钝顶螺旋藻cpd光修复酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种钝顶螺旋藻CPD光修复酶及其应用。该CPD光修复酶具有SEQIDNO:2所示的多肽序列，或在SEQIDNO:2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加1～10个氨基酸残基所形成的具有CPD光修复酶活性的多肽序列。而用以编码所述钝顶螺旋藻CPD光修复酶的多聚核苷酸可具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或者与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能够编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。本发明优化并首次人工合成了适于原核表达的钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量钝顶螺旋藻CPD光修复酶，当将该CPD光修复酶应用到化妆品、生物医药等相关领域时，能够主动修复由紫外线引起的皮肤病症，产生巨大社会效益和经济价值，意义重大。
【专利说明】钝顶螺旋藻CPD光修复酶及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明具体涉及钝顶螺旋藻platens is")中CPD光修复酶、其优化后的编码基因，以及钝顶螺旋藻CPD光修复酶的DNA损伤修复活性，涉及生物学领域。
[0003]
【背景技术】
[0004]对每一种生物而言，基因组的准确和完整都是保证其自身存活及机体功能正常执行的重要基础。源于生物体内部及外界环境的基因毒性物质侵害、DNA复制过程中发生的各类错误以及DNA自身固有生化性质导致的不稳定，每个细胞每天大约需要承受50，000到500，000次的DNA分子损伤。
[0005]紫外线是最主要的环境DNA损伤剂，尽管臭氧层吸收了太阳紫外线中最危险的部分(紫外线C)，但强烈阳光中剩余的紫外线A和紫外线B仍能在一小时内对被照射细胞产生约十万次的DNA损伤。生物体中DNA的四种碱基在近紫外波段(紫外线B)有强吸收，进而诱发DNA同一条链内相邻的胸腺嘧啶碱基产生嘧啶二聚体光化学产物，其中最主要(约90%)的光产物是环丁烧嘧唳二聚体(Cyclobutane Pyrimidine Dimer, CPD)，还包括(6-4)光产物(6-4 PhotoProduct, 6-4 PP)等其他光产物破坏DNA结构，引发基因突变和基因组畸变，最终导致细胞死亡或者癌变。对人体的皮肤细胞而言，受紫外线损伤的DNA如果不能够被及时和正确的修复，将造成皮肤炎症及黑色素沉积，甚至引发皮肤癌和黑瘤病。
[0006]在病毒、细菌、真菌、昆虫、植物、无脊椎动物及部分脊椎动物细胞内存在一类DNA光修复酶，可在30(T600nm波长的光照射下将原本受紫外线照射而在DNA中形成的嘧啶二聚体分解成原来的非聚合状态，使DNA恢复正常。由于人体内缺乏该类DNA光修复酶,皮肤细胞中只能采用效率较低的核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)方式消除6-4 PP，而环丁烷嘧啶二聚体(PD则会被积累下来并导致一系列的负面效应的发生，如皮肤炎症、免疫抑制、皮肤肿瘤，甚至皮肤癌。现有研究结果表明(PD光修复酶可以主动修复皮肤细胞因紫外线照射而产生的基因损伤，抑制由此引起的红斑、皮肤炎症等发生；抑制DNA损伤引起的代谢免疫功能异常，有效抵制细菌、寄生虫的侵蚀，延缓衰老，增强皮肤新陈代谢而使细胞保持活力；并且还能预防紫外线损伤引起的皮肤癌。
[0007]钝顶螺旋藻(Spirulina platensis),是丝状不形成异型胞的蓝藻,原产于非洲乍得Aranguadi湖，国内主要分布在海南、广东、云南等地。钝顶螺旋藻是世界上广泛推行的优良螺旋藻品种，由于其具有营养成分高且易于吸收的特点，已被人类广泛采集食用了几百年。作为安全的食用藻类，每个钝顶螺旋藻中仅含有10-20个(PD光修复酶分子，这使得直接进行天然钝顶螺旋藻(PD光修复酶的分离纯化和体外应用极为困难。因此有必要对长期生存于强紫外线辐射条 件下的钝顶螺旋藻进行深入研究，利用基因工程手段克隆重组其CPD光修复酶，实现过量表达和纯化。[0008]
【发明内容】
[0009]鉴于现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种钝顶螺旋藻CPD光修复酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修复酶活性的多肽序列。
[0010]作为可行的实施方案之一，所述钝顶螺旋藻CPD光修复酶具有在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10个氨基酸残基所形成的多肽序列。
[0011]本发明的目的之二在于提供一种编码所述钝顶螺旋藻CPD光修复酶的多聚核苷酸。
[0012]进一步的,所述多聚核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能够编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。
[0013]本发明的目的之三在于提供一种导入了前述多聚核苷酸的原核或真核表达载体。
[0014]进一步的，所述表达载体中还导入了选择性标记基因，其可包括但不限于:可在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因、或具有营养缺陷抗性的基因。
[0015]本发明的目的之四在于提供包含前述多核苷酸或前述表达载体的宿主细胞。
[0016]本发明的目的之 五在于提供钝顶螺旋藻CPD光修复酶在制备防晒产品中的应用。
[0017]与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果:优化并首次人工合成了适于原核表达的钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量钝顶螺旋藻CPD光修复酶，当将该CPD光修复酶应用到化妆品等相关领域时，能够主动修复由紫外线引起的皮肤细胞DNA损伤，产生巨大社会效益和经济价值，意义重大。
[0018]
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是钝顶螺旋藻CPD光修复酶重组表达鉴定及纯化结果鉴定SDS-PAGE电泳图； 图2是钝顶螺旋藻CPD光修复酶紫外及可见光吸收光谱扫描结果；
图3是钝顶螺旋藻CPD光修复酶酶催化动力学参数拟合曲线。
【具体实施方式】
[0020]本发明旨在通过优化得到适于原核表达的钝顶螺旋藻CPD光修复酶编码基因，然后将其优化后的编码基因克隆到表达载体中，得到其编码产物，验证其CPD光修复酶活性，并将编码产物合理应用到化妆品、生物医药等相关领域，从而消除上述现有技术的缺陷。
[0021]而相应的，本发明的技术方案包括:
1.提供了一种钝顶螺旋藻(PD光修复酶，如(a)或(b)所述的蛋白质:
(a)其如SEQID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有(PD光修复酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0022](b)所述的蛋白质，例如在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的N端添加His His HisHis His His六个氨基酸、或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的N端添加His His His HisHis His His His八个氨基酸等，以上修饰均不改变蛋白活性，且由(a)衍生，均属于本发明的保护范围。
[0023]2.提供了钝顶螺旋藻CPD光修复酶经过密码子优化后的编码基因。
[0024]钝顶螺旋藻CPD光修复酶优化后的编码基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。或者，与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列，能够编码(b)所述蛋白质的核苷酸序列。例如，将钝顶螺旋藻CPD光修复酶氨基酸序列中天冬酰胺(Asn)的对应编码基因由最优密码子AAC替换为AAT;将钝顶螺旋藻(PD光修复酶氨基酸序列中脯氨酸(Ρro)的对应编码基因由最优密码子CCG替换为CCT、CCC或者CCA ;或针对将SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的氨基酸N端添加六个氨基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3’端添加18个核苷酸。
[0025]3.提供了钝顶螺旋藻CPD光修复酶的表达载体
该表达载体包括:导入了钝顶螺旋藻(PD光修复酶优化后的编码基因而能够编码如(a)或(b)所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。
[0026]本发明提供的钝顶螺旋藻CPD光修复酶的表达载体中，还可以加入选择性标记基因，包括但不限于:可在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因、或具有营养缺陷抗性的基因。
[0027]更具体的讲，本发明首先从GeneBank数据库中查询得到钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列，经原核表达系统密码子优化后得到优化后的钝顶螺旋藻CPD光修复酶编码基因。通过化学合成得到该全长编码基因，同时，根据该基因片段序列设计引物，进行PCR，扩增优化后的全长钝顶螺旋藻(PD光修复酶基因并将该基因克隆到原核克隆载体pET28上(由pET28a(+)改造的载体，去除了 pET28a(+)中His_tag前的凝血酶酶切位点及一些限制性酶切位点)，进行测序验证。将构建好的重组载体转化进入大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株中表达。最终经过Ni亲和层析、凝胶排阻及离子交换层析得到纯化蛋白。为了方便过量表达菌株的鉴定和筛选，可对表达载体进行加工，如加入可产生颜色变化的酶或发光化合物基因(如GFP基因、突光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素标记物及营养缺陷标记物。
[0028]( I)钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因编码序列的原核表达系统密码子优化
从GeneBank数据库中查询得到钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大肠杆菌细胞内tRNA丰度数据，将钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始编码基因中的稀有三联体密码子替换为大肠杆菌细胞中tRNA丰度最高的相应密码子核苷酸，最终获得适于大肠杆菌原核表达的钝顶螺旋藻(PD光修复酶优化基因编码序列。该优化过程中钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列中有367个核苷酸被替换调整，占编码序列的25%。
[0029](2)钝顶螺旋藻CPD光修复酶原核表达编码基因的获得
按照优化后的基因序列全基因化学合成全长双链钝顶螺旋藻CPD光修复酶原核表达编码基因。
[0030](3)钝顶螺旋藻CPD光修复酶表达载体构建
根据优化后的钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因完整序列设计引物:
CPDF: CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
CPDR: GACA CTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGCPCR反应条件为:98 °C预变性10min，98°C变性50s，55°C退火50s，72。。延伸2min,反应进行30个循环；将光修复酶基因的PCR扩增产物连接至原核表达载体pET28，得到重组质粒；将连接好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3),测序鉴定得到重组菌株Rosetta(DE3)/ pET28/phr。
[0031](4)钝顶螺旋藻CPD光修复酶的纯化和蛋白检测
将重组菌Rosetta (DE3) / pET28/phr接种于含卡那霉素的LB液体培养基培养后，加入IPTG，收集菌体；经过Ni亲和层析、凝胶排阻及阴离子交换层析，得到目的蛋白。
[0032]取上述诱导表达的Rosetta (DE3)/ pET28/phr菌体和纯化的目的蛋白，进行SDS-PAGE恒压电泳，电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。
[0033]本发明通过密码子优化及重组表达、纯化技术，获得了钝顶螺旋藻CPD光修复酶，其能够主动修复由紫外线引起的皮肤细胞DNA损伤，适用于化妆品等相关领域。例如，现有防晒产品主要通过将皮肤与紫外线隔离开来的方式起作用，对已经产生的紫外伤害无法起到修复治愈作用；而将本发明的钝顶螺旋藻CPD光修复酶蛋白作为高级护肤品的功能成分时，其主动修复由紫外线 引起的红斑、皮肤炎症以及基因损伤，显著提高防晒产品的防护效果，而若作为皮肤细胞DNA修复保健品，其还可以清除皮肤细胞中日常累积的DNA损伤，起到延缓皮肤衰老的作用。
[0034]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0035]下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南(第四版)》，科学出版社，2013年I月I日出版，ISBN:9787030386069。
[0036]实施例1钝顶螺旋藻Spirulina platensis CPD光修复酶原核表达优化编码基因的获得
从GeneBank数据库中查询得到钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列(Gene ID:15162397)，按照大肠杆菌细胞内tRNA丰度数据，将钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始编码基因中的稀有三联体密码子替换为大肠杆菌细胞中tRNA丰度最高的相应密码子核苷酸，最终获得适于大肠杆菌原核表达的钝顶螺旋藻(PD光修复酶优化基因编码序列。该优化过程中钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列中有367个核苷酸被替换调整，占编码序列的25%，其具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
[0037]实施例2钝顶螺旋藻Spirulina platensis CPD光修复酶表达载体构建
1、根据优化后的钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因完整序列设计引物:
正向引物:CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG
反向引物:GACACTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGC
PCR反应条件为:98°C预变性10min，98°C变性50s，55°C退火50s，72°C延伸2min，反应进行30个循环。PCR反应体系如下:
【权利要求】
1.一种钝顶螺旋藻CPD光修复酶，其特征在于，它具有SEQ ID N0:2所示的多肽序列，或在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中包含取代和/或缺失和/或添加所形成的具有CPD光修复酶活性的多肽序列。
2.如权利要求1所述的钝顶螺旋藻CPD光修复酶，其特征在于，它具有在SEQID NO: 2所示氨基酸序列中取代和/或缺失和/或添加I~10个氨基酸残基所形成的多肽序列。
3.编码权利要求1-2中任一项所述钝顶螺旋藻CPD光修复酶的多聚核苷酸。
4.如权利要求3所述的多聚核苷酸，其特征在于，具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有90%以上同源性且能够编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。
5.导入了权利要求3-4中任一项所述多聚核苷酸的原核或真核表达载体。
6.权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中还导入了选择性标记基因。
7.权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述选择性标记基因包括:可在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因、或具有营养缺陷抗性的基因。
8.包含权利要求3-4中任一项所述多核苷酸或权利要求5-7中任一项所述表达载体的宿主细胞。
9.权利要求1-2中任一项所述钝顶螺旋藻CPD光修复酶在制备防晒产品中的应用。
【文档编号】A61K8/66GK103966193SQ201310731604
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】李旭, 沈辉, 王虹 申请人:安徽邦业生物工程有限公司