一种可注射植入剂及其制备方法

一种可注射植入剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种可注射植入剂及其制备方法。该植入剂是：在pH为7.0～7.5的磷酸氯化钠生理溶液中混合有羊膜微粒。其制备方法是：通过消毒处理、脱细胞处理、改性处理、制备羊膜微粒的步骤完成，即，将羊膜微粒作为组分A和磷酸氯化钠生理溶液作为组分B，按照质量体积比20:1～100:1震荡混匀，经高速微射流设备制备成浓度为20～100mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径为50～200μm。本发明保留了人羊膜的天然三维立体结构以及大量的天然活性成分，降低了美容注射产品在临床使用后因原料来源而引起的免疫排斥反应，适用于注射至皮下真皮层深层至皮下浅层以修复中度至重度皱纹或褶皱，具有良好的美容修复效果。
【专利说明】一种可注射植入剂及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于医学美容整形【技术领域】，具体涉及一种来源于羊膜生物材料的能够促 进自体胶原再生的可注射植入剂及其制备方法。

【背景技术】
[0002] -个世纪以来，软组织充填剂被广泛应用于美容外科手术以改善面部轮廓、修正 皱纹、填平凹陷瘢痕和填充体积(如唇部）等，现今对于软组织填充剂的需求越来越大。
[0003] 理想的软组织填充剂，应该具有便宜易得、良好的生物惰性、生物相容性和稳定 性、无毒性、无致癌性、无感染性、无急性或慢性炎症反应、易于注射和取出、能够维持长期 甚至永久的外观修复效果且恢复时间短。但至今为止，仍没有如此理想的注射式填充剂问 世。
[0004] 目前国内外常用的各类可注射软组织充填材料有以下几种，包括：
[0005] ( 1)合成高分子材料，如整形用胶原和聚甲基丙烯甲酯（PMMA)皮下植入物系统，是 以牛胶原溶液为载体，将PMMA圆形光滑微球悬浮于其中，同时含有一定量的利多卡因麻醉 齐U ;其主要缺点是，由于PMMA不可降解，长期存留于人体，存在材料移位，诱发长期慢性炎 症的使用风险，对注射部位及注射方法要求很高。
[0006] (2)牛胶原蛋白，Zyderm采用牛源性I型胶原蛋白为原料，未经交联，浓度为 35mg/mL,作用效果较短，一般可维持4个月；Zyplast，也是采用牛源性I型胶原蛋白为原 料，但经过戊二醛交联，浓度为35mg/mL，其使用效果可维持约6个月；医用胶原充填剂（商 品名：肤美达）是3. 5%牛胶原蛋白及0.3%盐酸利多卡因的生理盐水悬浮液，预填充在玻璃 注射器（含注射针）内。以上牛胶原蛋白植入剂的缺点是：在注射前30天需进行皮试以防 止患者出现过敏现象，美容修复效果持续时间较为短暂，常需要多次反复注射，注射后可能 的并发症有引起出血斑、肉芽瘤、急性过敏、延迟性过敏反应和全身不适反应等。
[0007] (3)猪胶原蛋白，如双美胶原蛋白植入剂，其原料是由猪皮纯化而成的I型胶原蛋 白经过滤除菌及无菌操作方式分散于磷酸生理食盐缓冲溶液中并充填于无菌注射针筒中 制成。其产品未经过交联处理，在体内降解周期约为4?6个月。该产品的缺点为猪源性 胶原，可能会引起排斥反应，一般动物源性胶原均需进行过敏皮试，有同类动物胶原植入剂 产品引起出血斑，肉芽瘤等并发症报道。
[0008] (4)人胶原蛋白，是从人成纤维细胞体外培养得到的细胞外基质获得的胶原植入 产品，如Dermalogen和Cosmoderm是可注射的同种异体皮胶原纤维和胶原组织基质悬液； 这些材料均由胶原和弹力纤维、葡聚糖组成。该类材料优点为来源于人，免疫排斥反应低， 不需要进行皮试测试，但制备周期较长，生产工艺较为复杂，设备要求较高，产品成本较高。
[0009] (5)人脱细胞真皮基质微粒，是将人尸体皮经过去除表皮、脱细胞、冷冻干燥、粉碎 后形成的材料，如Cymetre是微粒化可注射的异体脱细胞真皮，平均粒径约123 μ m，未经 过交联处理，文献报道唇部修复效果可维持1年以上。该材料的主要缺点是最终形式为微 粒，未制备成均匀的悬浮液，医生使用时需术前进行准备工作，即利用三通连接阀将微粒及 注射剂或麻醉剂混合，增加了手术准备时间，且混匀为手工操作，难以保证混悬液的均匀程 度。
[0010] (6)透明质酸类，包括Restylane瑞蓝等，其透明质酸原料来源于细菌发酵生产， 经过沉淀、过滤、干燥等纯化过程，并经1，4- 丁二醇二缩水甘油醚部分交联，再经过加热、 灭菌得到的透明质酸植入剂，其主要成分由经修饰（部分化学交联）的透明质酸、钠离子、 氯离子、磷酸盐缓冲体系以及注射用水组成，透明质酸浓度为20±3mg/mL，100000粒子/ mL，平均粒径约为250 μ m，溶于pH7的磷酸缓冲盐溶液中。透明质酸材料作为充填植入剂， 也有一定缺点，如少量患者出现不良反应如肿胀、红斑或皮肤硬化等；吸水性较强，有隆唇 后水肿的不良反应报道；无麻醉剂，疼痛感较强。
[0011] (7)透明质酸和纤维素类，该类产品主要是用透明质酸和纤维素进行交联处理得 到的混合成分的填充剂，如逸美，是由羟丙基甲基纤维素、透明质酸和平衡盐溶液组成的无 菌凝胶状溶液，封装在预灌封玻璃注射器（无注射针）中。该类产品成分较为复杂，生产工 艺中控制交联度难度较大，故造成该产品降解周期较短，4?6个月后基本完全降解。
[0012] 以上各种类型的美容植入产品均存在一定缺陷，且目前国家对于美容植入剂类产 品要求非常严格，如：要明确控制交联程度、粒径分布范围、分子量大小、降解周期等，需满 足的技术条件很1?。
[0013] 中国专利CN200510044005. 5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方 法，其采用新宰杀小猪皮为原料，经过去皮下组织、脱脂、碱处理、剖层、酶处理、戊二醛交 联、漂白处理以及微粒化加工，最后经包装及钴60灭菌而成。该专利制备微粒的方法只是 将皮片通过物理方法切制为边长为300?500 μ m的微粒，但微粒直径过大，无法采用直径 较小的针头注射；且最终只是将微粒进行简单包装，无法直接注射使用。
[0014] 中国专利CN95106720. 6公开了一种采用人胎盘为原料制备颗粒性胶原的方法， 其是先对胎盘进行辐照灭活病毒，清洗、粉碎后采用有机试剂提取胎盘中的胶原，最后经 浓缩透析并加入利多卡因而得到的可注射胶原溶液。该专利使用原料与本专利相近，但工 艺中使用大量有机试剂提取胶原，易存在有机试剂残留。
[0015] 中国专利CN201010117490. 5公开了一种制备注射用的透明质酸凝胶微粒的方 法。该专利所用原料为透明质酸干粉，将其用碱性溶液溶解后加入交联剂交联，制备得到透 明质酸凝胶后再采用透析方法去除交联剂。该方法可能无法彻底去除凝胶中的交联剂等试 剂残留，另外清洗效率较低，需要透析4?5天。
[0016] 中国专利CN200810007484. 7公开了一种采用人发角蛋白制备软组织填充材料的 方法，该专利利用人发中段作为原料，经过清洗、漂白、研磨加工、冻干、包装、钴60辐照处 理，将人发制备成粉体匀浆及液体人发角蛋白颗粒。该专利仅采用物理碾磨方法制备粒径 60?80 μ m的人发角蛋白颗粒匀浆，根据发明人实验经验，将不溶于水的不同固体物质进 行物理碾磨而没有筛分、均质化等后续步骤，得到的粒径分布范围通常在100?1000 μ m， 很难得到较小粒径范围。
[0017] 中国专利CN02156797. 2公开了一种注射性胶原蛋白的制备方法及其产品和应 用，该专利通过提取动物组织中的胶原蛋白纤维来制备注射性胶原蛋白，在制备过程中会 完全破坏动物组织原有结构及其他成分，损失了天然组织中具有生物活性或生物功能的天 然成分，只能起到单纯的胶原蛋白填充作用。
[0018] 由上可见，目前已上市的各种美容植入产品及国内同类专利公开的美容植入剂制 备方法均存在一定缺点，尤其是同类胶原植入剂产品除了包含胶原基质外，并未包含生物 活性因子，因此其作用仅仅是填充，当这些填充材料被机体分解吸收后，美容修复效果会减 弱或消失，因而该类植入剂产品的美容效果是暂时性的。
[0019] 羊膜，从细胞滋养层衍化而来，是胚胎双层膜的内层，由上皮细胞层，基底膜和无 血管基质组成。羊膜中包含了多种胶原蛋白成分及活性因子，包括：
[0020] (1)胶原：羊膜内含有较多的I、III、IV、V以及VII型胶原，与上皮基底层（由IV 型胶原、VII型胶原和层粘连蛋白等组成）成分相近，也包含了皮肤组成的主要成分I、III 型胶原。羊膜中含量较多的胶原为I、III、IV型胶原，占羊膜中所有胶原的90%以上。
[0021] (2)层粘连蛋白（LN):广泛分布于基底膜的透明层，紧贴细胞基底部，与IV型胶原 结合形成基底膜的骨架，影响细胞的粘附、运动，调节细胞的生长和分化。
[0022] (3)表皮生长因子（EGF):可通过DNA、RNA及蛋白质合成而促进细胞增殖与皮肤 上皮细胞上皮化。
[0023] (4)角质细胞生长因子（KGF):研究表明可促进人皮肤上皮细胞DNA合成，促进细 胞增生。
[0024] (5)碱性成纤维细胞生长因子（bFGF):具有促进基质成纤维细胞的增殖、移行和分 化，促进伤口愈合的作用，能有效地刺激动物及人的上皮组织细胞的增殖。
[0025] (6)肝细胞生长因子（HGF):能刺激各种靶细胞的生长，包括肝细胞、上皮细胞、内 皮细胞、角质化细胞和造血细胞。
[0026] (7)金属蛋白酶组织抑制因子（--ΜΡ):可促进成纤维细胞增生及胶原合成，致细胞 外基质沉积并抑制其降解。
[0027] (8)其它蛋白酶抑制因子：α 1-抗胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白、α 2-抗糜蛋白酶等， 可抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用。
[0028] 正是羊膜中含有以上较多的能够抑制血管生成、抗炎症的活性因子（Hao，Y. et， al.，Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea, 2000. 19 (3):p.348-52 ；BK,N. ,et al., Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent of recalcitrant keratitis.Trophoblast Res，1999(13) :p. 459-466.)，因此羊膜能够起到促进眼表上皮化、减轻炎性反应、抑制纤维 组织增生和新生血管形成的作用，从而在临床上广泛应用于眼表各类疾病修复、皮肤烧创 伤修复等方面。
[0029] 目前尚无采用羊膜为原料制备可注射充填材料的产品，亦无专利及文献报道。


【发明内容】

[0030] 针对上述各种植入剂的缺陷，本发明的目的是提供一种可以抑制炎症、抑制瘢痕 生成、促进自体胶原合成的长期有效的美容植入剂及其制备方法，该方法保留了羊膜的天 然三维立体结构以及大量的天然活性成分，降低了美容注射产品在临床使用后因原料来源 而引起的免疫排斥反应。
[0031] 本发明制备的可注射用羊膜微粒填充剂，是在pH为7. 0?7. 5的磷酸氯化钠生理 溶液中混合有羊膜微粒；该可注射植入剂的微粒直径为50?200 μ m，浓度为30?lOOmg/ mL〇
[0032] 所述磷酸氯化钠生理溶液，是以注射用水为溶剂，含有终浓度为3?8g/L的氯化 钠溶液，〇. 2?0. 4g/L的磷酸二氢钠溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氢二钠溶液；
[0033] 所述羊膜微粒和磷酸氯化钠生理溶液按照质量体积比20:1?100:1混匀。
[0034] 本发明之可注射用羊膜微粒填充剂的制备方法，是以羊膜为原料，经过脱细胞、交 联改性、匀浆和灌装，制备而成，包括羊膜的消毒处理，脱细胞处理，改性处理，羊膜微粒的 制备以及羊膜微粒植入剂的制备，具体步骤如下：
[0035] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS)中清洗至无 血色、污物，再用纯化水清洗1?5次，然后用体积浓度为1?3%的双氧水溶液、体积浓度 为60?90%的乙醇水溶液、体积浓度为0. 1?2%的过氧乙酸水溶液中的一种或者几种，依 次对羊膜进行消毒处理5?60分钟；
[0036] 本步骤通过对羊膜进行消毒处理，可降低羊膜的微生物负载，同时灭活多种可能 存在的病毒，保证羊膜在后续处理时的安全性，避免羊膜上携带的微生物污染。
[0037] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗1?3次，再用 0· 1?lmg/mL的乙二酸四乙胺（EDTA)水溶液、0· 01?0· lmol/L氢氧化钠水溶液、1?5mol/ L氯化钠水溶液、0. 1?lmg/mL的胰酶水溶液中的一种或者几种，依次对羊膜进行震荡处理 5?120分钟，振荡频率为50?80rpm，最后采用纯化水或PBS清洗3?10次；
[0038] 本步骤通过温和的化学及物理方法去除羊膜中的细胞成分，降低羊膜的免疫原 性，并同时最大程度保留了羊膜的胶原及活性因子，为制备保留羊膜生物活性的植入剂提 供原料。
[0039] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用物理或化学方法进行改性处理，根据最 终产品降解性能的要求，可选择不同处理强度的改性方法。改性所用的化学试剂或物理方 法包括但不限于：〇. 1?〇. 5mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC. HCL)的pH为5?6的水溶液在2?40°C下处理6?48小时，0. 1?lmg/mL的核黄素水溶 液在室温下处理4?24小时，室温下3000?10000 μ W/cm2紫外线照射4?16小时，体积 浓度为〇. 1?1%戊二醛水溶液在室温下处理6?12小时，0. 5?1. 5mg/mL的核糖水溶液 在2?40 °C下处理3?14天；
[0040] 本步骤中不同的改性处理方法，可为最终制备不同降解时间的羊膜微粒植入剂提 供选择，适用于面部不同部位的修复，本发明人经过实验验证，降解时间短的羊膜微粒植入 剂可用于真皮层浅层区域以修复浅表细纹，例如眼角四周等区域，降解时间长的羊膜微粒 植入剂可用于真皮层深层部位以修复较深皱纹，例如鼻唇沟等区域。另外，通过改性处理可 将羊膜中保留的活性成分尤其是各种因子固定于羊膜中，减少因后续清洗、干燥、粉碎工艺 造成的损失。
[0041] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水或PBS震荡清洗 3?10次，然后进行室温风干或真空冷冻干燥处理，最后于2?8°C下将羊膜经超高速低温 离心粉碎机粉碎成100?1000 μ m大小的颗粒。
[0042] 本步骤先对羊膜进行干燥处理再制备成颗粒，有利于羊膜粉碎，另外，步骤三及步 骤四采用先交联后匀浆的方法，方便改性后清洗，能够彻底去除试剂残留。
[0043] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，将pH为 7. 0?7. 5的磷酸氯化钠生理溶液作为组分B，将组分A和组分B按照质量体积比20:1? 100:1 (g/L)震荡混匀，经高速微射流设备循环3?8次。随后，先将羊膜微粒悬液经无菌 真空灌装，再经10?30kGy伽马射线辐照灭菌或者先将羊膜微粒悬液经10?30kGy伽马 射线辐照灭菌，并进行无菌真空灌装，即制得可临床使用的羊膜微粒植入剂：浓度为20? 100mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径为50?200 μ m。
[0044] 所述组分B之磷酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度为 3?8g/L的氯化钠溶液，0. 2?0. 4g/L的磷酸二氢钠溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氢二钠 溶液。在组分B之磷酸氯化钠生理溶液中也可添加终浓度为0. 001?0. 01mg/mL的细胞生 长因子、0. 3?2mg/mL的利多卡因、1?10mg/mL的透明质酸等中的任一种或者几种。
[0045] 该步骤5采用的高速微射流设备，高速微射流设备的工作压力为5000?15000Pa， 出口喷嘴直径为0. 1?0. 25mm.。通过高速微射流设备的流体运动产生的剪切力来进一步 粉碎步骤四制备得到的羊膜微粒，得到粒径为50?200 μ m的羊膜微粒。本发明人通过巨 噬细胞吞噬实验验证，直径小的羊膜微粒（10?40 μ m)植入体内后，容易被巨噬细胞吞噬， 无法达到修复效果；通常临床为了控制准确注射至真皮层需要修复的部位，使用的针头为 27?30g，粒径过大容易堵塞注射美容针头。
[0046] 本发明之植入剂的制备装置，采用中空半椭球形装置固定羊膜，即该装置为中空 半椭球形壳体，壳体上均匀分布有若干小孔。由于天然羊膜呈椭球形包裹胎儿，从分娩后的 胎盘分离得到的羊膜往往无法完全在平面铺展，本发明采用有孔的半椭球形装置固定、处 理、清洗羊膜，能够将羊膜平整地覆盖于半球形的表面装置，装置表面具有多个小孔以利于 液体透过(参见附图1)。使用该装置时，将羊膜从半椭球形装置外表面顶端铺展至底部，并 用夹具或医用缝合线将羊膜和装置固定在一起，可以将装置完全浸没于液体、或采用喷淋、 流水等方式对羊膜进行处理，相比于非铺展式的处理方法，避免了因羊膜绕缠、折叠造成的 清洗效率下降，还可以将装置放于干燥环境直接对羊膜进行风干或真空干燥处理，该装置 材质为不锈钢等不易被水、乙醇、酸碱、盐等试剂腐蚀的材料。相比于羊膜平铺于无孔不锈 钢操作台，该装置可有效提高风干或冻干效率，有效避免在处理、清洗过程中羊膜破损、缠 绕，大大提高清洗、处理效率。本发明人通过实验验证，若不使用该装置，羊膜之间缠绕导致 每一次清洗后，需手工将羊膜缠绕处解开甚至出现破损，影响规模化处理的效率，而且缠绕 部位不利于液体渗透和清洗，会造成批次间和批次内检测结果不稳定。实验证明，未采用本 发明装置固定清洗羊膜，因振荡会造成70%的情况下羊膜缠绕，每次清洗结束后手工解开 缠绕的羊膜需耗时5?10分钟，多次处理会对羊膜造成破坏，完整度仅为30?40% ;而采 用羊膜固定装置，则能100%避免羊膜缠绕，羊膜完整度在90%以上。
[0047] 本发明制备的羊膜微粒植入剂，以去异体细胞成分的羊膜为主要原料，具有羊膜 特有的天然胶原及各类因子，例如IV型胶原、bFGF，EGF，HGF，KGF等；植入剂呈均浆状态； 微粒直径为50?200 μ m，浓度为30?100mg/mL。该植入剂适用于注射至皮下真皮层深层 至皮下浅层，以修复中度至重度皱纹或褶皱，具有极好的美容修复效果。本发明通过大鼠皮 下植入实验，证实了羊膜微粒植入剂可在大鼠皮下至少维持52周的效果。
[0048] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果是：
[0049] (1)采用本发明制备技术，可保留大部分人羊膜中的I型胶原、III型胶原、IV型 胶原等胶原天然成分以及HGF、EGF、bFGF、TIMP、KGF等天然活性因子，有效保留羊膜本身抑 制炎症、抑制瘢痕生成的能力（图2,图3)。
[0050] (2)与纯胶原植入剂、透明质酸植入剂、合成微球PMMA相比，本发明制备的羊膜微 粒植入剂，可在一定程度上维持羊膜的细胞外基质天然三维网状结构（图4)，在材料降解前 可有效维持植入部位的空隙，并提供自体组织细胞生成的三维空间，可使注射羊膜微粒植 入剂的部位维持较好的立体修复效果。
[0051] (3 )本发明通过温和的物理化学方法去除了羊膜的细胞及可溶性蛋白等免疫排斥 成分，有效保留多种天然成分及细胞外基质天然结构，并采用先交联后匀浆的方法，方便改 性后清洗，能够彻底去除试剂残留，使羊膜微粒植入剂具有良好的细胞相容性和组织相容 性，将本发明制备的羊膜微粒植入剂与人成纤维细胞共培养时未显示有细胞毒性，且较完 整的羊膜细胞外基质可促进成纤维细胞贴附于羊膜微粒进行增殖生长（图5,图6);大鼠 皮下植入实验结果表明，植入部位未出现任何红肿，溃烂，血肿，组织学染色切片结果表明 1、4、8、24、52周的组织炎症反应均较轻，植入材料周围及内部浸润的炎症细胞数量均较少 (图 9)。
[0052] (4)本发明制备的羊膜微粒植入剂，在植入体内后可有效促进成纤维细胞合成胶 原，通过在体外模拟体内环境进行羊膜微粒植入剂与人成纤维细胞共培养，对成纤维细胞 合成胶原的能力进行验证，结果表明羊膜微粒植入剂可有效刺激人成纤维细胞提高胶原合 成的能力（图7)，说明了本发明制备方法能够保留羊膜的成纤维细胞生长因子，可有效促进 成纤维细胞的增殖。
[0053] (5)本发明制备方法具有较高的质量可控性，可通过控制产品制备过程中产品的 改性程度、浓度、平均粒径及粒径分布范围等参数从而控制产品的动力粘度、降解速率等参 数，实现产品质量的稳定性。按照本发明制备得到的多批产品各项理化参数如微粒浓度、动 力粘度、体外降解时间均较为稳定(表1 )，并可将90%羊膜微粒粒径控制在50?200 μ m之 间，避免出现粒径分布过大导致注射时堵塞针头或粒径分布过小导致有效性不稳定等问题 (图 8)。
[0054] (6)本发明根据羊膜天然的椭球形特点，在清洗、处理羊膜过程中，将羊膜固定在 半椭球形装置上，可有效避免羊膜在处理过程中破损，缠绕，大大提高生产效率。
[0055] (7)本发明制备方法可有效控制产品浓度、粘度、降解速率等参数，能够保证制备 的羊膜微粒植入剂植入体内后可快速成型，具有长期良好的填充效果，其持久性至少在12 个月以上，羊膜微粒植入剂虽在逐步降解，但未发生移位、扩散等现象（图9)。
[0056] (8)本发明制备的羊膜微粒植入剂，生物安全性良好，与采用动物来源胶原或通过 基因重组发酵获取的重组胶原制备的胶原植入剂相比，同源性大大提高，可避免注射动物 胶原或重组胶原所必须进行的皮试实验，节省患者就诊时间及费用。

【专利附图】

【附图说明】
[0057] 图1是本发明的中空半椭球形固定羊膜的装置示意图 图2是实施例制备的羊膜微粒植入剂中胶原组分的免疫组化染色结果之图片 图3是本实施例制备的羊膜微粒植入剂的多种胶原及活性因子定量检测结果之图片 图4是本实施例制备的羊膜微粒植入剂冻干后扫描电镜结果 图5是人成纤维细胞与羊膜微粒植入剂进行共培养5天后在普通光学显微镜下的观察 图片 图6是人成纤维细胞与羊膜微粒植入剂进行共培养5天后的组织学切片图片 图7是本实施例制备的羊膜微粒植入剂在体外与人成纤维细胞共培养3、5、7天后， 取共培养体系中的所有人成纤维细胞，提取其中的mRNA后采用RT-PCR方法检测I型胶原 mRNA表达量的检测结果之图片 图8是本实施例制备的羊膜微粒植入剂的粒径分布检测结果之图片 图9是本发明制备的羊膜微粒植入剂植入大鼠皮下组织后进行组织学检测以及羊膜 微粒植入剂的降解研究结果图片 图10是本发明制备的羊膜微粒植入剂植入大鼠皮下组织后不同时间点进行外观效果 观察的图片 图11是本发明制备的羊膜微粒植入剂植入大鼠皮下组织后不同时间点的组织学切片 效果观察的图片

【具体实施方式】
[0058] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0059] 本发明实施例采用人羊膜是产妇签署知情同意书后，经剖腹产从废弃胎盘剥离获 得，并浸泡于PBS冰浴保存，24小时之内运输至实验室；高速微射流设备是美国BEE厂家生 产的Nano DeBEE. 45型号；高速低温离心粉碎机是上海福里茨仪器设备有限公司生产定制 的。
[0060] 图1显示了本发明之固定羊膜装置的形状和结构
[0061] 该装置为中空半椭球形壳体1，壳体上均匀地分布着诸多小孔2,小孔直径为 0. 5cm，相邻小孔间距为2cm。使用时，在清洗、处理羊膜过程中，将羊膜固定在该半椭球形壳 体上，可有效避免羊膜在处理过程中破损，缠绕，大大提高生产效率。
[0062] 下面列举九个制备可注射植入剂方法的实施例：
[0063] 实施例1、
[0064] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用 纯化水清洗1次，然后用体积浓度为75%的乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理30分钟；
[0065] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗3次，再用 0. 05mol/L氢氧化钠水溶液对羊膜进行震荡处理30分钟，振荡频率为50rpm，最后采用纯化 水清洗3次；
[0066] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用0. lmol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳二亚胺盐酸盐的pH为5的水溶液在2°C下处理6小时；
[0067] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水震荡清洗3次，然 后真空冷冻干燥，最后于2°C下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约200 μ m的微 粒；
[0068] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将3. 5g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 2的磷酸氯化钠生理溶液作为组分B (所述组分B之磷酸氯化 钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度为5. 5g/L的氯化钠溶液，0. 312g/L 的磷酸二氢钠溶液和1. 6g/L的磷酸氢二钠溶液)，将组分A和组分B按照质量体积比35:1 (g/L)快速震荡混匀，经高速微射流设备循环6次，工作压力在15000Pa，出口喷嘴直径为 0. 1mm，将其制备成浓度为35mg/mL的羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径约60?100 μ m。最后 将羊膜微粒悬液经无菌真空灌装，再经25kGy伽马射线辐照灭菌，即制备得到可临床使用 的羊膜微粒植入剂。
[0069] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂细胞相容性良好，与人成纤维细胞共培养5天 后采用光学显微镜及组织学切片进行观察及检测的结果如图5、图6所示，结果表明羊膜微 粒植入剂能够支持成纤维细胞贴服，生长。另外，本实例制备得到的羊膜微粒植入剂浓度及 改性程度均较低，故降解速率较快，采用〇. 2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解时间约为 24小时，大鼠皮下植入结果显示4?6个月后羊膜微粒植入剂基本降解。该方法制备的羊 膜微粒植入剂可用于眼角周围细纹的修复。
[0070] 实施例2、
[0071] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再 用纯化水清洗5次，然后用体积浓度为75%乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理15分钟，再用 0. 1%过氧乙酸对羊膜进行消毒处理15分钟；
[0072] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗1次，再用 0. Olmol/L氢氧化钠水溶液对羊膜进行震荡处理10分钟，振荡频率为80rpm，然后用3mol/ L氯化钠水溶液进行震荡处理100分钟,最后采用纯化水清洗10次；
[0073] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用0. 5mg/mL核糖水溶液在2°C下处理3 天；
[0074] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水震荡清洗10次， 然后室温风干，最后于8°C下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约500 μ m大小的 颗粒；
[0075] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将5g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 0的磷酸氯化钠生理溶液，再添加50mg利多卡因和200mg透 明质酸，与上述磷酸氯化钠生理溶液混合后作为组分B，将组分A和组分B质量体积比50:1 (g/L)快速震荡混匀，经高速微射流设备循环5次，工作压力在8000Pa，出口喷嘴直径为 0. 25mm，将其制备成浓度为50mg/mL的羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径约150?200 μ m。最 后将羊膜微粒悬液经无菌真空灌装，再经15kGy伽马射线辐照灭菌即制备得到可临床使用 的羊膜微粒植入剂。所述磷酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度分 别为4. Og/L的氯化钠溶液，0. 2g/L的磷酸二氢钠溶液和1. Og/L的磷酸氢二钠溶液。
[0076] 本实施例制备得到的羊膜微粒植入剂粒径较大，同时添加了利多卡因作为局部麻 醉剂，添加了透明质酸以改善羊膜微粒植入剂粘度。另外本实例制备得到的羊膜微粒植入 剂浓度及改性程度均较高，故降解速率较慢，采用〇. 2mg/mL的蛋白酶K进行体外降解，降解 时间约为72小时，大鼠皮下植入组织学检测以及羊膜微粒植入剂的降解研究结果如图9所 示，显示52周后羊膜微粒植入剂仍有大量材料未被降解吸收，预计注射后18?24个月后 羊膜微粒植入剂会基本降解。该方法制备的羊膜微粒植入剂可用于鼻唇沟等较深皱纹的修 复。
[0077] 实施例3、
[0078] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用 纯化水清洗3次，然后用体积浓度为75%乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理10分钟；再用体 积浓度为1%的双氧水溶液对羊膜消毒10分钟；
[0079] 步骤二、脱细胞处理：先用纯化水将消毒后的羊膜清洗2次，再lmg/mL的EDTA水 溶液对羊膜进行震荡处理60分钟，0. lmg/mL的胰酶水溶液振荡处理10分钟，振荡频率均为 60rpm，最后采用纯化水清洗6次；
[0080] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用体积浓度为1%的戊二醛水溶液在室温 下处理6小时；
[0081] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水震荡清洗6次，然 后室温风干，最后于4°C下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约280 μ m大小的颗 粒；
[0082] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将3. 5g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 5的磷酸氯化钠生理溶液作为组分B (所述组分B之磷酸氯化 钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度分别为8g/L的氯化钠溶液，0. 4g/L 的磷酸二氢钠溶液和2. Og/L的磷酸氢二钠溶液)，将组分A和组分B按照质量体积比35:1 (g/L)快速震荡混匀，经高速微射流设备循环6次，工作压力在12000Pa，出口喷嘴直径为 0. 2mm，将其制备成浓度为35mg/mL的羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径约80?120 μ m。最后 将羊膜微粒悬液先经25kGy伽马射线辐照灭菌，再经无菌真空灌装即制备得到可临床使 用的羊膜微粒植入剂。
[0083] 将本实例制备得到的三批羊膜微粒植入剂进行体外降解时间、羊膜微粒浓度、平 均粒径及动力粘度检测，结果如表1所示，各批次间检测结果差异不大，表明本发明方法可 以有效保证及控制制备的羊膜微粒植入剂质量的稳定性。
[0084] 实施例4、
[0085] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用 纯化水清洗3次，然后用体积浓度为3%的双氧水溶液对羊膜进行消毒60分钟，再用体积浓 度为90%的乙醇水溶液对羊膜进行消毒60分钟，再用体积浓度为2%的过氧乙酸水溶液对 羊膜进行消毒处理60分钟；
[0086] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗3次，再用lmg/ mL的EDTA水溶液震荡处理120分钟，再用0. lmol/L氢氧化钠水溶液震荡处理120分钟，再 用5mol/L氯化钠水溶液振荡处理120分钟，最后再用lmg/mL的胰酶水溶液对羊膜进行震 荡处理120分钟，振荡频率均为80rpm。最后采用PBS清洗10次；
[0087] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用0. lmg/mL的核黄素水溶液在室温下处 理4小时；
[0088] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用PBS震荡清洗3次，然后 真空冷冻干燥，最后于6°C下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约300 μ m大小的 颗粒；
[0089] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将2g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 5的磷酸氯化钠生理溶液，再添加30mg的利多卡因与上述磷酸 氯化钠生理溶液混合后作为组分B，将组分A和组分B质量体积比20:1 (g/L)快速震荡混 匀，经高速微射流设备循环8次，工作压力为15000Pa，出口喷嘴直径为0. 1mm制备成浓度为 20mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径约为50?200 μ m。最后将羊膜微粒悬液经15kGy 伽马射线辐照灭菌，再经无菌真空灌装即制备得到可临床使用的羊膜微粒植入剂。所述磷 酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度分别为8g/L的氯化钠溶液， 0. 4g/L的磷酸二氢钠溶液和2. Og/L的磷酸氢二钠溶液。
[0090] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂作用效果与实施例1基本一致，可用于眼角周 围细纹的修复。
[0091] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂进行粒径检测的结果如图8所示，从粒径检测 结果可以看到粒径大小约有90%以上均在50?200 μ m范围内，表明羊膜微粒植入剂可有 效控制广品粒径。
[0092] 实施例5、
[0093] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用 纯化水清洗3次，然后用体积浓度为1%的双氧水溶液对羊膜进行消毒处理5分钟，再用体 积浓度为60%的乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理5分钟，再用体积浓度为0. 1%的过氧乙酸 水溶液对羊膜进行消毒处理5分钟；
[0094] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗3次，再用 0. lmg/mL的EDTA水溶液震荡处理5分钟，再用0. Olmol/L氢氧化钠水溶液震荡处理5分 钟，再用lmol/L氯化钠水溶液振荡处理5分钟，最后用0. lmg/mL的胰酶水溶液对羊膜进行 震荡处理5分钟，振荡频率为50rpm。最后采用纯化水或PBS清洗3次；
[0095] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜在室温下采用3000 μ W/cm2紫外线照射4 小时；
[0096] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用PBS震荡清洗10次，然 后室温风干，最后于5°C下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成粒径约600 μ m大小的颗 粒；
[0097] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将10g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 2的磷酸氯化钠生理溶液，再添加 lmg的bFGF与上述磷酸氯 化钠生理溶液混合后作为组分B，将组分A和组分B质量体积比100:1 (g/L)快速震荡混 匀，经高速微射流设备循环3次，工作压力为5000Pa，出口喷嘴直径为0. 25mm，制备成浓度 为100mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径为150?180 μ m。最后将羊膜微粒悬液经无菌 真空灌装，再经10kGy伽马射线辐照灭菌即制备得到可临床使用的羊膜微粒植入剂。所述 磷酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度为5. 5g/L的氯化钠溶液， 0. 312g/L的磷酸二氢钠溶液和1. 6g/L的磷酸氢二钠溶液。
[0098] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂作用效果与实施例2基本一致，可用于鼻唇沟 等较深皱纹的修复。
[0099] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂进行胶原免疫组化检测及胶原、因子含量的定 量检测，结果如图2及图3所示，从检测结果可以看出，本实例制备得到羊膜微粒植入剂保 留了羊膜中天然的胶原及各类因子成分。
[0100] 实施例6、
[0101] 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在PBS中清洗至无血色、污物，再用 纯化水清洗2次，然后用体积浓度为2%的双氧水溶液对羊膜进行消毒处理30分钟，再用体 积浓度为75%的乙醇水溶液对羊膜进行消毒处理30分钟，最后用体积浓度为1%的过氧乙 酸水溶液对羊膜进行消毒处理30分钟；
[0102] 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗2次，再用 0. 5mg/mL的EDTA水溶液处理60分钟，再用0. 05mol/L氢氧化钠水溶液处理60分钟，再用 3mol/L氯化钠水溶液处理60分钟，最后用0. 5mg/mL的胰酶水溶液处理60分钟，振荡频率 为65rpm。最后采用PBS清洗7次；
[0103] 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用0. 5mol/L的EDC. HCL的pH为6的水溶 液中，在40°C下处理48小时；
[0104] 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用PBS震荡清洗7次，然后 真空冷冻干燥，最后于：TC下将羊膜经超高速低温离心粉碎机粉碎成500 μ m大小的颗粒。
[0105] 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将5g步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，用 100mL注射用水配制pH为7. 3的磷酸氯化钠生理溶液，再添加 lg透明质酸与上述磷酸氯化 钠生理溶液混合后作为组分B，将组分A和组分B质量体积比50:1 (g/L)快速震荡混匀， 经高速微射流设备循环5次，工作压力为lOOOOPa，出口喷嘴直径为0. 15_，制备成浓度为 50mg/mL羊膜微粒悬液，羊膜微粒的粒径为120?170 μ m。最后将羊膜微粒悬液先经10kGy 伽马射线辐照灭菌，再经无菌真空灌装，即制备得到可临床使用的羊膜微粒植入剂。所述 磷酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度为5. 8g/L的氯化钠溶液， 0. 356g/L的磷酸二氢钠溶液和1. 4g/L的磷酸氢二钠溶液。
[0106] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂作用效果与实施例2基本一致，可用于鼻唇沟 等较深皱纹的修复。
[0107] 本实例制备得到的羊膜微粒植入剂，将其冻干后进行扫描电镜检测，检测结果如 图4所示，从检测结果可以看出，羊膜微粒仍保留了羊膜细胞外基质良好的三维网络结构。
[0108] 实施例7、
[0109] 本实施例与实施例1基本相同，不同仅在于：所述步骤三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐"改为" lmg/mL的核黄素水溶液在室温下处理24小时，室温 下10000 μ W/cm2紫外线照射16小时"。所述步骤五中：在组分B中添加100mg利多卡因、 100mg透明质酸。
[0110] 将本实例制备得到的羊膜微粒植入剂与人成纤维细胞体外共培养，对共培养一段 时间后的人成纤维细胞提取其中的mRNA，采用RT-PCR方法检测I型胶原mRNA表达量，检测 结果如图7所示，从图中可以看出本实例制备的羊膜微粒植入剂，可有效促进成纤维细胞 生长增殖。
[0111] 实施例8、
[0112] 本实施例与实施例1基本相同，不同仅在于：所述步骤三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐"改为"体积浓度为〇. 1%戊二醛水溶液在室温下处理12小 时"。所述步骤五中：在组分B中添加0· lmg bFGF、500mg透明质酸、200mg利多卡因。
[0113] 实施例9、
[0114] 本实施例与实施例1基本相同，不同仅在于：所述步骤三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐"改为" 1. 5mg/mL的核糖水溶液在40°C下处理14天"。
[0115] 以下针对上述实施例，结合实验数据、图片资料等进行分析：
[0116] 图2是实施例制备的羊膜微粒植入剂中胶原组分的免疫组化染色结果之图片
[0117]
[0118] 图中，1为I型胶原，2为III型胶原，3为IV型胶原，4为阴性对照。
[0119] 图片显示：羊膜微粒植入剂中的I型胶原、III型胶原含量较多，IV型胶原含量 稍少但也具有明显的阳性表达。
[0120] 图3是本实施例制备的羊膜微粒植入剂的多种胶原及活性因子定量检测结果之 图片
[0121]
[0122] 图中，I型胶原、III型胶原含量较多，IV型胶原含量稍少，与胶原组分定性结果 相符。另外，各活性因子中肝细胞生长因子（HGF)、角质细胞生长因子（KGF)以及(成纤维细 胞生长因子)bFGF含量较多。结果表明本实施例制备的羊膜微粒植入剂可有效保留多种活 性因子。
[0123] 图4是本实施例制备的羊膜微粒植入剂冻干后扫描电镜结果
[0124] 图中可见：冻干后的羊膜微粒呈较疏松的纤维形态，显示羊膜微粒植入剂中的羊 膜微粒仍保留了羊膜细胞外基质良好的三维网络结构。
[0125] 图5是人成纤维细胞与羊膜微粒植入剂进行共培养5天后在普通光学显微镜下的 观察图片
[0126]
[0127] 图中，成纤维细胞与羊膜微粒植入剂贴附良好，且成纤维细胞能正常增殖生长，结 果表明本发明制备的羊膜微粒植入剂具有良好的细胞相容性。
[0128] 图6是人成纤维细胞与羊膜微粒植入剂进行共培养5天后的组织学切片图片
[0129]
[0130] 结果显示：羊膜微粒植入剂表层及部分羊膜微粒内部均贴附了连续的成纤维细胞 层，说明本发明制备的羊膜微粒植入剂具有极好的细胞相容性，并且也说明了羊膜微粒植 入剂保留了较好的羊膜细胞外基质三维网络结构，可促使细胞长入。
[0131] 图7是实施例制备的羊膜微粒植入剂在体外与人成纤维细胞共培养3、5、7天后， 取共培养体系中的所有人成纤维细胞，提取其中的mRNA后采用RT-PCR方法检测I型胶原 mRNA表达量的检测结果之图片
[0132]
[0133] 从图中可以看出：7天后，共培养条件下的人成纤维细胞的I型胶原mRNA表达量比 单独培养人成纤维细胞的表达量要多出60%左右，说明本发明制备的羊膜微粒植入剂，可有 效保留羊膜中的成纤维细胞生长因子等活性成分，可起到促进成纤维细胞生长增殖的作用。
[0134] 表1是按照本发明制备的多批羊膜微粒植入剂的体外降解、羊膜微粒浓度、平均 粒径以及动力粘度的检测结果
[0135]
[0136] 产品批次代号体夕卜降解时间（min) 羊膜微粒浓度（mg/mL) 平均粒径（μ m) 云力力粘度（mPa · s) 1 丨4358 丨35· 04 丨98· 23 丨9341 2 14403 |35. 19 |99· 84 19580 3 丨4278 丨35· 74 丨98· 91 丨9803
[0137] 说明本发明制备的羊膜微粒植入剂可有效控制产品以上质量参数的稳定性。
[0138] 图8是实施例制备的羊膜微粒植入剂的粒径分布检测结果之图片
[0139] 说明本发明制备的羊膜微粒植入剂可有效控制产品粒径分布范围。
[0140] 图9是本发明制备的羊膜微粒植入剂植入大鼠皮下组织后进行组织学检测以及 羊膜微粒植入剂的降解研究结果图片
[0141]
[0142]
[0143] 图中，Α为1周取材外观图片，Β为1周取材组织学染色切片图片，C为4周取材外 观图片，D为4周取材组织学染色切片图片，E为8周取材外观图片，F为8周取材组织学染 色切片图片，G为24周取材外观图片，Η为24周取材组织学染色切片图片，I为52周取材 外观图片，J为52周取材组织学染色切片图片。结果显示：羊膜微粒植入剂具有良好的组 织相容性、良好的长期填充效果，不会发生移位、扩散等现象。
[0144] 实验报告(摘录）
[0145] 1、羊膜微粒植入剂介绍
[0146] 羊膜（Amniotic membrane AM)为光滑、无血管、无神经、无淋巴的透明薄膜，厚约 0. 02?0. 50mm，是一种理想的组织工程修复材料，已用于多种组织缺损的治疗和修复。
[0147] 本实验制做的羊膜微粒植入剂，是将羊膜通过本专利工艺，制备为可注射式微粒 植入剂。在制备过程中可有效去除羊膜中的异体细胞成分，并最大程度保留羊膜天然胶原 及各类因子，生物相容性好，没有明显的免疫诱导活性，具有良好的诱导胶原生成的能力， 是一种理想的美容注射填充材料。
[0148] 2、皮肤皱纹整形修复介绍
[0149] 2.1皱纹生成机理
[0150] 皮肤产生皱纹的原因有多种，主要分为内源性及外源性原因，内源性主要是随着 年龄的增长，皮肤的老化，胶原蛋白及弹性蛋白的合成及降解的平衡被打破，造成胶原蛋白 和弹性蛋白含量的降低，真皮层厚度减小，胶原纤维立体结构被破坏，真皮层中成纤维细胞 衰老及消失而造成皱纹产生；外源性原因主要是环境中的紫外线等各种辐射引起皮肤中基 质金属蛋白酶增多，从而导致皮肤中胶原蛋白的含量降低，另外皮肤健康状态与尼古丁、重 复性肌肉运动、饮食、睡眠姿势以及整体健康程度均有较大关系。
[0151] 2. 2羊膜微粒植入剂作用机理
[0152] 羊膜微粒植入剂的注射部位为真皮深层，注射后主要作用为真皮补充具有人源性 胶原、多糖细胞外基质，包括羊膜中富含的I、III型胶原蛋白等，并且羊膜微粒植入剂富 含的多种因子如bFGF等可有效促进注射部位的真皮层中的成纤维细胞增殖，从而大大促 进真皮层中的胶原合成，含有的多种抗炎症因子如TIMP等，可有效降低细胞外基质中的金 属基质蛋白酶活性，抑制其对真皮层中的细胞外基质的降解速率；另外由于注射时会针头 造成轻微损伤，亦可同时刺激机体在创伤愈合的过程中对注射部位的真皮组织进行重塑作 用。
[0153] 3、动物实验模型、手术方法及评价标准
[0154] 3.1动物实验模型
[0155] 本动物实验报告采用对30只SD大鼠进行皮下注射填充效果的动物有效性验证， 动物性别不限，动物年龄均为成年。
[0156] 3. 2手术方法
[0157] 1 依据
[0158] 中华人名共和国国家标准GB/T16886. 10-2005《GBT16886. 2-2000医疗器械生物 学评价第2部分：动物保护要求》
[0159] 2受试动物
[0160] (1)动物品系：SD大鼠
[0161] (2)饲养条件：全价营养颗粒饲料喂食，自由采食，自由饮水，室温18-26°C，每天 光照12小时，术前禁食8小时。
[0162] 3手术操作方法
[0163] (1)按照35mg/kg剂量使用1%戊巴比妥钠静脉注射进行深度麻醉。
[0164] (2)待动物进入手术麻醉期，将动物俯卧位固定在手术台上。
[0165] (3)常规备皮，碘伏消毒手术部位。
[0166] (4)术者打开羊膜微粒植入剂产品，安装好注射针头，采用点状注射方法，将材料 注射至大鼠胸椎两侧皮肤的皮下浅层部位。每点注射量0. 5ml。
[0167] (5)注射完毕后对注射部位进行再次碘伏消毒。
[0168] (6)术后注意动物保暖复苏，待苏醒后放入笼具。
[0169] (7)写好笼具标签，做好试验记录。
[0170] 4评价指标
[0171] 于术后1周、2周、4周、8周、12周、16周、24周、32周、40周、52周对30只实验大 鼠进行处死解剖取材，每个时间点取材3只大鼠，大体观察羊膜微粒植入剂在大鼠皮下残 留情况，并进行组织学切片检测材料植入部位的组织相容性、炎症反应以及降解情况等。
[0172] 4、动物实验结果
[0173] 4. 1大体取材外观结果
[0174] 各时间点取材时注射部位大体情况如图10所示，各时间点观察大鼠皮下植入部 位均未出现红肿、溃烂等不良反应，皮肤外观正常，材料生物相容性良好。羊膜微粒植入剂 在植入大鼠皮下52周后仍能从外观看出注射材料部位的隆起效果。
[0175]
[0176] 4. 2组织学检测结果
[0177] 各时间点取材后的材料形态，组织学切片结果如图11所示，各时间点材料均保持 良好的填充效果，没有发生移位、扩散等不良现象。羊膜微粒植入剂在植入大鼠皮下52周 后仍能从组织学切片看到有较多材料剩余，材料内部炎症细胞浸润较少，成纤维细胞逐渐 迁入材料内部，羊膜微粒植入剂生物相容性良好。
[0178]
[0179] 上述结果说明，羊膜微粒植入剂具有良好的组织相容性、良好的长期填充效果，不 会发生移位、扩散等现象。
【权利要求】
1. 一种可注射植入剂，其特征在于：是在pH为7. 0?7. 5的磷酸氯化钠生理溶液中混 合有羊膜微粒；该可注射植入剂的微粒直径为50?200 μ m，浓度为30?100mg/mL : 羊膜微粒和磷酸氯化钠生理溶液，按照质量体积比20:1?100:1混匀。
2. -种可注射植入剂的其制备方法，其特征在于：以羊膜为原料，经过脱细胞、交联改 性、匀浆和灌装，制备而成，其包括羊膜的消毒处理，脱细胞处理，改性处理，羊膜微粒的制 备以及羊膜微粒植入剂的制备，具体步骤如下： 步骤一、消毒处理：在无菌条件下，将羊膜浸泡在磷酸盐缓冲液中清洗至无血色、污物， 再用纯化水清洗1?5次，然后用体积浓度为1?3%的双氧水溶液、体积浓度为60?90% 的乙醇水溶液、体积浓度为0. 1?2%的过氧乙酸水溶液中的一种或者几种，依次对羊膜进 行消毒处理5?60分钟； 步骤二、脱细胞处理：将步骤一消毒处理后的羊膜先用纯化水清洗1?3次，再用 0. 1?lmg/mL的乙二酸四乙胺水溶液、0. 01?0. lmol/L氢氧化钠水溶液、1?5mol/L氯化 钠水溶液、〇. 1?lmg/mL的胰酶水溶液中的一种或者几种，依次对羊膜进行震荡处理5? 120分钟，振荡频率为50?80rpm，最后采用纯化水或PBS清洗3?10次； 步骤三、改性处理：将步骤二得到的羊膜用物理或化学方法进行改性处理，根据最终产 品降解性能的要求，可选择不同处理强度的改性方法。改性所用的化学试剂或物理方法包 括但不限于：〇. 1?0. 5mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的pH为 5?6的水溶液在2?40°C下处理6?48小时，0. 1?lmg/mL的核黄素水溶液在室温下处 理4?24小时，室温下3000?10000 μ W/cm2紫外线照射4?16小时，体积浓度为0. 1? 1%戊二醛水溶液在室温下处理6?12小时，0. 5?1. 5mg/mL的核糖水溶液在2?40°C下 处理3?14天； 步骤四、羊膜微粒的制备：将步骤三改性处理后的羊膜用纯化水或PBS震荡清洗3? 10次，然后进行室温风干或真空冷冻干燥处理，最后于2?8°C下将羊膜经超高速低温离心 粉碎机粉碎成100?1000 μ m大小的颗粒； 步骤五、羊膜微粒植入剂的制备：将步骤四制备的羊膜微粒作为组分A，将pH为7. 0? 7. 5的磷酸氯化钠生理溶液作为组分B，将组分A和组分B按照质量体积比20:1?100:1 (g/L)震荡混匀，经高速微射流设备循环3?8次。随后，先将羊膜微粒悬液经无菌真空灌 装，再经10?30kGy伽马射线辐照灭菌或者先将羊膜微粒悬液经10?30kGy伽马射线辐 照灭菌，并进行无菌真空灌装，即制得可临床使用的羊膜微粒植入剂。
3. 根据权利要求2所述可注射植入剂的其制备方法，其特征在于：所述组分B之磷 酸氯化钠生理溶液的组成为：以注射用水为溶剂，含有终浓度为3?8g/L的氯化钠溶液， 0. 2?0. 4g/L的磷酸二氢钠溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氢二钠溶液。
4. 根据权利要求2所述可注射植入剂的其制备方法，其特征在于：在组分B中，还包括 有细胞生长因子、利多卡因、透明质酸等中的任一种或者几种，终浓度为0.001?O.Olmg/ mL的细胞生长因子、0. 3?2mg/mL的利多卡因、1?10mg/mL的透明质酸等中的任一种或者 几种。
5. 根据权利要求2所述可注射植入剂制备方法的制备装置，其特征在于：固定羊膜采 用中空半椭球形壳体，该壳体上均勻分布有若干小孔。
6. 根据权利要求2所述可注射植入剂制备方法的制备装置，其特征在于：步骤五所述
【文档编号】A61K35/54GK104055795SQ201310071109
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】刘博文, 张宏波, 冉永峰 申请人:陕西瑞盛生物科技有限公司