一种端粒酶敏感的纳米药物载体粒子及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种端粒酶敏感的纳米药物载体粒子及其制备方法，其中纳米药物载体粒子，具有四层核壳结构：内核为拉曼分子标记的金纳米棒，在拉曼分子标记的金纳米棒外包裹一薄层实心二氧化硅壳层，在二氧化硅壳层外包裹一层介孔二氧化硅壳层，在介孔二氧化硅壳层外包裹一层对端粒酶敏感的单链DNA；所述介孔二氧化硅壳层的孔道中装载有药物分子。该纳米药物载体粒子能实现细胞内端粒酶触发的药物释放，解决目前癌症治疗药效低、毒副作用大的难题；同时该纳米药物载体粒子上集成了SERS信号可以实现对其精确的光学示踪。该纳米药物载体粒子制备方法简单、可重复性高，并且药物释放特性好，同时SERS信号强易于跟踪。
【专利说明】一种端粒酶敏感的纳米药物载体粒子及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料制备技术，尤其涉及一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子及其制备方法，该纳米药物载体粒子能实现细胞内端粒酶触发的药物释放，同时该纳米药物载体粒子上集成了表面增强拉曼散射(SERS)信号可以实现对其精确的光学示踪。
【背景技术】
[0002]受激敏感的纳米药物 载体粒子在提高癌症化学治疗效率方面具有独特的优势:在遇到刺激物之前，这些纳米药物载体粒子能将药物密封在其中，避免药物提前泄露；进入病变组织细胞后，在特定物质或环境条件的刺激下，这些纳米药物载体粒子可以释放出装载的药物。常用的刺激物质或环境条件包括温度、光照、PH值以及氧化还原作用等；此外，端粒酶也是一种潜在的触发剂。85-90%的肿瘤细胞过度表达端粒酶，而正常细胞抑制端粒酶的表达。在构筑这类受激敏感的纳米药物载体粒子时(这里只是为了讲介孔二氧化硅这种材料，之前未有关于以端粒酶为刺激物质的药物载体粒子的报道)，常用的材料是介孔二氧化硅，因为它具有很强的药物装载能力和灵活的表面修饰方法。
[0003]除了在肿瘤细胞中特异性释放药物的功能外，若能在这类纳米药物载体粒子上同时集成光学信号用以跟踪纳米载体粒子，则将极大地方便对其给药行为的研究。荧光是一种常用的光学示踪信号；然而，荧光光谱较宽，容易与药物或组织自发荧光产生光谱重叠，影响跟踪的准确性。表面增强拉曼散射(SERS)谱线窄，使用SERS作为载体粒子的示踪信号，将获得更闻的跟踪准确性。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子及其制备方法；该纳米药物载体粒子能实现细胞内端粒酶触发的药物释放，解决目前癌症治疗药效低、毒副作用大的难题；同时该纳米药物载体粒子上集成了 SERS信号可以实现对其精确的光学示踪。该纳米药物载体粒子制备方法简单、可重复性高，并且药物释放特性好，同时SERS信号强易于跟踪。
[0005]技术方案:为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，具有四层核壳结构:内核为拉曼分子标记的金纳米棒，在拉曼分子标记的金纳米棒外包裹一薄层实心二氧化娃壳层，在二氧化娃壳层外包裹一层介孔二氧化娃壳层，在介孔二氧化娃壳层外包裹一层对端粒酶敏感的单链DNA ;所述介孔二氧化硅壳层的孔道中装载有药物分子。
[0007]优选的，所述药物分子通过物理扩散或者吸附的方式装载在孔道内。
[0008]优选的，所述单链DNA通过静电力作用吸附在介孔二氧化硅壳层外表面，并将孔道密封住。
[0009]优选的，所述单链DNA 具体为(5 ’ - (CCCTAA) 6AATCCGTCGAGCAGAGTT_3 ’)，即其5’端含有六个与端粒重复序列互补的(5’ -CCCTAA-3’)序列，3’端为端粒酶底物序列(5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)。
[0010]当有端粒酶和dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)存在时，端粒酶能在单链DNA3’端的端粒酶底物上合成并延伸出若干个端粒重复序列(5’ -TTAGGG-3’)。延伸出的端粒重复序列能和单链DNA5’端的端粒互补序列杂交,使单链DNA折叠成发卡状(hairpin)的结构并从介孔二氧化硅壳层表面脱落，则介孔二氧化硅壳层中装载的药物分子被释放出来。当没有端粒酶存在时，单链DNA始终覆盖在介孔二氧化硅壳层的表面，阻止孔道内部药物分子的释放。
[0011]一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子的制备方法，包括如下步骤:
[0012](I)制备金纳米棒；
[0013](2)在金纳米棒表面修饰用于信号检测的拉曼分子，形成拉曼分子标记的金纳米棒⑴；
[0014](3)在拉曼分子标记的金纳米棒表面包裹一薄层实心二氧化硅壳层，形成二氧化硅包裹的金纳米棒；
[0015](4)在二氧化硅包裹的金纳米棒表面生长介孔二氧化硅壳层，形成介孔二氧化硅包裹的金纳米棒；
[0016](5)在介孔二氧化硅壳层的孔道内装载药物分子，形成装载了药物分子的介孔二氧化硅包裹的金纳米棒；
[0017](6)在装载了药物分子的介孔二氧化硅包裹的金纳米棒表面吸附对端粒酶敏感的单链DNA,得到端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子。
[0018]优选的，所述步骤(1)中，使用种子生长方法制备金纳米棒；
[0019]优选的，所述步骤(2)中，拉曼分子通过化学键吸附到金纳米棒的表面，此种方式修饰的拉曼分子具有较大的拉曼散射截面；
[0020]优选的，所述步骤(3)中，采用改进的Stdbcr法包裹一薄层实心二氧化硅壳层；
[0021]优选的，所述步骤(4)中，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为软模板生长介孔二
氧化娃壳层；
[0022]优选的，所述步骤(5)中，药物分子通过物理扩散或者吸附的方式装载在孔道内；
[0023]优选的，所述步骤(6 )中，单链DNA通过静电力作用吸附在介孔二氧化硅壳层外表面，并将孔道密封住；所述单链DNA序列为(5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)。
[0024]有益效果:本发明提供的端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子及其制备方法，相对于现有技术，具有如下优点:
[0025]1、将药物分子装载在介孔二氧化硅壳层的孔道中，并用单链DNA密封住孔道，能有效地避免药物提前泄露；
[0026]2、利用对端粒酶敏感的单链DNA密封介孔二氧化硅壳层的孔道，使纳米药物载体粒子具有端粒酶敏感性，能特异性地在高表达端粒酶的肿瘤细胞中释放出药物分子，而在低表达端粒酶的正常细胞中不释放药物分子 ，有效降低对正常组织细胞的毒副作用，提高癌症治疗的药效；
[0027]3、纳米药物载体粒子利用SERS信号进行示踪，比传统荧光示踪更精确。【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明的纳米药物载体粒子的结构示意图；
[0029]图2为以4-巯基苯甲酸(4MBA)分子为拉曼分子的纳米药物载体粒子的SERS光谱，激发波长为633nm ；
[0030]图3为以端粒酶触发纳米药物载体粒子释放药物的荧光光谱。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0032]如图1所示为一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，其特征在于:具有四层核壳结构:内核为拉曼分子标记的金纳米棒1，在拉曼分子标记的金纳米棒I外包裹一薄层实心二氧化娃壳层2,在二氧化娃壳层2外包裹一层介孔二氧化娃壳层3,在介孔二氧化硅壳层3外包裹一层对端粒酶敏感的单链DNA4 ;所述介孔二氧化硅壳层3的孔道3-1中装载有药物分子3-2。
[0033]其中，所述药物分子3-2通过物理扩散或者吸附的方式装载在孔道3-1内；所述单链DNA4通过静电力作用吸附在介孔二氧化硅壳层3外表面，并将孔道3-1密封住；所述单链DNA4具体为(5 ’ - (CCCTAA) 6AATCCGTCGAGCAGAGTT_3 ’)，即其5 ’端含有六个与端粒重复序列互补的(5’ -CCCTAA-3’ )序列，3’端为端粒酶底物序列(5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’ )。
[0034]纳米药物载体粒子进入细胞前，单链DNA4密封介孔二氧化硅壳层3的孔道3_1，从而将药物分子3-2保留在纳米药物载体粒子内，避免药物分子3-2提前泄露；纳米药物载体粒子进入肿瘤细胞后`，在肿瘤细胞内端粒酶的作用下，单链DNA4的3’端延伸出若干个端粒重复序列(5’ -TTAGGG-3’ )并与5’端的端粒互补序列杂交，使单链DNA4折叠成发卡状(hairpin)结构并从介孔二氧化硅壳层3表面脱落，介孔二氧化硅壳层3的孔道3_1被打开从而释放出药物分子。
[0035]下面以4-巯基苯甲酸(4MBA)分子为拉曼分子、以多柔比星(DOX)为药物分子制备上述结构的纳米药物载体粒子，具体制备方法如下(注:下述步骤中的单位M为物质的量浓度单位，lM=lmol/L):
[0036](I)制备金纳米棒:
[0037]首先制备金种子，在室温下将2.5mL、0.2M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与1.5mL、1.0mM的四氯金酸溶液混合，剧烈搅拌并加入0.6mL、0.01M的冰镇硼氢化钠溶液，2分钟后停止搅拌即得棕黄色的种子溶液，作为A溶液。
[0038]然后配制生长溶液，在室温下向50mL、0.2M的CTAB溶液中依次加入如下试剂并缓慢搅拌均匀:2~4mL、4mM的硝酸银溶液，5mL、15mM的四氯金酸溶液，45mL的去离子水；随后加入1.5mL~3mL、0.08M抗坏血酸至溶液变为无色；最后加入ImL的A溶液，静置10~20min即得含有金纳米棒的溶液,作为B溶液；所得金纳米棒尺寸约15nmX45nm。
[0039](2)在金纳米棒表面修饰4MBA分子:
[0040]取5mL的B溶液以10000rpm、30min离心一次去除过量的反应物，将离心沉淀分散至5mL的去离子水中，再加入10~50 μ LUOmM的4ΜΒΑ溶液(溶剂为乙醇)，剧烈搅拌12h以上即得标记了 4MBA的金纳米棒，作为C溶液。[0041](3)在拉曼分子标记的金纳米棒表面包裹一薄层实心二氧化硅壳层:
[0042]采用改进的St6ber法包裹，具体为C溶液中加入I~2mL、25mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8000)水溶液，缓慢搅拌12h以上，之后以8000rpm、30min离心一次去除过量的反应物，将离心沉淀分散至5mL的无水乙醇中，再加入300~500μ L、25%的氨水，15~30 μ L的正硅酸四乙酯(TEOS)并搅拌6h以上，离心清洗并收集反应液中的纳米粒子即得二氧化硅包裹的金纳米棒；最后再将二氧化硅包裹的金纳米棒分散在1.875mL去离子水中，作为D溶液。
[0043](4)在二氧化硅包裹的金纳米棒表面生长介孔二氧化硅壳层:
[0044]二氧化硅包裹的金纳米棒表面以CTAB为软模版，包裹介孔二氧化硅壳层，具体为将全部的D溶液加入到3.125mL的含有30~50mg CTAB的酒精溶液中，搅拌30~40min后加入30~60yL、25%的氨水，6~8yL TEOS并搅拌6h以上；离心并用酒精反复清洗以收集反应液中的纳米粒子，即得介孔二氧化硅包裹的金纳米棒；最后将介孔二氧化硅包裹的金纳米棒分散在2mL去离子水中，作为E溶液。
[0045](5)在介孔二氧化硅壳层的孔道内装载药物分子:
[0046]将全部的E溶液加入到100~400 μ L、10mg/mL的DOX水溶液，搅拌48h以上；过量的DOX通过离心去除，即获得装载了药物的纳米药物载体粒子；最后将装载了药物的纳米药物载体粒子分散至2mL去离子水中，作为F溶液。
[0047](6)在装载了药物分子的介孔二氧化硅包裹的金纳米棒表面吸附对端粒酶敏感的单链DNA:
[0048]将全部的F溶液中加入800~1200 μ L、10 μ M单链DNA溶液(溶剂为PBS缓冲液)，摇晃混合均匀后静置2h以上；过量的单链DNA通过离心去除，得到的最终产物即端粒酶敏感的纳米药物载体粒子。
[0049]下面结合实施例对上述方法制备的纳米药物载体粒子进行相关实验，对本发明作出进一步说明。
[0050]实施例1
[0051]将步骤(6)得到的最终产物分散至2mL的TRAP缓冲液中(20mMTris-HCl, ρΗ8.3，1.5mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005%Tween20, ImM EGTA, 0.lmg/mL BSA) 4°C保存待用，作为G溶液。
[0052]以人子宫颈癌细胞(HeLa)为肿瘤细胞模型，从HeLa细胞中提取出端粒酶，并以该端粒酶触发纳米药物载体粒子进行药物释放。
[0053]利用CHAPS法提取细胞中的端粒酶:1 X 1O6个对数生长期的HeLa细胞用冰PBS缓冲液离心清洗2次后分散至100 μ L的RNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中(IOmMTris-HCl, ρΗ7.5，1mM MgCl2, ImM EGTA,0.1mM PMSF，5mMP -巯基乙醇，0.5%CHAPS, 10% 甘油)，冰上孵育30min后，将裂解液以12000rpm、20min离心，取出上清即得端粒酶提取物，端粒酶提取物于_75°C保存待用，作为H溶液。 [0054]取两份100 μ L的G溶液，一份加入1~2 μ L RNase抑制剂、5~15 μ L dNTPs和10~20 μ LH溶液；一份只加入1~2 μ L RNase抑制剂和5~15 μ L dNTPs。摇晃混合均匀后将两份混合溶液30°C静置3h，随后分别进行离心处理并收集离心的上清液，测试两份上清液的荧光信号。[0055]该实施例中制备出的载体粒子的SERS光谱如图2所示，其SERS信号强，容易对其进行SERS示踪。图3为获得的两份上清液的荧光光谱，可以看出:有端粒酶存在时，离心上清液中药物DOX的荧光信号十分明显；而没有端粒酶时，上清液中几乎没有药物的荧光信号。说明有端粒酶存在时，DOX被释放出来了；没有端粒酶时，DOX不能被释放。因此，该纳米药物载体粒子能实现端粒酶触发的药物释放。
[0056]实施例2
[0057]将步骤(6)得到的最终产物分散至2mL的去离子水中4°C保存待用，作为M溶液。
[0058]以人子宫颈癌细胞(HeLa)为肿瘤细胞模型，以人胚肺成纤维细胞(MRC-5)为正常细胞模型，观察纳米药物载体粒子在HeLa和MRC-5中的释药行为；其中HeLa细胞高度表达端粒酶而MRC-5细胞无显著端粒酶活性。
[0059]将HeLa细胞、MRC-5细胞分别接种在细胞培养皿中，分别加入M溶液(体积比载体粒子:细胞培养液=1: 10)，培养IOh后将培养液弃除，细胞用PBS缓冲液冲洗三次，分别测试两种细胞中的荧光信号及SERS信号。荧光信号源自DOX分子，以488nm激发；SERS信号源自载体粒子，以633nm激发。
[0060]当DOX分子被装载在介孔二氧化硅壳层的孔道中时，DOX分子产生自淬灭作用，荧光信号很弱。只有当DOX分子从介孔二氧化硅壳层中释放出来时，其荧光信号才会恢复。利用这一特点，可以通过观察细胞中的荧光强度，判断DOX是否被释放出来。
[0061]实验中发现，在HeLa和MRC-5细胞中均测到了显著的SERS信号，且强度几乎相等。表明HeLa细胞和MRC-5细胞吞入的纳米药物载体粒子数量相当。但只在HeLa细胞中观察到了 DOX的荧光信号，而MRC-5中无明显的荧光信号。表明DOX在HeLa中被释放，而在MRC-5中未被释放。这一结果与两株细胞的端粒酶表达水平相符合，即HeLa高表达端粒酶而MRC-5无显著端粒酶活性。因此，该纳米药物载体粒子能在肿瘤细胞内特异性地进行端粒酶触发的药物释放。
[0062]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，其特征在于:具有四层核壳结构:内核为拉曼分子标记的金纳米棒(I )，在拉曼分子标记的金纳米棒(I)外包裹一层实心二氧化硅壳层(2)，在二氧化硅壳层(2)外包裹一层介孔二氧化硅壳层(3)，在介孔二氧化硅壳层(3)外包裹一层对端粒酶敏感的单链DNA (4);所述介孔二氧化硅壳层(3)的孔道(3-1)中装载有药物分子(3-2)。
2.根据权利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，其特征在于:所述药物分子(3-2)通过物理扩散或者吸附的方式装载在孔道(3-1)内。
3.根据权利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，其特征在于:所述单链DNA (4 )通过静电力作用吸附在介孔二氧化硅壳层(3 )外表面，并将孔道(3-1)密封住。
4.根据权利要求1所述的端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子，其特征在于:所述单链 DNA (4)具体为 5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，即其5’端含有六个与端粒重复序列互补的5’-CCCTAA-3’序列，3’端为端粒酶底物序列5’ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’。
5.一种端粒酶敏感的 、SERS可示踪的纳米药物载体粒子的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)制备金纳米棒； (2)在金纳米棒表面修饰用于信号检测的拉曼分子，形成拉曼分子标记的金纳米棒(O; (3 )在拉曼分子标记的金纳米棒(I)表面包裹一层实心二氧化硅壳层(2 )，形成二氧化硅包裹的金纳米棒； (4 )在二氧化硅包裹的金纳米棒表面生长介孔二氧化硅壳层(3 )，形成介孔二氧化硅包裹的金纳米棒； (5)在介孔二氧化硅壳层(3)的孔道(3-1)内装载药物分子(3-2)，形成装载了药物分子的介孔二氧化硅包裹的金纳米棒； (6)在装载了药物分子的介孔二氧化硅包裹的金纳米棒表面吸附对端粒酶敏感的单链DNA (4),得到端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子。
6.根据权利要求5所述的端粒酶敏感的、SERS可示踪的纳米药物载体粒子的制备方法，其特征在于: 所述步骤(1)中，使用种子生长方法制备金纳米棒； 所述步骤(2)中，拉曼分子通过化学键吸附到金纳米棒的表面； 所述步骤(3)中，采用改进的StSber法包裹一薄层实心二氧化硅壳层(2)； 所述步骤(4)中，以十六烷基三甲基溴化铵为软模板生长介孔二氧化硅壳层(3)； 所述步骤(5)中，药物分子(3-2)通过物理扩散或者吸附的方式装载在孔道(3-1)内； 所述步骤(6)中，单链DNA (6)通过静电力作用吸附在介孔二氧化硅壳层(3)外表面，并将孔道(3-1)密封住；所述单链 DNA (4)序列为 5’ -(CCCTAA)6AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’。
【文档编号】A61P35/00GK103751110SQ201410012910
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】宗慎飞, 王著元, 崔一平 申请人:东南大学