一种多孔白蛋白微纳米球制备工艺及内耳跨圆窗膜给药缓释载药体的制作方法
【专利摘要】内耳跨圆窗膜给药缓释微球载药体的制备方法，涉及一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物的内耳转运。可提供上述药物的包载和转运，避开血脑屏障和血迷路屏障，直接通过鼓膜穿刺技术跨圆窗膜进入内耳而发挥作用。这大大提高内耳局部的有效药物浓度，同时大大降低传统全身给药方式带来的毒副作用。公开一种制备多孔白蛋白微纳米球的技术方法及内耳局部给药的缓释载药体。取血清白蛋白溶于含有氯化钠的水溶液中，在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，经过水化处理后，加入戊二醛固定，离心、水洗干燥得到多孔白蛋白微纳米球空白载药体。以罗丹明B为模型药物与多孔微纳米球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微纳米球载药制剂。
【专利说明】—种多孔白蛋白微纳米球制备工艺及内耳跨圆窗膜给药缓释载药体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种经圆窗膜跨膜治疗内耳病的缓释载药微球制剂及其制备工艺，并指出可以携带一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。
【背景技术】
[0002]内耳病(包括耳蜗与前庭系统)的临床发病率约占耳科疾病的近1/3，如突发性耳聋、自身免疫性内耳病及梅尼埃病等，可导致不同程度的感音神经性耳聋和平衡机能障碍，严重影响患者的工作能力与生活质量。
[0003]长期以来临床上常采用全身给药治疗内耳病，其中糖皮质激素为有效的治疗药物之一。因高血压、糖尿病等系统性疾病则为全身激素治疗的禁忌，使得此类药物的应用受到限制。同时由于血一迷路屏障的存在，阻抑了药物在内耳的分布与扩散，导致治疗效果并不理想。内耳局部给药的研究一直受到耳科医师的关注。由于内耳与中耳之间存在一种膜性间隔即圆窗膜，其具有生物半透膜的性质，能允许多种药物通过，这使得药物可以不经过体循环而直接进入内耳即避免了血迷路屏障。目前常用的方法是通过鼓膜向鼓室内注射药物溶液的策略最具微创性。但该方法的局限性在于不能调控到达圆窗膜的药物浓度及难以有效控制药物与圆窗膜的接触时间，而后者是决定耳蜗内药物浓度的重要因素。结合近年来药物缓释剂型的发展，向鼓室内注射药物的缓释剂型体现了缓释技术与微创技术的结合，可能成为内耳疾病最优化的治疗方式，成为近年研究热点领域，鼓室跨膜给药缓释剂的研究尤为重要。迄今鼓室内药物治疗尚无标准方案，临床应用亟待规范。因此，研制新型跨圆窗膜缓释制剂在耳内科学中具有十分重要的应用前景。在生物制药和组织工程迅猛发展的今天，控释系统作为新型的药物载体具有缓释、靶向、生物利用度高等特点，是一种非常有前途的控释系统。血清白蛋白是一种天然的血清中的一种球蛋白，由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。其可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。但迄今为止临床上还没有一种真正的内耳局部跨膜给药的缓释制剂在应用，而应用血清白蛋白制备载药微球作为新型跨圆窗膜的药物载体在国内外未见报道，故本发明有着广泛的应用前景。
[0004]理想的耳用跨圆窗膜缓释制剂应具备以下特点:①药物迅速在内耳达到理想有效浓度，并维持此浓度适当时间；②在机体其它部位无药物分布或药物浓度仅在最低范围；③一旦治疗目的达到，药物立即从内耳消除选择的缓释辅料对机体无毒副作用；⑤可注射性；⑥可实现商品化生产，使用简便，易于推广。
[0005]多孔白蛋白微纳米球由于其增加了球的比表面积，更易携带大分子药物和非水溶性药物，是一种相当有前途的药物载体，目前国内外未见有该工艺的制备方法。本发明的制备工艺是在原有白蛋白纳米球制备工艺的基础上(已经申报发明专利，专利申报号为201310337363X，正在审核)通过水化处理，利用离心和干燥技术制备出空白多孔白蛋白缓释载药微球。这样有利于携带更多的药物分子，尤其是疏水性药物，同时还保留了白蛋白表面大量的有用基团，增强其对细胞的营养作用和对细胞增殖的促进作用。另外，本发明将其引入到跨圆窗膜内耳给药领域，不仅能很好发挥白蛋白自身的营养作用，同时由于其表面结构的特殊性使其更易于吸附携带其他药物而发挥缓释转运作用。因此本发明最大的特点在于制备的多孔白蛋白纳米球结构完整，制备方法简单、可重复性良好，低毒性、有很好的载药、缓释功能，适合药厂规模商品化生产。
【发明内容】
[0006]基于目前国内外尚无对内耳病(如突发性耳聋、梅尼埃病、噪声性耳聋)局部用药的缓释制剂在临床上应用。本发明的目的旨在针对现有技术的缺点，提供一种可在鼓室腔内注射给药、并能跨圆窗膜实现内耳药物转运的缓释载药微球的制备技术和工艺。这样既减少了给药量，增加了内耳局部的药物浓度，同时也大大降低了传统给药方式给患者带来的全身毒副作用。
[0007]本发明所述的多孔白蛋白微纳米球的制备方法及内耳跨圆窗膜给药缓释载药体制备技术如下:
[0008]I)取血清白蛋白溶于氯化钠水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；
[0009]2)在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混悬液；
[0010]3)进行水化处理后加入戊二醛进行交联固定，离心、干燥后形成稳定的血清白蛋白空白微球；
[0011]4)以罗丹明B为模型药物与微球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂。
[0012]可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。制备过程中血清白蛋白配制的浓度是5?15mg/ml，所述的氯化钠的浓度为5mmol?20mmol。按体积比氯化钠溶液与无水乙醇的加入比例为1:1?1: 8。无水乙醇的加入速度控制在1.0?5.0ml/min。水化处理加入水的量为10?100ml，戊二醛固化时间控制在30min?12h。离心后处理为真空干燥。加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。
[0013]总之，本发明采用改良去溶剂方法制备多孔白蛋白缓释载药微纳米球，制备过程中血清白蛋白配制的浓度是5?15mg/ml,氯化钠水溶液的浓度控制在5mmol?30mmol之间，氯化钠水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1:1?1: 8。无水乙醇的加入速度控制在1.0?5.0ml/min。水化处理水的用量为10?100ml。本发明确定了改良制备多孔白蛋白微纳米球的优化工艺，制备的多孔白蛋白微纳米球结构完整，粒径大小基本均一，理化性质稳定，重复性好，具有良好的控释能力，载药率可达到20 %，包封率可达到40 %，制备方法简单、低毒性、可以很好的包载药、体外释放具有良好的缓释功能，且工艺成本低，可望实现更大的经济效益。
[0014]附图文字说明
[0015]图1:多孔白蛋白微纳米球的扫描电镜下观察。(20000倍)
[0016]图2:多孔白蛋白微纳米球的扫描电镜下观察。(5000倍)
[0017]图3:多孔白蛋白微纳米球的透射电镜下观察。可见为表面多孔改变。
[0018]图4:载药(罗丹明B)的多孔白蛋白微纳米球的体外释放曲线，提示该材料具有缓释效果。
[0019]图5:①豚鼠听泡内注入罗丹明B-多孔白蛋白纳米球混悬液IH时的活体成像?’②豚鼠听泡内注入罗丹明B-多孔白蛋白纳米球混悬液24H时的活体成像；③豚鼠听泡内注入罗丹明B-多孔白蛋白纳米球混悬液48H时的活体成像。表明药物在鼓室内局部扩散。
[0020]图6:豚鼠听泡内注入罗丹明B-多孔白蛋白纳米球混悬液48H后，解剖分离出豚鼠圆窗膜并在体式显微镜下观察，可见圆窗膜表面完整，箭头所指处有多孔微纳米球附着聚集。
[0021]图7:激光共聚焦显微镜下观察载有罗丹明B的多孔白蛋白纳米球的影象。
[0022]图8:多孔白蛋白纳米球的细胞毒性实验(MTT法)
[0023]图9:空白多孔白蛋白纳米球的粒径分布图
[0024]图10:载有罗丹明B的多孔白蛋白纳米球的粒径分布图。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]取血清白蛋白10mg溶于1ml氯化钠水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，氯化钠水溶液与无水乙醇溶液的体积比为1: 3，无水乙醇的加入速度控制在1.5ml/min，形成乳白色血清白蛋白混悬液；水化处理后在戊二醛交联12H固化处理，离心、干燥后形成稳定的表面多孔白蛋白空白微纳米球(见图1，2，3)。空白多孔微纳米球的粒径分布(见图9)，其平均粒径为633.5nm。以罗丹明B为模型药物与多孔白蛋白微纳米球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载制剂，其粒径分布(见图10)，其平均粒径为739.Snm0微球理化性质稳定，重复性好，具有可注射性，可降解性。适合在局部跨膜注射给药。微球的载药率为15%，包封率为30%。
[0027]实施例2
[0028]取10mg多孔白蛋白空白微纳米球溶于1mlPBS缓冲液中充分混合，加入1mg罗丹明B孵育lOmin，放入专用的体外药物释放的小室内，按照每隔lh、4h、8h、12h、24h等顺序依次取出扩散池中的液体，在紫外分光光度计560nm波长测吸收值，根据标准曲线计算出药物释放的计量，算累计药物释放量，换算成百分比例，即累积释放药物的百分比，微球的体外释放曲线表示一周内药物的累计释放量为10%。(见图4)。
[0029]实施例3
[0030]取载有罗丹明B的多孔白蛋白微纳米球加入PBS中形成混悬液装入2ml注射器中备用。给予豚鼠腹腔内注射麻醉，麻醉成功后放置解剖台，取左耳后切口，暴露听泡，在显微镜下在听泡上打孔，用自制弯注射针头向听泡内注入0.1ml上述制备的混悬液。缝合封闭切口，碘伏消毒。以同法行右耳操作。之后在小动物活体呈像中按1H，24H，48H进行动态观察及记录。(图5)之后将豚鼠处死解剖内耳，暴露圆窗膜，在体式显微镜下进一步观察该处圆窗膜的表面白蛋白微纳米球附着情况。(图6)
【权利要求】
1.内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于其步骤如下: 1)取血清白蛋白溶于一定浓度氯化钠水溶液中，得到含有血清白蛋白的水溶液； 2)在磁力搅拌下加入无水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混悬液； 3)经过水化处理后，加入戊二醛固定处理，离心、水洗干燥后形成稳定的空白多孔白蛋白微纳米球； 4)以罗丹明8为模型药物与多孔白蛋白微纳米球共混依靠物理吸附形成粉红色复合缓释微球载药制剂。
2.如权利要求1所述的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征为可以包载一系列药物如激素类、神经营养因子类、抗自由基类、治疗美尼埃病药物如氨基糖甙类、颅内抗肿瘤类等药物。该多孔微球药可以附载水溶性的和非水溶性的药物。
3.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于所述的制备过程中血清白蛋白配制的浓度是5?151118 / 01。
4.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于所述的氯化钠的浓度为511111101?3011111101。
5.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于按体积比氯化钠溶液与无水乙醇的加入比例为1:1?1:8。
6.如权利要求所述的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于无水乙醇的加入的速度控制在1.0?5.01111 / 1111110
7.如权利要求所述的水化处理，即加入10?10001双蒸去离子水。
8.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在以戍二醒做交联固化，固化时间控制在30111111?1211。
9.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于离心后处理为真空干燥或冻干。
10.如权利要求所述的的内耳跨圆窗膜局部给药缓释微球制剂的制备方法，其特征在于加入的模型药物为物理混合吸附方式形成复合缓释制剂。
【文档编号】A61K31/352GK104337772SQ201310344813
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】于湛 申请人:于湛