乙酰乙酸在治疗肌肉疾病中的用途

乙酰乙酸在治疗肌肉疾病中的用途
【专利摘要】本发明涉及乙酰乙酸在治疗肌肉疾病中的用途。具体地，本发明涉及乙酰乙酸在治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和肌营养不良中的用途。本发明还涉及乙酰乙酸在制备促进肌肉干细胞激活增殖的药物中的用途，以及治疗肌肉疾病的含有乙酰乙酸的药物组合物。
【专利说明】乙醜乙酸在治疗肌肉疾病中的用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及己醜己酸在治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和肌营养不良中的用途。

【背景技术】
[0002] 骨骼肌作为人体最大的组织器官，是支持运动，产热的主要器官。骨骼肌组织蛋白 更新周期快，肌肉服大和肌肉再生是对收缩力度与营养吸收的适应。骨骼肌在维持稳态和 整个代谢过程中起着极其重要的作用。近年大量实验研究资料发现骨骼肌不仅仅是一个运 动和能量储备器官，也是一种重要的内分泌器官，具有分泌活性物质的功能，能表达、合成 和分泌多种生物信号分子，包括调节肤、细胞因子和生长因子等W。成体骨骼肌细胞是终末 分化细胞，在受到生物、物理、化学刺激后或在一定的生理病理条件下，肌肉干细胞激活，肌 肉具有再生能力。肌肉干细胞也被称为卫星细胞，位于肌细胞的质膜和周围基底层之间，可 发育分化为成肌细胞，后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。一般 情况，卫星细胞位于肌膜和基底膜之间，保持不分裂、静止状态但是，当肌细胞受到损伤 刺激时，卫星细胞作为肌肉干细胞即被激活、增殖并表达成肌细胞标记物，最终，该些细胞 同原有的骨骼肌细胞相互融合，或是彼此融合，形成新的肌纤维细胞W。
[0003] 肌肉疾病通常是指骨骼肌疾病。骨骼肌是执行机体运动的主要器官，也是机体能 量代谢的重要器官，人体共600多块肌肉，其重量约占成人体重的40%。骨骼肌是由数W 千计的纵向排列的肌纤维聚集而成，肌纤维（肌细胞）为多核细胞，外被浆膜（肌膜，即肌 细胞膜），其外层为基膜。细胞核位于肌膜下沿纵向排列，其数目可多达数千。肌纤维内含 有肌浆，肌浆内有肌原纤维和纵向排列的纵管，W及线粒体、核糖体、溶酶体等细胞器。肌 原纤维由许多纵向排列的含有收缩蛋白和调节蛋白的粗、细肌丝组成，粗肌丝含肌球蛋白 (myosin),细肌丝含肌动蛋白（actin)。该两种蛋白均为收缩蛋白。尽管肌纤维在解剖和生 理上表现为独立单位，但疾病可能仅侵犯其中一部分，根据病程的特点和严重性，剩余部分 也可能发生功能障碍或萎缩、变性或再生。尽管结构相同，并非所有的肌肉对疾病有同样的 易感性，事实上，某一疾病不可能侵犯机体的所有肌肉。一些肌肉的实质性病变如各种肌营 养不良和肌炎可直接损害肌原纤维；各种原因导致的肌病均可表现肌无力。
[0004] 肌营养不良是一组原发于肌肉组织的遗传病，临床上缓慢起病表现为进行性加重 的骨骼肌萎缩与无力，主要累及肢体近端肌肉，极少数为远端，膊反射消失，肌肉假性服大。 根据患者肌肉萎缩累及部位可分为多种类型；Duchenne/Becker型肌营养不良（DMD/BMD)， 面肩-化型肌营养不良，肢带型肌营养不良，股四头肌型、远端型、进行性眼外肌麻瘍型、目良 肌-咽肌型等。DMD型肌营养不良是最常见的一类进行性肌营养不良症，患病率为3. 3/10 万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传，主要是男孩发病，女性为致病基因的携 带者，通常5岁左右发病。肌萎缩是进行性的肌肉疾病，一般在20-30岁时伴随也肌功能衰 竭或呼吸困难等致死。
[0005] 为了更好的研究肌肉再生修复过程，历年来建立了许多肌肉损伤模型：如用氯化 顿肌肉注射引起化学损伤；蛇毒造成肌纤维细胞膜破损；还包括一些物理损伤模型如低温 冻伤，去神经支配，过度运动等；同时还有紫外照射引起DM破损及DM和蛋白的结合作用 破坏；现在越来越多的基因敲除和转基因小鼠遗传模型也被用于研究各种基因在肌肉损伤 再生中的功能。
[0006] 蛇毒细胞毒素（CTX，cardiotoxins)是一种常用的急性肌肉损伤再生模型W。CTX 是从眼镜蛇蛇毒中提取的由60-65个氨基酸组成的蛋白激酶C抑制剂，该类蛇毒使细胞膜 产生微孔造成肌纤维去极化和降解肌肉损伤后，大量巧离子涌入细胞内，导致胞内蛋白 降解，肌纤维快速坏死。肌纤维坏死引起一系列炎症反应，大量的炎症细胞浸润受损的肌纤 维。随后卫星细胞活化，卫星细胞增殖分化为肌源细胞，可W看到细胞核位于中间的新形成 的肌纤维。最后是新生成的肌纤维的成熟过程，包括瘤痕组织的收缩，肌肉损伤处的功能再 现。
[0007] Mdx小鼠是目前研究DMD肌营养不良最常用的模型，其为X染色体连锁的在第23 个外显子处自发的无义突变W。相对于人类DMD肌营养不良疾病，Mdx小鼠模型是一种温 和的周期性的肌病，在H周龄时出现最严重的肌肉损伤，然后周期性的损伤修复，其血清中 的肌酸激酶和丙丽酸激酶水平很高W，该也是肌营养不良中肌纤维降解的重要指标。
[0008] 对于生物体来说，细胞增殖往往与胚胎发育，生长W及肿瘤发生有密切联系。在高 等生物中，细胞的代谢与生长都有着紧密的联系。对于多细胞生物，大部分细胞都处于充足 的营养环境中，该就需要机体建立一种机制，控制细胞的无节制持续增殖W。一般哺乳动 物细胞通过生长因子/受体介导的信号传导起始细胞由静息状态进入细胞周期。由于细胞 在增殖分裂过程中需要合成大量的蛋白质、脂肪酸W及核酸，因此，细胞在增殖信号的刺激 下，细胞代谢发生了怎样的调节变化，细胞代谢又怎样调节细胞的增殖，该些是在细胞增殖 及代谢领域提出的比较重要的问题W。
[0009] 己醜己酸（AA)、目-轻基了酸及丙丽是脂肪酸在肝脏中氧化分解的中间产物，H 者统称为丽体。在饥饿条件、葡萄糖缺乏和新生个体中丽体是包括脑和肌肉在内的许多组 织的燃料，因此具有重要的生理意义hW。AA参与了许多生物生理活动，包括体外膜岛素释 放W，氧自由基形成脂质过氧化M等。AA能刺激伴侣分子介导的自我吞瞻"53,在 人脑微血管内皮细胞中AA上调细胞粘附分子早期研究在细菌生长期AA W信号分子的 形式调节ato-DA邸操纵子从而介导短链脂肪酸代谢。该些研究表明AA在细胞及生 物体中不仅能产生能量还可在一些生物过程中起调节作用。
[0010] 除了外界生长因子刺激，哺乳动物细胞细胞周期的调控也感知胞内一些重要的代 谢物调节细胞生长和生物合成，该些反馈多发生在信号蛋白的翻译后修饰水平hw。另外胞 内代谢物也可W调节染色体的稳定性来控制基因表达。葡萄糖代谢直接改变组蛋白的己醜 化状态和DNA甲基化状态。溶血磯脂酸（LPA)通过激活Gna i2-PKC信号通路促进骨骼肌 细胞分化和增生服大bw。越来越多的研究证明代谢中间产物直接或间接通过信号分子的 方式在各种生理病理过程中参与调节并发挥一定的功能。


【发明内容】

[0011] 本发明人通过一系列实验发现内源性代谢产物己醜己酸（AA)对肌肉疾病有明显 的改善及治疗作用。AA不仅在CTX诱导的急性肌肉损伤修复模型中通过激活肌肉干细胞 激活增殖加快肌肉再生进程，更在DMD肌营养不良模型即Mdx小鼠中较明显的改善了肌肉 的炎症细胞浸润，增加了肌纤维的直径，部分恢复了四肢的肌肉力量，加强了运动能力等。 进一步研究发现AA W信号分子形式激活了 ffiK-Erk信号通路并上调细胞周期调控蛋白 切ClinDl表达从而促进肌肉干细胞增殖。研究提示小分子代谢中间产物AA不仅可W参与 细胞代谢还能在哺乳动物肌肉干细胞中发挥功能，在人类肌肉疾病治疗中起到作用。
[0012] 因此，本发明的目的是提供己醜己酸在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。
[0013] 其中，所述肌肉疾病包括肌肉损伤和肌营养不良，所述肌营养不良包括Duchene/ Becker型肌营养不良、面肩-化型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头剂型、远端型、进 行性眼外肌麻瘍型、眼肌-咽肌型肌营养不良。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述肌营养不良为DMD肌营养不良。
[0015] 在另一个优选的实施方案中，所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
[0016] 本发明另一方面提供己醜己酸在制备促进肌肉干细胞激活增殖的药物中的用途。
[0017] 本发明进一步提供一种治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和肌营养不良的药物组 合物，其包含己醜己酸。其中，所述的肌营养不良包括Duchene/Becker型肌营养不良、面 肩-化型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头剂型、远端型、进行性眼外肌麻瘍型、目良 肌-咽肌型肌营养不良。特别地，所述肌营养不良为DMD肌营养不良，所述肌肉损伤为急性 肌肉损伤。
[0018] 本发明所述的药物组合物可W进一步含有任何一种药学上可接受的载体。
[0019] 术语"肌肉损伤"是指在直接外力或间接外力的作用下引起的肌肉的挫伤、拉伤 等，急性肌肉损伤是指肌肉的急性损伤。
[0020] 术语"肌营养不良"是指原发于肌肉组织的遗传病，临床上缓慢起病表现为进行性 加重的骨骼肌萎缩与无力，主要累及肢体近端肌肉，极少数为远端，膊反射消失，肌肉假性 服大。根据患者肌肉萎缩累及部位可分为多种类型；Duchenne/Becker型肌营养不良（DMD/ BMD)，面肩-化型肌营养不良，肢带型肌营养不良，股四头肌型、远端型、进行性眼外肌麻瘍 型、眼肌-咽肌型等。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图IA显示CTX诱导10-12周小鼠肌肉损伤再生3天时腔骨前肌横切面肥染色结 果。
[0022] 图IB显示肌肉损伤后3天腔骨前肌横切面上核在中央的肌纤维数目比例统计。
[0023] 图2A显示不同剂量AA处理后化巧（红色）和MyoD (绿色）免疫英光染色结果， DAPI染色(蓝色）定位细胞核。
[0024] 图2B显示化巧阳性细胞数量统计结果，每组统计2000个W上细胞。
[00巧]图2C显示MyoD阳性细胞数量统计结果，每组统计2000个W上细胞。
[0026] 图2D显示不同剂量AA处理后腔骨前肌中化巧和MyoD蛋白水平的检测结果， GAPDH作为定量对照。
[0027] 图3A显示损伤一天后MyoD和化巧双阳性细胞的免疫英光染色结果。
[0028] 图3B显示损伤一天后MyoD阳性细胞在化巧阳性细胞库（> 300个细胞）中的比 例。
[0029] 图4显示CTX诱导10-12周小鼠肌肉损伤再生，30mMM处理2, 3, 5和7天后腔骨 前肌横切面HE染色结果。
[0030] 图5A显示肌肉损伤后AA处理不同时间点（2, 3, 5和7天）化巧和MyoD免疫英光 染色结果。
[0031] 图5B显示肌肉损伤后AA处理不同时间点化巧阳性细胞数量统计结果，每组统计 2000个W上细胞。
[0032] 图5C显示肌肉损伤后AA处理不同时间点MyoD阳性细胞数量统计结果，每组统计 2000个W上细胞。
[0033] 图抓显示AA处理不同时间点腔骨前肌中化巧和MyoD蛋白水平的检测结果， GAPDH作为定量对照。
[0034] 图6A显示肌肉损伤后3天MyoD (红色)和化加（绿色)双阳性细胞的免疫英光染 色结果
[00巧]图她显示肌肉损伤后3天化加阳性细胞占MyoD细胞库中的百分比。
[0036] 图7A显示分离单根肌纤维体外培养体系中AA处理后卫星细胞中化巧和MyoD免 疫英光染色结果，每组统计40根左右肌纤维。
[0037] 图7B显示分离单根肌纤维体外培养体系中AA处理后单根肌纤维中化巧和MyoD 双阳性细胞的数量，每组统计40根左右肌纤维。
[003引图8A为AA处理组和对照组腔骨前肌（TA)横切面邸D浸染图片。
[003引 图8B为趾长申肌巧化)、比目鱼肌（SOL)和腔骨前肌（TA)中Evans Blue浸染的 面积统计结果。
[0040] 图8C为血清中肌酸激酶水平检测结果。
[0041] 图9A为AA处理60天后Mdx小鼠腔骨前肌横切面的肥染色结果。
[0042] 图9B为AA处理后腔骨前肌肌纤维横切面面积统计.
[0043] 图9C为Mdx小鼠四肢肌肉力量检测结果。
[0044] 图9D为小鼠跑步实验运动时间记录结果。
[0045] 图犯为化巧和MyoD蛋白水平的检测结果。
[0046] 图IOA为腔骨前肌损伤后，在AA处理组和对照组加入化学分子PD98059后 MyoD (绿色）免疫英光染色结果，DAPI (蓝色）染核。
[0047] 图IOB为腔骨前肌损伤后，在AA处理组和对照组加入化学分子PD98059后，各组 MyoD阳性细胞数量统计结果。
[0048] 图IOC为腔骨前肌损伤后，在AA处理组和对照组加入化学分子PD98059后，MyoD、 化巧、p-Erk、和Erk蛋白表达量检测结果。

【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体实施例详细说明本发明，该些实施例仅是用于阐明本发明，而不W 任何方式限制本发明。
[0050] 本发明所使用的己醜己酸（AA)购自Sigma公司（货号；A8509)。
[0051] 实施例IAA对肌肉损伤再生的作用
[0052] 1、动物处理
[0053] 从维通利华公司购买10周龄左右的雄性巧7BL/6小鼠后向其后肢左腿和右腿腔 骨前肌注射20微升蛇毒细胞毒素（口％日3'山〇1〇义111，51肖1113;溶于？88(8克化(：1，0.2克 KCl，0. 24克KH2PO4, 3. 58克化2册〇4. 12&0,溶于I升去离子水中，调节抑值至7. 4)，稀释至 终浓度为10 U M)造成肌肉急性损伤-再生修复模型，同时向右腿腔骨前肌注射20微升不 同浓度的AA (20、30和50mM，溶于去离子水；Sigma),然后每隔一天注射一次20微升与第 一次同等浓度的AA，左腿注射PBS作为对照组。
[0054] 2、肌肉组织收集
[0055] 肌肉损伤3天后断颈处死小鼠，用剪刀将后肢左右两腿皮毛剪开，找到小腿腔 骨，用纯綴子撕开腔骨外侧腔骨前肌表面的肌膜，从肌膊处剪断取下整块腔骨前肌。
[0056] 3、石蜡包埋及苏木素和伊红（肥）染色
[0057] 1)将取下的腔骨前肌固定在10%福尔马林（甲酵溶液1:10溶于PBS (如上所述配 制)）中24-48小时；
[0058] 2)固定后经70%、80%、95%、100%己醇各浸泡1小时至完全脱水；
[0059] 3)脱水后转移至二甲苯透明两次各半小时；
[0060] 4)在50-6(TC温度透蜡和包埋（Leica EG1150全自动包埋机）；
[0061] 5)修整蜡块样品，切片3-4微米（Leica RM2255全自动轮转切片机）；
[0062] 6)将切片分割开，投入到4(TC的温水浴中展片（Leica HI1220摊片机）后贴片至 载玻片上，在烫板（Leica HI1210烤片机）上6(TC烤干；
[0063] 7)将组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。无水己 醇中浸泡5分钟；95%己醇中浸泡5分钟；70%己醇中浸泡5分钟；最后入蒸觸水浸泡2分 钟；
[0064] 8)将已入蒸觸水后的切片放入苏木精水溶液中染色5分钟。酸水及氨水中分色， 各5-10砂钟。流水冲洗5分钟后入蒸觸水片刻。入70%和90%酒精中脱水各5分钟。入 酒精伊红染色液染色2?3分钟。
[0065] 9)染色后经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，用中性树胶封片。
[0066] 4、照相及数据统计
[0067] 用正置显微镜（Olypums BX 53)x20倍镜下照片，手动计数损伤区域单位面积上新 形成的核在中央的肌纤维数目。
[006引结论；如图1 A和图IB显示AA明显W剂量依赖方式促进肌肉再生，在AA组中，新 形成的核在中央的肌纤维明显增多并在30mMAA组时达到最多。
[0069] 实施例2AA促进肌肉干细胞即卫星细胞激活增殖的作用
[0070] 为了进一步确定AA在肌肉再生中的功能，本发明人检测了卫星细胞活化相关的 分子化巧和MyoD。化巧在静息和活化的卫星细胞中均有表达，MyoD仅在活化增殖后的卫 星细胞中表达用免疫英光染色技术和Western Blot检测了在肌肉再生中发挥重要 功能的肌肉干细胞(卫星细胞）激活增殖的marker分子化巧和MyoD表达。
[0071] 冰冻切片制备
[0072] 按照实施例1的操作取下新鲜腔骨前肌肌肉组织，将其放入盛有包埋剂(禮花， 4583)的模具中，将模具浸入液氮使其凝固，用全自动切片机（Leica CM3050)将包埋块切片 至10微米厚，将薄的切片贴至载玻片上，放入-7(TC冰箱中保存。
[0073] 化巧免疫英光染色
[0074] I)将冰冻切片从-7(TC冰箱中拿出放置室温瞭干；
[007引 2)于4%多聚甲酵中固定20分钟；
[007引 3) PBS中清洗3次，每次5分钟；
[0077] 4)在-2(TC甲醇中渗透6分钟；
[007引 5) PBS中清洗3次，每次5分钟；
[0079] 6)配置0. OlM巧樣酸轴缓冲液（0. 294克二水合巧樣酸H轴溶于100毫升PBS中， 调节抑值至6. 0)，预热至90°C ;
[0080] 7)将切片浸入热的巧樣酸轴缓冲液，8(TC赔育5分钟，换新预热的巧樣酸轴缓冲 液，8(TC再赔育5分钟；
[008。 8)室温冷却切片，PBS中清洗3次，每次5分钟；
[0082] 9 )在4 % BSA中室温封闭2-3小时；
[008引 10) PBS中清洗2分钟；
[0084] 11)稀释FAB (Jackson) 1:100至PBS中，在FAB中室温封闭30分钟；
[00财 12) PBS中清洗2分钟；
[0086] 13)与化巧抗体（DS皿，1:20溶于4% BSA中）于4°C赔育过夜；
[0087] 14) PBS中清洗2分钟；
[0088] 15)在0. 1%BSA中洗3次，每次10分钟；
[0089] 16)于 GaM-Biotin Gackson, 1:1000 溶于 4%BSA 中）室温赔育 45 分钟；
[0090] 17) PBS中清洗2分钟；
[0091] 18)在0. 1%BSA中洗3次，每次10分钟；
[0092] 19)于切3-Strep Gackson, 1:1000 溶于 4%BSA 中）室温赔育 30 分钟；
[0093] 20) PBS中清洗3次，每次10分钟；
[0094] 21) DAPI (Roche, 236276)染核，PBS 中清洗 10 分钟；
[009引 22)封片照相
[0096] MyoD免疫英光染色
[0097] 1)将冰冻切片从-7(TC冰箱中拿出放置室温瞭干；
[009引 2)于4%多聚甲酵中固定20分钟；
[009引 3) PBS中清洗3次，每次5分钟；
[0100] 4)在-20°C甲醇中渗透6分钟；
[0101] 5) PBS中清洗3次，每次5分钟；
[010引 6 ) 5%BSA室温封闭2小时；
[0103] 7)与 MyoD 抗体（Santa Cruz, 1:50 溶于 5% BSA 中）于 4°C赔育过夜；
[0104] 8) PBS中清洗3次，每次10分钟；
[0105] 9)二抗（山羊抗兔IgG,中杉金桥，ZF-0311)室温赔育1小时；
[0106] 10) PBS中清洗3次，每次10分钟；
[0107] IODAPI (Roche, 236276)染核，PBS 中清洗 10 分钟；
[0108] 12)封片照相
[0109] 在上述染色中，PBS (phosphate-buffered saline)为 8 克化Cl,0. 2 克 KC1，0. 24 克KH2PO4, 3. 58克化2册〇4. 12&0,溶于1升去离子水中，调节抑值至7. 4 ;4%多聚甲酵为4 克多聚甲酵（Sigma)溶于100毫升PBS中；4%BSA为将0. 4克BSA (化ckson)溶于10毫升 PBS 中，0. 1%BSA 为将 0. Ol 克 BSA (化ckson)溶于 10 毫升 PBS 中，5%BSA 为将 0. 5 克 BSA (经科宏达）溶于10毫升PBS中。
[0110] Western Blot检测蛋白表达
[0111] 1)将冻存的腔骨前肌肌肉组织从-7(TC冰箱取出置于液氮之中，而后取样；
[0112] 2)将组织放入匀浆器（IKA，TlO basic),置于冰上，加Iml匀浆缓冲液；
[0113] 匀浆缓冲液组成：

【权利要求】
1. 乙酰乙酸在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述肌肉疾病包括肌肉损伤和肌营养不良。
3. 根据权利要求2所述的用途，其中所述肌营养不良包括Duchenne/Becker型肌营养 不良、面肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头剂型、远端型、进行性眼外肌麻痹 型、眼肌-咽肌型肌营养不良。
4. 根据权利要求2所述的用途，其中所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
5. 根据权利要求3所述的用途，其中所述肌营养不良为DMD肌营养不良。
6. 乙酰乙酸在制备促进肌肉干细胞激活增殖的药物中的用途。
7. -种治疗肌肉疾病的药物组合物，其包含乙酰乙酸，其中所述肌肉疾病特别指肌肉 损伤和肌营养不良。
8. 根据权利要求7所述的治疗肌肉疾病的药物组合物，其中所述肌肉损伤为急性肌肉 损伤。
9. 根据权利要求7所述的治疗肌肉疾病的药物组合物，其中所述肌营养不良为DMD肌 营养不良。
【文档编号】A61P21/04GK104224766SQ201310242839
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月19日 优先权日:2013年6月19日
【发明者】朱大海, 邹小停, 孟姣, 张勇 申请人:中国医学科学院基础医学研究所