所述疫苗进一步包含药学上可接受的载体。
13.诱导免疫应答的方法，其包括在这样的条件下向个体施用权利要求11-12中任一项的疫苗组合物，所述条件使得所述个体产生针对所述抗原的免疫应答。
14.权利要求1-9的融合蛋白或权利要求11-12的疫苗在个体中产生免疫应答的用途。
【文档编号】A61K39/00GK104136039SQ201280057434
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年9月24日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】B.博根, E.富瑟姆, G.格罗德兰 申请人:奥斯陆大学