天麻素与钩藤碱配伍对血管内皮细胞的保护及作用机制的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种天麻素与钩藤碱配伍对人静脉内皮细胞损伤的保护作用。通过加入一定浓度的同型半胱氨酸诱导损伤内皮细胞，建立高血压细胞损伤模型。利用该模型，加入不同浓度的天麻素与钩藤碱配伍药物，测定乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等生化指标，检验配伍药物对受损内皮细胞的保护效果。运用Western?Blotting技术观察潜在信号通路上关键蛋白表达，证实该潜在通路即为配伍药物产生保护效应的细胞信号通路。本发明开创性地将天麻、钩藤两种降血压天然药物中有效成分配伍，研究其对高血压细胞损伤模型的保护。该配伍效果比使用任一单组分显著，机制明确，可成为传统中药二次开发的降血压药物。
【专利说明】天麻素与钩藤碱配伍对血管内皮细胞的保护及作用机制
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学【技术领域】，涉及天麻、钩藤两种天然降压药物有效成分:天麻素与钩藤碱的配伍，特别涉及两种成分配伍对人静脉内皮细胞的保护及作用机制。
【背景技术】
[0002]天麻是中国传统名贵中药，临床常用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症。天麻中含有多种化学成分，如天麻素、天麻醚苷、天麻多糖、香荚兰醇、香荚兰醛、对羟基苯甲醇，柠檬酸、琥珀酸等。
[0003]天麻素是至今可以分离得到的含量最多的单一成分，结构为对-羟甲基苯-β -D-葡萄吡喃糖苷。目前，天麻素在临床上多应用于头痛眩晕及高血压等心脑血管疾病的辅助治疗，效果显著。其降血压主要通过对抗儿茶酚胺的缩血管效应；降低外周血管阻力、血压和增加动脉血管顺应性；增加心脑血管血流量；抑制炎症早期的渗出和阻止血栓形成和调节内皮舒张/收缩因子的分泌对心脑血管及神经细胞保护发挥作用。
[0004]在大鼠离体主动脉预收缩实验中，天麻素显示出一定的血管舒张作用。舒张效果随浓度的增加呈现增强趋势，当天麻素浓度为1.00g/L时血管舒张率达到最大值64%。进一步的研究表明，天麻素的降压作用可能是通过改善血管内皮功能来实现的
[0005]钩藤，原名钓藤。具有清热平肝；熄风止痉之功效。主治小儿惊风；夜啼；热盛动风；子痫；肝阳眩晕；肝火头胀痛。中医理论认为，钩藤具有预防和治疗心血管疾病的药理作用，包括抗血栓，抗心律失常和降血压。研究表明，钩藤茎枝含有多种吲哚类生物碱，包括钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱、异柯诺辛碱、柯楠因碱等多种化合物。
[0006]钩藤碱和异钩藤碱为钩藤的主要有效活性成分，钩藤碱、异钩藤碱及钩藤总碱均有明显的降血压作用。大鼠麻醉后经颈总动脉插管记录外周血压，静脉注射钩藤提取物:异钩藤碱、钩藤碱、钩藤总碱及非生物碱部分，实验表明钩藤中4种成分的降压强度为异钩藤碱(42.0% ) >钩藤碱(32.1% ) >钩藤总碱(21.3% ) >非生物碱(12.4% )。提示钩藤中主要降压成分为异钩藤碱和钩藤碱。
[0007]中药复方强调整体上调节机体，治疗效果更好，因此便需要以配伍中药入药，配伍的各个药物之间能相互协同或拮抗，其治疗作用远非单味中药能比。最具代表性的是我国中医药中用于治疗高血压的主要方剂——天麻钩藤饮。钩藤味甘性凉入肝、心经清热平肝、熄风定惊擅治肝热风动之证；天麻甘平柔润，入肝经养液平肝、息风潜阳为治风之圣药，多用于虚风内动、风痰上扰所致诸证。二药合用，共奏清热平肝、息风止痉之功效。
[0008]临床研究发现，天麻钩藤饮对高血压有很好的疗效。用天麻钩藤的混合液进行降血压研究，发现混合液的降血压效果比单味天麻、钩藤提取液显著。但是长期以来，中药复方成分复杂，作用机制不明确等问题一直困扰传统中药的发展。
[0009]天麻素和钩藤碱提取自天麻和钩藤两味君药主要成分，成分明确，质量可控，创新之处在于提取了复方中发挥君药作用的单体，再将这些单体进行组合。不同于传统复方，这种组合将使治疗作用更加集中，动物实验结果也证实了这一点。以大鼠胸主动脉为对象，考察血管的舒张效果。与每一种单体相比，钩藤碱、天麻素2种单体组合配伍时，对预收缩血管的舒张作用均有不同程度的增强，并且最大舒张效果都高于复方。在此基础上深入研究单体配伍成分对内皮细胞的保护作用，有利于阐明天麻素与钩藤碱配伍降血压作用机制，为中药二次开发提供新思路。
[0010]同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是一种含巯基的氨基酸，是甲硫氨酸(methionine, Met)和半胱氨酸(cysteine, Cys)代谢过程中的一个重要中间产物。研究发现血中HCY浓度升高可损伤血管内皮细胞，并能诱导或抑制内皮细胞中多种基因的表达。高同型半胱氨酸血症通过氧化应激机制诱发心血管疾病，HCY在氧化反应中，可产生超氧化物阴离子、过氧化氢及羟基等活性氧物质(reactive oxygen species, ROS),其可与NO反应加速NO失活，降低NO生物利用度；HCY本身也能与NO反应，直接导致NO浓度降低，使内皮细胞明显受损伤；HCY还能使低密度脂蛋白自身氧化，生成氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized low density lipo-protein, OX-LDL),而后者可被巨卩遼细胞摄取并转变为泡沫细胞导致血管内皮细胞功能的进一步损伤，同时可影响一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase, NOS)的表达进一步使NO合成减少。因此应用HCY可以模拟高血压病理条件下细胞损伤模型。
[0011]Caveolae是细胞质膜表面具有一定生物学功能的锥形瓶样内陷，Caveolins是Caveolae上的活性蛋白，有三种功能不同的微囊蛋白:Caveolin_l (CAV-1)、CaveoI in-2 (CAV-2)、Caveol in_3 (CAV-3)，其中 CAV-1 是 Caveolae 的最重要的表面标记蛋白和结构蛋白，CAV-1肽链中间由疏水性氨基酸形成一个发夹样结构，将其锚定在细胞膜上，其相应的氨基酸序列的N端和C端都位于细胞浆中。CAV-1通过N端一段包含41个氨基酸残基序列的相互作用，形成14-16个单体组成的同聚体，而C端的44个氨基酸残基使这些同聚体能相互连接。 CAV-1使Caveolae锚定在细胞骨架上，并富集于高尔基体和内质网中，在高尔基体及胞膜区域之间穿梭并调控信号通路，在细胞分化、发育、迁移、炎症、应激、免疫等方面发挥重要作用。
[0012]在血管内皮细胞中关于CAV-1的研究大多集中在其与eNOS的相互作用，影响NO合成。在静息条件下，微囊中的CAV-1对eNOS有负调控作用，eNOS与CAV-1的相互作用是eNOS和CAV-1脚手架区域(OTS)直接结合的结果。NO由eNOS合成，eNOS催化L-精氨酸(L-arginine)转化成 L-瓜氨酸(L-citrulline)和 NO。当 eNOS 结合到 CSD 上时，eNOS 失活，导致NO的合成受到了限制。在CDS中的第89-95氨基酸残基是起到抑制作用的主要部位，特别是第92位的苯丙氨酸对eNOS的抑制起到决定性的作用。在开发心血管保护药物中，研究作用于CAV-1/eNOS调节的药物十分必要，前景广阔。因为NO是正常生理活动进程的中心，内皮细胞中NO的异常将导致高血压等疾病。因此，CAV-1是一个重要的血压决定蛋白，在高血压病中起着重要的作用。
【发明内容】
[0013]本发明的第一个目的在于提供了一种针对治疗高血压，保护人静脉内皮细胞的天然药物活性成分配伍。本发明基于传统中药复方天麻钩藤饮中降血压的活性成分作为配伍对象，同时避免了中药成分复杂，作用机制不明确，质量难以控制的缺点，配伍使用比单味药作用更加显著。[0014]保护人静脉内皮细胞的天然降血压药物配伍，其配伍成分为:天麻素与钩藤碱。本发明涉及的天然降血压药物配伍重量比例为，天麻素:钩藤碱=(0.1~10): I
[0015]本发明第二个目的是确证了该配伍药物对人静脉内皮细胞的保护作用是通过CAV-1/eNOS/NO信号转导途径实现。
[0016]根据高血压细胞损伤通过氧化应激机制减少NO诱发心血管疾病的特点，候选CAV-1/eNOS/NO信号转导途径作为潜在配伍药物的靶点。具体方法是将天麻素钩藤碱配伍药物加入构建好的细胞损伤模型中，通过检测LDH、MDA、NO等生化指标，检验配伍药物对受损内皮细胞的保护效果，运用Western Blotting技术观察潜在信号通路上CAV-1蛋白表达量验证药物发挥保护作用的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1天麻素钩藤碱配伍药物对内皮细胞保护效应量效曲线
[0018]图2MDA含量测定
[0019]图3LDH释放量测定
[0020]图4N0含量测定
[0021]图5ECV-304细胞中CAV-1蛋白表达水平
[0022]图6CAV-1与β -actin表达量比值
【具体实施方式】
[0023]药品与试剂
[0024]天麻素(gastrodin,98<% );钩藤喊(rhynchophylla, 90% ) ;DMEM 培养基(Gibco公司)；MTT (Sigama公司)；DMS0分析纯(南京化学试剂有限公司)；同型半胱氨酸(阿拉丁公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Gibco);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)；化学发光剂(北京碧云天公司)；抗体(Anbo公司)
[0025]细胞与培养
[0026]人脐静脉内皮细胞株ECV-304:购于武汉大学“中国典型培养物保藏中心(CCTCC) ”培养条件:5% CO2、37°C、完全培养基(1OOmL完全培养基中含DMEM培养基90mL，胎牛血清10mL，双抗ImL) 12h后将培养基小心移除，PBS清洗，重新添加培养基6mL，待细胞长满后将培养基移除，用PBS清洗后，用0.25%胰酶于37°C下消化，加入培养基，按I传2比例传代。冻存液按DMSO: FBS: DMEM=I: I: 8冻存细胞。
[0027]实施例1天麻素钩藤碱配伍对ECV-304细胞活力的影响
[0028]分组:(I)对照组:加入10% DMEM培养基；(2)模型组:1000 μ mo I r1Hcy ； (3)天麻素组:100 μ g.mL_1 (4)钩藤碱组:100 μ g.mL—1 (5)实验组:分别加入含有不同浓度天麻素钩藤碱(0.1~10): I配伍的10% DMEM培养基；(6)调零组:加入无细胞培养基。每组设6个复孔。
[0029]细胞活力检测:(1)收集对数期EVC-304细胞，待细胞长满80~90%后，实验组加入不同浓度药物溶液100 μ L0对照组和调零组加入培养基100 μ L0每孔终体积100 μ L0
(2)5% C02，37°C分别孵育12、24、36、48h，倒置显微镜下观察。每孔加入16 μ LMTT溶液，在37°C恒温培养箱中继续培养4h。(3)将上清吸净，加入DMSO，使蓝色结晶物充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光度。设对照组的细胞相对活力为1，其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值。作用细胞12h、24h、36h、48h无明显细胞毒性，最终确定药物溶液与细胞作用36h最佳。
[0030]为了进一步确定最佳用药浓度范围，测定量效关系，结果如图1所示。根据量效关系曲线，选取药物浓度为5、10、50、100μ g.mL—1。
[0031]实施例2天麻素钩藤碱配伍对HCY损伤的ECV-304细胞模型保护效果测定
[0032]根据实施例一确定的用药浓度和分组，每组设4个复孔。根据乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、NO试剂盒说明书方法测定各项生化指标，试验结果如图2~图4所示。根据结果表明:与模型组相比，天麻素钩藤碱配伍降低MDA和LDH的释放，同时能够增加血管内皮细胞NO的释放，对ECV-304细胞保护比使用同浓度单组分效果更加显著。实施例3天麻素钩藤碱配伍对ECV-304细胞中CAV-1蛋白表达量的影响
[0033]提取细胞中总蛋白，Western Blot检测凝胶图像处理系统分析目标带。分析结果如图5、图6所示。与对照组相比，模型组能够增加细胞CAV-1的表达量。实验组中，低浓度的药物(5 μ g .mr1及10 μ g .mL-1)能够抑制Hcy损伤细胞CAV-1的表达量，高浓度药物(50 μ g.ml-1及100 μ g.ml-1)对损伤细胞CAV-1表达量的抑制作用不明显。该结果表明，天麻素钩藤碱配伍药物对Hcy诱导的血管内皮细胞损伤保护具有不可逆恢复性特点，作用机制是通过CAV-1/eNOS/NO信号通路，从而实现降血压的功效。
【权利要求】
1.保护人静脉内皮细胞的降血压天然药物活性成分配伍，其特征在于:该配伍活性成分为，天麻素、钩藤碱。
2.根据权利要求1所述的降配伍活性成分，其特征在于:该配伍中活性成分的质量比值为，天麻素:钩藤碱=(0.1-10): I。
3.根据权利要求1所述的人静脉内皮细胞，其特征在于:所述人静脉内皮细胞为ECV-304 细胞。
4.根据权利要求1所述的人静脉内皮细胞保护作用，是在模拟高血压细胞损伤模型中，加入不同浓度天麻素钩藤碱配伍药物后，与模型组比较，药物组中LDH、MDA释放量下降，NO生成量增加，关键蛋白Caveo`lin-1表达量降低作为保护作用的评价指标。
【文档编号】A61P9/12GK103446168SQ201310413513
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】许激扬, 卞筱泓, 沃龙飞, 危喜玲 申请人:中国药科大学