一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法

专利名称：一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种载药体的制备，特别涉及一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法及生物荧光成像的应用，即稀土掺杂的多孔氧化镓晶体本身可同时作为药物载体及用于生物标记荧光成像。
背景技术：
癌症是世界广泛肆虐的疾病，严重影响人类的身心健康。近来，随着纳米技术的发展，将药物与荧光探针相结合制备诊断治疗试剂，实行个体化给药已成为研究的热点与趋势。此种多功能的纳米粒因具有载药与荧光标记的独特功能，因此在医学的检测诊断与治疗研究方面越来越受到重视。目前研究比较多的药物载体包括有机纳米载体如脂质体，PLAG纳米粒,枝状聚合物，白蛋白纳米粒等，无机纳米粒如介孔氧化硅，二氧化钛，碳纳米管等，虽然具有不同程度的载药性能，但是本身并无荧光功能，无法肿瘤成像诊断，需通过物理吸附或者通过化学键结合荧光标记物才能具有肿瘤成像诊断的功能。用于突光探针的标记物分为有机突光染料和无机突光材料。有机突光染料光化学稳定性差，而且容易发生光漂白与光解，不利于较长时间的观察(如FITC、075.5等)。在无机荧光材料中，研究比较热门的有量子点(QD)，纳米金(Au)等，这些荧光标记物虽有肿瘤诊断成像功能，但本身并无载药功能，·需化学键合或包裹于其他的药物载体上才能实现疾病治疗诊断的功能。因此常规的诊断治疗试剂需制备药物载体，制备荧光标记物，再通过物理或化学方法将载体与荧光标记物结合，然后载药，制备过程繁琐复杂，在制备的过程中具有多种不确定的影响因素，费时费力。快速简单的合成有效的诊断治疗纳米粒，这样才有利于这些诊断治疗试剂的临床应用。氧化镓(Ga2O3)是一种宽带隙氧化物半导体，本身具有光至发光性能，在紫外激发光条件下会发射蓝光。同时掺杂不同的稀土离子，其具有不同的光至发光特性，因此在光电子器件方面应用广泛，包括用作Ga基半导体材料的绝缘层，以及紫外线滤光片等。镓合金还可作为牙修复材料，并已在临床使用。但未见其制备稀土掺杂的具有孔隙结构的氧化镓同时用作药物载体及荧光标记成像的报道。

发明内容
本发明目的是提供一种稀土掺杂的氧化镓多孔载药体的制备及其在生物荧光标记成像方面的应用，即所制备的载药体本身具有载药与荧光标记生物成像的功能，所述制备方法简单便捷，成本低，易于大规模生产。本发明采用的技术方案是:本发明提供一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，所述方法为:(1)稀土掺杂氧化镓晶体:将氯化镓水溶液与稀土盐水溶液混合，再加入聚乙二醇(即为液体PEG，分子量200 600)，室温下搅拌混匀(通常搅拌30min)后调节pH值至4 8，将混合液于110 180°C下反应0.5 24h (反应温度和时间不同，所获得的粒径不同的多孔棒状材料，包括纳米级和微米级)，反应结束后，将反应液冷却至室温并离心(根据稀土掺杂氧化镓晶体是否产生荧光来判断稀土离子是否掺杂进去，本申请对掺杂量没有要求，只要有荧光产生即可)，取沉淀a (若pH值至4 8采用氢氧化钠水溶液(或其他金属盐水溶液)调节，则需要将沉淀a用超纯水离心洗涤(4000rpm，IOmin)除去钠离子(或其他金属离子))干燥后于800 1200°C下煅烧2 8h，冷却至室温，获得所述稀土掺杂氧化镓晶体；所述氯化镓水溶液中氯化镓与稀土盐水溶液中稀土离子投料物质的量之比为1:0.005，所述聚乙二醇体积用量以氯化镓水溶液中氯化镓物质的量计为11111 2777ml/mol ; (2)稀土掺杂氧化镓载药体:将待负载的药物溶于溶剂a中，超声溶解后制成药物溶液，再加入步骤(I)制备的稀土掺杂氧化镓晶体，超声分散后再在室温下避光搅拌12 24h,离心分离(优选12000rpm离心lOmin)，取沉淀b用溶剂b洗涤、冷冻干燥，获得所述稀土掺杂氧化镓载药体(根据离心分离获得的上清液及用溶剂b洗涤后的洗涤液中药物含量来确定药物是否负载到稀土掺杂氧化镓晶体中);所述待负载的药物为抗肿瘤药物；所述溶剂a为水或pH值5.5 7.4的PBS缓冲液，所述溶剂b与溶剂a相同；所述稀土掺杂氧化镓晶体与待负载药物的质量比为1:0.I I。进一步，所述稀土盐水溶液中稀土离子为Tb3+、Eu2+或Cr3+中的一种或几种，优选Cr3+，因其在激发光条件下所获得的发射光在近红外光谱段，相对于其他掺杂稀土离子所发出的发射光具有更强的生物机体穿透能力，能够更好的用于荧光标记生物成像。进一步，所述步骤(I)所述沉淀a干燥是在110°C下干燥24h。进一步,所述步骤(I)所述稀土盐水溶液浓度为0.01 0.lmol/L,所述氯化镓水溶液的浓度为0.01 0.04mol/L。进一步，所述步骤(2)所述待负载的药物为重酒石酸长春瑞滨(即3’，4’ - 二去氢-4’去氧-8’-去甲长春 花碱二酒石酸盐)、盐酸阿霉素或盐酸表阿霉素，其中优选盐酸阿
霉素O进一步,步骤(2)所述待负载的药物与溶剂a混合制成0.2 lmg/ml的药物溶液。进一步，步骤(2)所述稀土掺杂氧化镓晶体与待负载药物的质量比为1:1。本发明制备的稀土掺杂氧化镓晶体(多孔棒状)可在不同的激发光下产生一定的发射波普，用于生物标记荧光成像。将稀土掺杂氧化镓晶体用超纯水配置成0.1 5mg/ml的悬浊液，用小动物活体成像仪(美国CRi Maestro)在455，523，595，605，635nm激发波长下，发出强烈的近红外荧光。将0.1 5mg/ml的稀土掺杂氧化镓晶体对裸鼠皮下注射，腹腔注射，以及灌胃，然后通过活体成像仪在455，523，595，605，635nm波长的激发光下均可观察不同程度的近红外荧光，优选635nm波长作为激发光。本发明所述稀土掺杂氧化镓载药体为多孔棒状，长为0.5-3 μ m,宽为0.25-1 μ m,所述载药体的载药量可达到2 24%。本发明所述超纯水是指Mill1-Q水。本发明所述稀土掺杂的多孔氧化镓晶体通过对药物的物理吸附作用制备其稀土掺杂的多孔氧化镓载药体，所述载药过程为将药物(以盐酸阿霉素为例)溶于溶剂制成药物溶液，再加入稀土掺杂的氧化镓晶体，超声lh，然后室温搅拌孵育12-24h，12000rpm离心IOmin,收集上清液，并将沉淀洗涤三遍，收集洗涤液，取最终的沉淀即为稀土掺杂的氧化镓载药体。通过紫外分光光度计分别测上清液、洗涤液中所载药物在最大吸收波长处的吸光度值(如盐酸阿霉素为480nm)，根据标准曲线计算离心液和洗涤液中药物的量，根据公式(O计算稀土掺杂的氧化镓载药体的载药量。载药量C=(IH1-V1A1-V2A2)/ (IiiJmrV1A1-V2A2)^lO(Fc) 公式(I)公式(I)中Hi1, m2分别代表加入的药物和氧化镓的质量，V1, V2分别代表离心液和洗涤液的体积，A1, A2分别代表上清液和洗涤液的吸光度。与现有的诊断治疗试剂的研究技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供一种稀土掺杂的多孔氧化镓晶体的新用法，其本身可以作为药物的载体，同时又可光致发光用于生物标记荧光成像，克服了常规的药物载体可载药但无法生物标记荧光成像，荧光探针可生物标记荧光成像但无法高效载药的不利特点，绕过了将载体与荧光探针通过物理或化学的方法结合在一起的繁琐步骤，因此制备方法简单便捷，成本低，易于大规模生产，更有利于在临床实际中应用。


图1是实施例2所制备的稀土掺杂氧化镓晶体分散液的透射电镜图，b是a的放大图。图2是稀土掺杂氧化镓晶体光至发光效果图，A为实施例3中稀土掺杂氧化镓晶体光至发光效果图，B为实施例4中稀土掺杂氧化镓晶体光至发光效果图，对照为超纯水。图3是实施例3所述稀土掺杂氧化镓晶体的发射光谱图。图4是稀土掺杂氧化镓晶体生物标记荧光成像效果图，A为实施例5中稀土掺杂氧化镓晶体生物标记荧光成像效果图，B为实 施例6中稀土掺杂氧化镓晶体生物标记荧光成像效果图，圆圈处表示近红外荧光。图5是稀土掺杂氧化镓晶体对细胞毒性实验结果柱状图，a为培养24小时的情况，b为培养48h的情况。图6是盐酸阿霉素的浓度梯度标准曲线图。图7是氧化镓载药体的药物释放(以盐酸阿霉素为例)曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:稀土掺杂的多孔氧化镓晶体的制备:配置0.0lM的氯化镓水溶液45ml，加5ml PEG (分子量600)，22.5 μ 10.lmol/L的硝酸铬水溶液，室温(25°C)搅拌0.5h，用0.4mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至7.0，然后倒入反应釜中于180°C水热反应24h，待其冷却至室温后，4000rpm离心IOmin后获取沉淀，并用超纯水离心洗涤(4000rpm，IOmin)除去钠离子，然后将沉淀在110°C烘箱中烘24h，置于马弗炉中1000°C煅烧3h，冷却至室温，即得稀土掺杂的氧化镓晶体(棒状)0.035g，长3μπι，宽 I μ m。实施例2:稀土掺杂的多孔氧化镓晶体的制备
配置0.04mol/L 的的氯化镓水溶液 45ml，加 5mlPEG (分子量 400)，90ul0.1moI/L硝酸铬水溶液室温搅拌0.5h，用质量浓度28%氨水条节pH至7.0，然后倒入反应釜中于120°C反应lh，待其冷却至室温后，4000rpm离心IOmin后获取沉淀，然后将沉淀在110°C烘箱中烘24h，再置于马弗炉中1000°C煅烧3h，冷却至室温，即得稀土掺杂的氧化镓晶体(棒状)0.135g，长500nm，宽250nm。将0.005g稀土掺杂的氧化镓晶体于超纯水中超声(80W，30min)分散后，取0.0lml分散液进行透射电子显微镜(H7650，日本日立公司)观察，结果见图1所示，表明所合成材料为纳米级别的多孔棒状结构，长500nm，宽250nm。实施例3:稀土掺杂的多孔氧化镓晶体光至发光效果将实施例2所制备的稀土掺杂氧化镓晶体用超纯水配置成0.2mg/ml分散液，并用超纯水作为对照，用活体成像仪(美国CRi Maestro)在455nm、523nm、595nm、605nm和635nm波长下检测，在455nm激发波长下发射出强烈的近红外荧光，如图2中A所示，对照则无荧光。通过荧光分光光度计(JASCO，FP6500)测其发射波普如图3所示。实施例4:稀土掺杂的多孔氧化镓晶体光至发光效果实施例2所制作的稀土掺杂氧化镓晶体用水配置成lmg/ml分散液，并用超纯水作为对照，用活体成像仪在455nm、523nm、595nm、605nm和635nm波长下检测，在635nm激发波长下发射出强烈的近红外荧光，对照则无荧光，如图2中B所示。实施例5:稀土掺杂的多孔氧化镓晶体生物标记荧光成像效果实施例2所制作的稀土掺杂氧化镓晶体用PBS7.4缓冲液配置成lmg/ml分散液，BALB/C裸鼠(中科院上海实验动物中心提供，鼠龄4 5w，体重18 22g)皮下注射20ul，用活体成像仪在455nm、523nm、595nm>605nm和635nm波长下检测,在455nm波长激发光下，皮下注射部位具有强烈的近红外荧光，如图4中A所示(圆圈处)。实施例6:稀 土掺杂的多孔氧化镓晶体生物标记荧光成像效果实施例2所制作的稀土掺杂氧化镓晶体用PBS7.4缓冲液配置成5mg/ml分散液，裸鼠经禁食24h后，灌胃0.2ml，用活体成像仪在455nm、523nm、595nm、605nm和635nm波长检测，在635nm激发波长下，胃部具有强烈的近红外荧光，如图4中B所示(圆圈处)。实施例7:稀土掺杂的多孔氧化镓细胞毒性实验MTT法检测稀土掺杂的多孔氧化镓晶体对细胞的毒性。将Hela细胞(中科院上海细胞库)接种于96孔板(Costar )，于37 °C，5%C02细胞培养箱(HERA ce 11150 )中培养(1640细胞培养液(含双抗)+10%小牛血清，培养液购于杭州吉诺生物技术有限公司，小牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司)，24h使其贴壁，用1640细胞培养液配置800，600，400，200，100，80，40，20，10，O μ g/ml的稀土掺杂氧化镓纳米晶体(实施例2制备)悬液，分别加入到含有细胞的孔中，其中Oyg/ml含有细胞的孔作为空白对照，每个浓度设置6个复孔，分别培养24h和48h后，分别加入5mg/ml的MTT溶液继续培养4h。然后用真空泵吸出培养液，加入200 μ I DMSO在酶标仪(Multiskan mk3)上振荡lOmin，用排枪将蓝色的DMSO转移至新的96孔板中,用酶标仪(Multiskan mk3) 570nm条件下测定其吸光度,各浓度复孔的吸光度取平均值。以空白组的细胞存活率为100%，并通过公式(2)计算各浓度梯度条件下细胞的存活率:细胞存活率％=(OD实验-OD背景对照孔/OD对照-OD背景对照孔)*100% 公式(2)公式(2)中，OD^:各浓度实验组吸光度的平均值；0Dm:对照组吸光度的平均值；0D背景对照孔:新的96孔板本身吸光度(即无蓝色DMSO溶液)的平均值。将Hela细胞分别更换为MCF-7细胞(中科院上海细胞库)，L929细胞(中科院上海细胞库)，其他操作同Hela细胞，毒性实验结果见图5所示，a为培养24小时的情况，b为培养48h的情况。结果表明当稀土掺杂氧化镓晶体浓度达到800 μ g/ml时，三种细胞的存活率均在80%以上，说明稀土掺杂的氧化镓纳米晶在此浓度范围内没有明显的细胞毒性，具有一定的生物相容性。实施例8:稀土掺杂的多孔氧化镓载药体的制备将盐酸阿霉素(浙江海正)用PBS (pH为6.5)缓冲液配成浓度为0.2mg/ml的药物溶液，加入0.002g实施例2制备的稀土掺杂氧化镓晶体，最终氧化镓纳米棒的浓度为盐酸阿霉素浓度的10倍(即盐酸阿霉素0.0002g)，超声(80W) lh，室温避光搅拌12h，12000rpm离心lOmin，收集上清液，并将沉淀用PBS (pH为6.5)洗涤3遍，收集洗涤液与上清液一起用于载药量的测定，取最终的沉淀于_80°C冻干48h，即得稀土掺杂的氧化镓载药体，其载药量为3.75%。通过紫外分光光度计测盐酸阿霉素在480nm处的吸光度值，根据标准曲线(图6所示)计算离心液中的药物的量，根据公式(I)计算稀土参杂的多孔氧化镓的载药量。载药量C=(Iii1-V1A1-V2A2)/ (InJmrV1A1-V2A2)^lO(Fc) 公式(I)
公式(I)中叫，m2分别代表加入的药物和稀土掺杂氧化镓晶体的质量，V1, V2分别代表上清液和洗涤液的体积，A1, A2分别代表上清液和洗涤液的吸光度。实施例9:将盐酸阿霉素用超纯H2O配成浓度为lmg/ml的药物溶液，加入0.0lg实施例2制备的稀土掺杂氧化镓晶体，最终氧化镓纳米棒的浓度为盐酸阿霉素浓度的10倍(即盐酸阿霉素0.0Olg), 80W超声Ih，室温避光搅拌12h，12000rpm离心lOmin，收集上清液，并用超纯H2O洗涤沉淀3遍，收集洗涤液，将最终的沉淀_80°C冻干，即得稀土掺杂的氧化镓载药体，其载药量为3.06%。实施例10:将0.005g盐酸阿霉素用PBS (pH为6.8)配成浓度为0.2mg/ml的药物溶液，加入
0.025g实施例2制备的稀土掺杂氧化镓晶体，最终氧化镓纳米棒的浓度为盐酸阿霉素浓度的5倍(即盐酸阿霉素0.005g),80ff超声lh，室温避光搅拌12h，12000rpm离心lOmin，收集上清液，并用PBS (pH为6.8)洗涤沉淀3遍，收集洗涤液，将最终的沉淀_80°C冻干，即得稀土掺杂的多孔氧化镓载药纳米棒，其载药量为8.0%。实施例11:将盐酸阿霉素用PBS (pH为6.8)配成浓度为0.3mg/ml的药物溶液，加入0.006g实施例2制备的稀土掺杂氧化镓晶体，最终氧化镓纳米棒的浓度为盐酸阿霉素浓度的I倍(即盐酸阿霉素0.006g)，80W超声lh，室温避光搅拌24h，12000rpm离心lOmin，收集上清液，并用PBS (pH为6.8)洗涤沉淀3遍，收集洗涤液，将最终的沉淀_80°C冻干，即得稀土掺杂的多孔氧化镓载药纳米棒，其载药量为23.47%。实施例12:稀土掺杂氧化镓载药体的释放曲线将实施例10所制备的稀土掺杂氧化镓载药体，以pH为5.5的PBS缓冲液作为释放介质，考察其在pH5.5条件下的释放行为。称取实施例10制备的氧化镓载药体5mg(盐酸阿霉素总含量为400ug)，混悬于3ml pH为5.5的PBS缓冲液中，于37°C条件下，恒温振荡(100rpm/min),考察其体外释放行为，在不同的时间点取出，将载药体悬液4000rpm离心lOmin，收集离心液在480nm条件下测定其吸光度，根据盐酸阿霉素的标准曲线则可计算出在此时间段所释放的药物浓度，释放体积为3ml，则可计算在此时间点的药物释放量Q。将离心后所得的沉淀，重新加入3ml释放介质继续释放。按公式(3)计算盐酸阿霉素的累计释放百分比:
权利要求
1.一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述方法为:(1)稀土掺杂氧化镓晶体:将氯化镓水溶液与稀土盐水溶液混合，再加入聚乙二醇，室温下搅拌混匀后调节pH值至4 8，将混合液于110 180°C下反应0.5 24h，反应结束后，将反应液冷却至室温并离心，取沉淀a干燥后于800 120(TC下煅烧2 8h，冷却至室温，获得所述稀土掺杂氧化镓晶体；所述氯化镓水溶液中氯化镓与稀土盐水溶液中稀土离子投料物质的量之比为1:0.005，所述聚乙二醇体积用量以氯化镓水溶液中氯化镓物质的量计为11111 2777ml/mo I ；(2)稀土掺杂氧化镓载药体:将待负载的药物溶于溶剂a中，超声溶解后制成药物溶液，再加入步骤(I)制备的稀土掺杂氧化镓晶体，超声分散后再在室温下避光搅拌12h 24h，离心分离，取沉淀b用溶剂b洗涤、冷冻干燥，获得所述稀土掺杂氧化镓载药体；所述待负载的药物为抗肿瘤药物；所述溶剂a为水或pH值5.5 7.4的PBS缓冲液，所述溶剂b与溶剂a相同；所述稀土 掺杂氧化镓晶体与待负载药物的质量比为1:0.1 I。
2.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述稀土盐水溶液中稀土离子为Tb3+、Eu2+或Cr3+中的一种或几种。
3.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述步骤(I)所述沉淀a干燥是在110°C下干燥24h。
4.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述步骤(I)所述稀土盐水溶液浓度为0.01 0.lmol/L，所述氯化镓水溶液的浓度为0.01 0.04mol/L。
5.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述待负载的药物为盐酸阿霉素、重酒石酸长春瑞滨或盐酸表阿霉素。
6.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述待负载的药物与溶剂a混合制成0.2 lmg/ml的药物溶液。
7.如权利要求1所述稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述稀土掺杂氧化镓晶体与待负载药物的质量比为1:1。
全文摘要
本发明公开了一种稀土掺杂氧化镓载药体的制备方法，所述方法为将氯化镓水溶液与稀土盐水溶液混合，再加入聚乙二醇，室温下搅拌混匀后调节pH值至4～8，将混合液于110～180℃下反应0.5～24h，反应结束后，获得所述稀土掺杂氧化镓晶体；将待负载的药物溶于溶剂a中，超声溶解后制成药物溶液，再加入稀土掺杂氧化镓晶体，超声分散后再在室温下避光搅拌12～24h，获得所述稀土掺杂氧化镓载药体；本发明稀土掺杂的多孔氧化镓晶体可以作为药物的载体，同时又可光致发光用于生物标记荧光成像，克服了常规的药物载体可载药但无法生物标记荧光成像，因此制备方法简单便捷，成本低，易于大规模生产，更有利于在临床实际中应用。
文档编号A61K47/04GK103230601SQ20131013315
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者金 一, 王新石, 王成润 申请人:浙江大学