自发荧光骨修复磁性缓释微球的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种自发荧光骨修复磁性缓释微球及其制备方法，采用溶剂热法合成纳米Fe3O4,将纳米Fe3O4均匀分散于海藻酸钠溶液中，同时复合对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷；将混合物通过微囊成型装置，滴入凝胶浴中形成初级微球；再将初级微球浸没于壳聚糖溶液中，利用壳聚糖和海藻酸钠的电荷互补特性形成聚电解质半透膜，并将复合微球与京尼平交联，制备自发荧光骨修复磁性缓释微球。本发明充分考虑了作为植入性骨修复材料对细胞毒性的要求，选用具有优良生物相容性和降解性的壳聚糖和海藻酸钠为原料，并可根据骨病损处的需要通过调节电压大小来制备不同粒径的微球。
【专利说明】自发荧光骨修复磁性缓释微球
【技术领域】
[0001]本发明属于骨填充材料制造领域，具体涉及一种自发荧光骨修复磁性缓释微球及其制备方法。
【背景技术】
[0002]创伤、骨组织炎症及先天性缺陷引起的骨缺损以及骨癌等骨组织疾病在骨科临床上很常见，单纯依靠骨的自我修复能力比较有限，临床上常常采用骨移植手术治疗骨组织疾病。因此，骨修复材料的研究与开发具有重大意义。近年来，微球、微囊等在生物医学领域的研究已经得到越来越多的重视。微球是一种以适宜高分子材料为载体制成的球形或类球形微粒，粒径一般为I~500 μ m,小的可以是几纳米,大的可达800 μ m。
[0003]壳聚糖和海藻酸钠由于其充足的来源和低廉的成本，具备了载药微球的规模化研发需求。二者都是天然多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性的特点。海藻酸钠分子链上有大量的羧基，在溶胶状态下与二价金属阳离子共存时，二价金属阳离子能够引发海藻酸钠溶液由液相向凝胶相转变。壳聚糖为聚阳离子高分子材料，海藻酸盐为聚阴离子化合物，二者可通过正、负电荷相互吸引发生络合反应形成聚电解质复合物半透膜。
[0004]淫羊藿苷为传统中药淫羊藿的茎叶提取物，研究发现，淫羊藿苷可使成骨细胞的生长曲线上移，S期细胞百分率升高，Gl期细胞百分率减少以及BMP-2蛋白表达量增加，从而促进骨的再生。
[0005]传统的交联方法大都使用化学合成类交联剂，交联剂本身具有相对较高的细胞毒性，导致所得的生物材料在植入受体以后，影响正常组织的生长。京尼平从京尼平甙中分离、提纯而获得的，具有羟基、羧基等多个活性官能基团，可与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制备生物材料，是一种优良的天然生物交联剂，比传统交联剂更具有良好的生物相容性。有关研究表明，京尼平 与壳聚糖交联的产物具有自发荧光的特性。利用京尼平与壳聚糖反应产物的荧光特性，开发了其在复合微球成像与示踪以及微球降解过程中结构观察的潜在应用。此外，其荧光特性或许能为研究细胞与支架材料之间的相互作用，以及观察细胞在微球表面的黏附、定位和迁移提供一种有效的手段。
随着生物医学工程的发展，电磁场的生物学效应越来越受到人们的重视。古代已有利用电磁场治疗骨组织疾病的历史，临床上电磁场已被广泛应用于治疗骨折、骨不连、骨质疏松等骨科病症，并已取得满意的效果。成骨细胞作为骨发生细胞，对于骨损伤的修复与重建至关重要。研究发现，磁场可以通过直接作用于成骨细胞的DNA，影响基因的表达和促进蛋白质的合成从而促进细胞的增殖。电磁场基础研究结果显示，外加静磁场能显著上调细胞分化和新的骨基质合成水平，并能够诱导成骨细胞长入植入材料并异位成骨。此外，医学上还常常将电磁场(如高频电磁场)的热效应用于肿瘤的高温治疗:通过将磁流体注射到肿瘤组织，磁流体在外加交变磁场的作用下产生能量，产生的能量释放给肿瘤组织，由于肿瘤中的血液供给不如正常组织充足使得肿瘤细胞中热量扩散较缓慢，造成局部温度升高，从而达到杀死肿瘤的目的。[0006]基于目前的基础研究成果，本研究以治疗和修复骨癌、骨缺损等骨组织疾病为目的，将具有超顺磁性的四氧化三铁纳米颗粒复合到高分子材料中，制成负载传统中药-淫羊藿苷的控缓释微球并植入骨缺损部位；高分子材料中的超顺磁性纳米颗粒可以对外加磁场产生响应，在微球内部形成无数微小磁场，对成骨细胞形成持续的微弱磁力刺激，从而有望更好地治疗并修复骨癌、骨缺损等骨组织疾病。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种自发荧光骨修复磁性缓释微球及其制备方法，充分考虑了作为植入性骨修复材料对细胞毒性的要求，选用具有优良生物相容性和降解性的壳聚糖和海藻酸钠为原料，并可根据骨病损处的需要通过调节电压大小来制备不同粒径的微球。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，是采用溶剂热法合成纳米Fe3O4，将纳米Fe3O4均匀分散于海藻酸钠溶液中，同时复合对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷；将混合物通过微囊成型装置(装置详见专利CN00218100.2)，滴入凝胶浴中形成初级微球；再将初级微球浸没于壳聚糖溶液中，利用壳聚糖和海藻酸钠的电荷互补特性形成聚电解质半透膜，并将复合微球与京尼平交联，制备自发荧光骨修复磁性缓释微球。包括以下步骤:
(1)将FeCl3.6H20粉末、乙二醇和醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中反应，所得产物用无水乙醇和去离子水洗涤数次，离心，真空干燥，得纳米磁性Fe3O4粉末；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子 水中，磁力搅拌至完全溶解；
(3)往步骤(2)的溶液中加入步骤(1)的纳米磁性Fe3O4粉末，电动搅拌至溶液混合均
匀；
(4)在步骤(3)的溶液中加入淫羊藿苷的乙醇溶液，磁力搅拌至溶液混合均匀；
(5)采用微囊成型装置，用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在壳聚糖的乙酸溶液中反应，所得微球用去离子水清洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在京尼平醇溶液中进行水浴交联反应，所得微球用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0009]微球包括以下质量百分数的组分:
海藻酸钠1%~1.6%
纳米磁性Fe3O4粉末 0.008~0.013%
淫羊藿苷0.01~0.05%
壳聚糖0.5%~1%
京尼平0.1~0.8%。
[0010]各步骤的工艺参数如下:
步骤(1)中FeCl3.6H20粉末质量为1.35g,乙二醇体积为40ml，醋酸钠质量为3.6g，反应温度为200°C，反应时间为12h，真 空干燥温度为40°C ；
步骤(5)中的凝胶浴为二价阳离子溶液，质量分数为2%~8% ；
步骤(6)中反应温度为37°C，反应时间为8-16h ；步骤(7)中30~45°C水浴交联24-36h。
[0011]所述二价阳离子为Ba2+、Ca2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+ 中的一种。
[0012]本发明的显著优点在于:
(I)制备方法简单，整个反应过程条件温和，未添加有毒的有机溶剂、交联剂和乳化剂等，原料廉价易得，市场前景广阔。
[0013](2)微球各组分生物相容性优越，在人体内降解无毒副作用。
[0014](3)海藻酸钠与壳聚糖形成的聚电解质半透膜，能控制药物淫羊藿苷的释放。
[0015](4)京尼平与壳聚糖交联不仅起到进一步巩固微球结构的作用，而且使得微球具有自发荧光的特性。
[0016](5)微球中复合的纳米Fe3O4和药物淫羊藿苷有望在治疗和修复骨癌、骨缺损疾病的同时促进正常新骨组织的生成。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是自发荧光骨修复磁性缓释微球的结构示意图。
[0018]图2是自发荧光骨修复磁性缓释微球的SEM扫描电子显微镜图。
[0019]图3是纳米四氧化三铁和自发荧光骨修复磁性缓释微球的磁滞回归线图。
[0020]图4-5是自发荧光骨修复`磁性缓释微球与成骨细胞体外复合培养的第4、6倒置荧光显微镜图片。
[0021 ] 图6是自发荧光骨修复磁性缓释微球，在激发波长为488nm时的激光共聚焦图片。
[0022]图7是自发荧光骨修复磁性缓释微球与成骨细胞体外复合培养第6天，Hoechst33258细胞荧光染色，在激发波长为488nm的激光共聚焦图片。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
(1)将1.35g FeCl3.6H20与40ml乙二醇、3.6g醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中，反应Ia后，将获得的产物用无水乙醇洗涤数次，去离子水洗涤数次，离心，40°C真空干燥；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，质量百分比为1.2%，磁力搅拌Ih ；
(3)往上述溶液中加入制备好的纳米磁性Fe3O4粉末，质量百分比为0.008%,电动搅拌
Ih ；
(4)加入淫羊藿苷的乙醇溶液，质量百分比为0.02%，磁力搅拌Ih ；
(5)使用微囊成型装置，电压为1.3kv,用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在质量百分比为0.6%的壳聚糖乙酸溶液中反应8h，用去离子水清
洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在质量百分比为0.3%京尼平醇溶液中反应24h，用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0024]实施例2
(I)将1.35g FeCl3.6H20与40ml乙二醇、3.6g醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中，反应ia后，将获得的产物用无水乙醇洗涤数次，去离子水洗涤数次，离心，40°C真空干燥；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，质量百分比为1.4%，磁力搅拌Ih ；
(3)往上述溶液中加入制备好的纳米磁性Fe3O4粉末，质量百分比为0.008%,电动搅拌
Ih ；
(4)加入淫羊藿苷的乙醇溶液，质量百分比为0.03%，磁力搅拌Ih ；
(5)使用微囊成型装置，电压为1.3kv,用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在质量百分比为0.8%的壳聚糖乙酸溶液中反应10h，用去离子水清洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在质量百分比为0.3%京尼平醇溶液中反应28h，用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0025]实施例3
(1)将1.35g FeCl3.6H20与40ml乙二醇、3.6g醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中，反应Ia后，将获得的产物用无水乙醇洗涤数次，去离子水洗涤数次，离心，40°C真空干燥；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，质量百分比为1.5%，磁力搅拌Ih ；` (3)往上述溶液中加入制备好的纳米磁性Fe3O4粉末，质量百分比为0.01%,电动搅拌
Ih ；
(4)加入淫羊藿苷的乙醇溶液，质量百分比为0.03%，磁力搅拌Ih ；
(5)使用微囊成型装置，电压为1.3kv,用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在质量百分比为0.5%的壳聚糖乙酸溶液中反应12h，用去离子水清洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在质量百分比为0.3%京尼平醇溶液中反应36h，用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0026]实施例4
(1)将1.35g FeCl3.6H20与40ml乙二醇、3.6g醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中，反应12h后，将获得的产物用无水乙醇洗涤数次，去离子水洗涤数次，离心，40°C真空干燥；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，质量百分比为1.0%，磁力搅拌Ih ；
(3)往上述溶液中加入制备好的纳米磁性Fe3O4粉末，质量百分比为0.013%，电动搅拌
Ih ；
(4)加入淫羊藿苷的乙醇溶液，质量百分比为0.02%，磁力搅拌Ih ；
(5)使用微囊成型装置，电压为1.3kv,用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在质量百分比为1%的壳聚糖乙酸溶液中反应10h，用去离子水清
洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在质量百分比为0.6%京尼平醇溶液中反应28h，用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0027]实施例5
(1)将1.35g FeCl3.6H20与40ml乙二醇、3.6g醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中，反应Ia后，将获得的产物用无水乙醇洗涤数次，去离子水洗涤数次，离心，40°C真空干燥；
(2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，质量百分比为1.4%，磁力搅拌Ih ；
(3)往上述溶液中加入制备好的纳米磁性Fe3O4粉末，质量百分比为0.015%，电动搅拌
Ih ；
(4)加入淫羊藿苷的乙醇溶液，质量百分比为0.05%，磁力搅拌Ih ；
(5)使用微囊成型装置，电压为1.3kv,用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球；
(6)将初级微球浸没在质量百分比为0.8%的壳聚糖乙酸溶液中反应14h，用去离子水清洗；
(7)将步骤(6)中的微球浸没在质量百分比为0.5%京尼平醇溶液中反应34h，用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
[0028]将所制备的一系列微球进行结构和性能表征，并采用乳鼠成骨细胞建立复合微球的体外评价模型，在孔板底部放置一块磁铁，给以微球一个外加恒定磁场，考察自发荧光骨修复磁性缓释微球的细胞学特性。
[0029]结论:图1可知自发荧光骨修复磁性缓释微球的核-壳结构，从图2中可以看出微球粒径约为150μπι~200μπι，形貌比较圆整，表面粗糙，呈现许多沟壑。图3可知，磁性Fe3O4为纳米级别，自发荧光骨修复磁性缓释微球的饱和磁化强度由于有机基质的存在，t匕磁性Fe3O4的低许多。从图4，5中可以看出，细胞在微球上长势良好。微球与成骨细胞复合培养几天后，细胞铺满孔板底部，开始向微球表面攀爬生长，随着培养时间的延长，成骨细胞渐渐包裹整个微球表面，微球表面上的细胞呈梭形或三角形，细胞胞质透明，这表明微球与细胞复合培养过程中，细胞保持着良好的生长状态。图6为微球在波长为488nm时自发荧光图像，呈现绿色。图7为微球上的活细胞在波长为488nm处发出蓝靛色荧光图像。蓝靛色圆点即细胞，从图中可以看出，细`胞在微球上长势良好。这些结果都表明了原位复合制备的复合微球具有良好的生物相容性，具有作为骨填充材料进行局部定向释药的潜力。
[0030]以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，其特征在于:采用溶剂热法合成纳米Fe3O4，将纳米Fe3O4均匀分散于海藻酸钠溶液中，同时复合对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药-淫羊藿苷；将混合物通过微囊成型装置，滴入凝胶浴中形成初级微球；再将初级微球浸没于壳聚糖溶液中，利用壳聚糖和海藻酸钠的电荷互补特性形成聚电解质半透膜，并将复合微球与京尼平交联，制备自发荧光骨修复磁性缓释微球。
2.根据权利要求1所述的自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将FeCl3.6H20粉末、乙二醇和醋酸钠，磁力搅拌均匀后，置于反应釜中反应，所得产物用无水乙醇和去离子水洗涤数次，离心，真空干燥，得纳米磁性Fe3O4粉末； (2)将海藻酸钠溶解于去离子水中，磁力搅拌至完全溶解； (3)往步骤(2)的溶液中加入步骤(1)的纳米磁性Fe3O4粉末，电动搅拌至溶液混合均匀； (4)在步骤(3)的溶液中加入淫羊藿苷的乙醇溶液，磁力搅拌至溶液混合均匀； (5)采用微囊成型装置，用注射器将步骤(4)的混合液滴入凝胶浴中形成初级微球； (6)将初级微球 浸没在壳聚糖的乙酸溶液中反应，所得微球用去离子水清洗； (7)将步骤(6)中的微球浸没在京尼平醇溶液中进行水浴交联反应，所得微球用去离子水清洗，预冷冻后进行冷冻干燥，即得到自发荧光骨修复磁性缓释微球。
3.根据权利要求2所述的自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，其特征在于:微球包括以下质量百分数的组分: 海藻酸钠1%~1.6% 纳米磁性Fe3O4粉末 0.008~0.013% 淫羊藿苷0.01~0.05% 壳聚糖0.5%~1% 京尼平0.1~0.8%。
4.根据权利要求2所述的自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，其特征在于:各步骤的工艺参数如下: 步骤(1)中FeCl3.6H20粉末质量为1.35g,乙二醇体积为40ml，醋酸钠质量为3.6g，反应温度为200°C，反应时间为12h，真空干燥温度为40°C ； 步骤(5)中的凝胶浴为二价阳离子溶液，质量分数为2%~8% ； 步骤(6)中反应温度为37°C，反应时间为8-16h ； 步骤(7)中30~45°C水浴交联24-36h。
5.根据权利要求4所述的自发荧光骨修复磁性缓释微球的制备方法，其特征在于:所述二价阳离子为 Ba2+、Ca2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+ 中的一种。
6.—种如权利要求1所述的方法制得的自发荧光骨修复磁性缓释微球。
【文档编号】A61L27/12GK103495209SQ201310442023
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】陈景帝, 张惠, 张玉珏, 潘盼盼, 张其清 申请人:福州大学