一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，该方法包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。该方法不仅解决了不同毒力多杀性巴氏杆菌细菌造成攻毒剂量无法准确判断的问题，还有效解决了仔猪免疫猪萎缩性鼻炎灭活疫苗后免疫效果评价的问题。CCTCC NO：M201122320110628CCTCC NO：M201122120110628
【专利说明】一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗攻毒效检方法。
【背景技术】
[0002] 猪萎缩性鼻炎（atrophic rhinitis, AR)是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它 会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致 鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给 养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高， 症状一般出现在8-12周龄。猪萎缩性鼻炎通常是由支气管败血波氏杆菌（Bb)和多杀性巴 氏杆菌（Pm)共同导致。其中，支气管败血波氏杆菌血清型单一，毒力相对稳定，在萎缩性鼻 炎病变中起打开鼻粘膜门户的作用，进而让巴氏杆菌进入猪体内，造成萎缩性鼻炎的发生。
[0003] 疫苗免疫是预防猪进行性萎缩性鼻炎有效的方法，现有的猪萎缩性鼻炎疫苗效检 方法为攻毒效检和替代动物测定抗体，其中攻毒效检方法为免疫母猪对仔猪攻毒法，具体 为含有支气管败血波氏杆菌（Bb)和多杀性巴氏杆菌（Pm)抗原成分的猪萎缩性鼻炎疫苗 攻毒免疫母猪，同时设置未免疫母猪对照组，免疫母猪所产仔猪连同未免疫母猪所产仔猪7 日龄先Bb攻毒，10日龄进行Pm攻毒，42日龄处理仔猪观察结果。但尚未有用含有支气管 败血波氏杆菌（Bb)和多杀性巴氏杆菌（Pm)抗原成分的猪萎缩性鼻炎疫苗免疫仔猪后，来 检测攻毒效检的方法。
[0004] 并且，不同来源的多杀性巴氏杆菌菌株毒力也不完全相同，加上血清型众多，造成 了在攻毒效检时无法准确的判断出攻毒的剂量，以致于攻毒效检失败，攻毒模型无法建立， 进而无法准确判断出疫苗的效力。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方 法，所述方法不仅解决了不同毒力多杀性巴氏杆菌细菌造成攻毒剂量无法准确判断的问 题，还有效解决了仔猪免疫猪萎缩性鼻炎灭活疫苗后免疫效果评价的问题。
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法 包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。
[0007] 优选地，所述方法进一步包括攻毒菌毒液的制备步骤，所述攻毒菌毒液的制备步 骤包括将支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种分别于固体培养基平面活化，分别挑 取所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆于培养基培养，收获菌液；对所述支 气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌液细菌计数，确定菌液活菌含量。
[0008] 更优选地，所述支气管败血波氏杆菌为支气管败血波氏杆菌HN8株，所述多杀性 巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌D型HB4株。
[0009] 支气管败血波氏杆菌 HN8 株（Bordetella bronchiseptica HN8)保藏号为：CCTCC N0.M2011223,多杀性巴氏杆菌 D 型 HB4 株（Pasteurella multocida D Type HB4)保藏号 为：CCTCC NO. M2011221，保藏日期均为2011年06月28日，保藏地址均为：中国武汉，武汉 大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
[0010] 更优选地，所述培养支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆菌株的培养基 为固体培养基。
[0011] 使用本发明攻毒菌毒液的制备方法进行菌液的培养，预估出的活菌含量准确性更 高，对定量攻毒剂量的准确性有很大的提升。
[0012] 优选地，所述多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤包括通过多杀性巴氏杆菌对小 鼠半数致死量确定多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量。
[0013] 更优选地，其中所述多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量/多杀性巴氏杆菌对 小鼠半数致死量为1?2X IO3?1?2X IO4。
[0014] 优选地，所述对仔猪免疫后攻毒效检步骤包括：在免疫组仔猪免疫二免后用支气 管败血波氏杆菌和多杀性巴氏菌病毒混合液连同攻毒对照组仔猪进行鼻内攻毒，两个鼻孔 同时攻毒；最后一次攻毒后35日解剖仔猪，对仔猪鼻甲骨萎缩情况进行评分，攻毒对照组 至少80%仔猪鼻甲骨萎缩分数在8分及以上，免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数比攻毒对照 组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数统计学上显著降低。
[0015] 所述统计学上显著降低为免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数比攻毒对照组仔猪鼻 甲骨萎缩得分通过统计学分析，P〈〇. 05,差异显著。
[0016] 更优选地，所述仔猪免疫二免后第21天、第24天和第25天连续攻毒。
[0017] 更优选地，所述攻毒菌液中含猪支气管败血波氏杆菌HN8株2. 05 X IO9CFU/鼻孔， 含多杀性巴氏杆菌D型HB4株2. 2 X IO9?2. 2 X IOltlCFU/鼻孔。
[0018] 更优选地，所述仔猪7-10日龄首免，首免后14天进行二免。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0020] 本发明实施例以支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴氏杆菌LFB3株、P-2237株 和HB4株为例说明本发明。
[0021] 实施例1、不同毒力的多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定
[0022] 1 方法
[0023] I. 1 菌种
[0024] 支气管败血波氏杆菌 HN8 株（Bordetella bronchiseptica HN8)保藏号为：CCTCC N0.M2011223,多杀性巴氏杆菌 D 型 HB4 株（Pasteurella multocida D Type HB4)保藏 号为：CCTCC NO. M2011221，保藏日期均为2011年06月28日，保藏地址均为：中国武汉， 武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。多杀性巴氏杆菌LFB3 株来自 J. M. Rutter 博士（Compton, UK)，公开于 Evaluation of vaccines for atrophic rhinitis-a comparison of three challenge models (Vaccine20(2002) 1797 - 1802， T. Magyar等)，多杀性巴氏杆菌P-2237株公开于产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定（中国畜牧 兽医，2010, 37 (I) : 149-151 ;李伟杰等）。
[0025] 1. 2攻毒菌毒液的制备
[0026] 将保存的支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种划线于TSA (含10%鸡血清） 平板37°C培养16h，用BHI (10%甘油)洗下后混匀分装成5ml/瓶，保存于-70°C，融化后回 复计数计算每瓶冻干菌活菌数(重复回复计数三次取平均数)。按照实验方案调整菌液浓度 为攻毒所需浓度。
[0027] 1. 3不同毒力的多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定
[0028] L 3. 1不同毒力的多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死剂量
[0029] 三株毒力不同的多杀性巴氏杆菌LFB3株、P-2237株和HB4株，分别用以上三株菌 株的不同梯度浓度的菌液对小鼠攻毒，根据每个剂量小鼠死亡情况计算三株毒株对小鼠半 数致死剂量。
[0030] 1. 3. 2不同毒力的多杀性巴氏杆菌对仔猪攻毒
[0031] 三株毒力不同的多杀性巴氏杆菌LFB3株、P-2237株和HB4株，分别用以上不同剂 量的三株多杀性巴氏杆菌连同Bb对42日龄仔猪进行攻毒，每株多杀性巴氏杆菌设置三个 不同剂量组，每组实验仔猪数为5只。攻毒方式如下：仔猪42日龄进行第1次攻毒，间隔2日 后连续2日进行第2次和第3次攻毒，对于每组实验仔猪三次攻毒的方式和剂量相同。攻毒 时采用滴鼻的方式进行，将猪支气管败血波氏杆菌HN8株和猪多杀性巴氏杆菌菌液混合， 混合后的菌液中根据分装时回复计数预估值含猪支气管败血波氏杆菌HN8株2X IO9CFU/ ml，多杀性巴氏杆菌LFB3株、P-2237株和HB4株菌液含量分别见表1。攻毒时Iml/鼻孔， 两个鼻孔同时攻毒。逐日连续观察35日。攻毒的同时进行活菌计数，确定实际攻毒剂量， 猪支气管败血波氏杆菌HN8株实际攻毒剂量为2. 05 X IO9CFUAiI，多杀性巴氏杆菌LFB3株、 P-2237株和HB4株菌液实际攻毒剂量分别见表1。
[0032] 表1各组攻毒的多杀性巴氏杆菌及其剂量
【权利要求】
1. 一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂 量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括攻毒菌毒液的制备步骤，所 述攻毒菌毒液的制备步骤包括将支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种分别于固体 培养基平面活化，分别挑取所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆于培养基培 养，收获菌液；对所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌液细菌计数，确定菌液活菌 含量。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述支气管败血波氏杆菌为支气管败血波氏杆 菌HN8株，所述多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌D型HB4株。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述培养支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆 菌单克隆菌株的培养基为固体培养基。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤包括 通过多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量确定多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量/多 杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量为1?2X 103?1?2X 104。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对仔猪免疫后攻毒效检步骤包括：在免疫组 仔猪免疫二免后用支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏菌病毒混合液连同攻毒对照组仔猪 进行鼻内攻毒，两个鼻孔同时攻毒； 最后一次攻毒后35日解剖仔猪，对仔猪鼻甲骨萎缩情况进行评分，攻毒对照组至少 80%仔猪鼻甲骨萎缩分数在8分及以上，免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数比攻毒对照组仔 猪鼻甲骨萎缩平均分数统计学上显著降低。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述仔猪免疫二免后第21天、第24天和第25天 连续攻毒。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述攻毒菌液中含猪支气管败血波氏杆菌HN8株 2. 05X 109CFU/鼻孔，含多杀性巴氏杆菌D型HB4株2. 2X 109?2. 2X 101QCFU/鼻孔。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述仔猪7-10日龄首免，首免后14天进行二 免。
【文档编号】A61K49/00GK104415353SQ201310384961
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司