人白细胞介素ii突变体及其应用的制作方法

人白细胞介素ii突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人白细胞介素II突变体、及其在制备药物中的应用，在人白细胞介素II原生体的氨基酸序列中，与α受体和/或β受体结合点发生突变；降低所述人白细胞介素II与α受体的亲和力，从而降低了诱导调节性T细胞的功能，减少能引起肺水肿的副作用，并且增强与β受体的亲和力，保留人白介素II对自然杀伤细胞免疫活性的属性。本发明是人白细胞介素II突变体可用于刺激免疫系统，增强抑制肿瘤生长功能，从而提高其临床疗效和应用范围。
【专利说明】人白细胞介素 I I突变体及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人白介素 II突变体，尤其涉及一种低毒、高效、副作用小的人白 细胞介素 II突变体及其在制备生物医药中用途。

【背景技术】
[0002] 白细胞介素 II (interleukin-2，IL_2,白介素 II)是T淋巴细胞分泌的一种淋巴 因子(人白介素 II由133个氨基酸组成的蛋白质多肽链，分子量为15KD，其氨基酸序列如本 发明序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示)，是维持免疫系统中正常功能的最重要分子 之一。白介素 II能促进T细胞成熟、维持T细胞活性，还能促进细胞毒性T淋巴细胞的活 性，并使其转化为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL)，促进自然杀伤（NK)细胞的活性，并诱导杀伤肿 瘤的淋巴因子细胞和杀伤细胞（CTL)的增长。白介素 II具有增强人体免疫功能，激活自然 杀伤细胞，扩增T淋巴细胞的作用，能诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞（LAK)及肿瘤浸润 淋巴细胞，这些细胞都有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用。W099/60128A1对 白介素 II的作用进行了详细介绍。
[0003] 由于白介素 II具有显著的增强免疫作用，故它有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛 的临床应用潜力。通过促进T细胞和NK细胞成熟和增殖，白介素 II具有诱导抗肿瘤免疫 的功效，研究发现白介素 II对肾细胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有较明显 疗效，对肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的疗效，并早已被FDA批准 用于黑色素瘤和肾细胞癌的临床治疗。在我国白介素 Π 也已广泛应用于临床癌症治疗和 病毒感染。
[0004] 目前已有大量关于IL-II药物制剂的报道，如US5358708、US4604377、US5417970 等公开的水性制剂或冻干粉剂。
[0005] 但是，同时白介素 II在临床上有许多毒副作用。在低剂量下，白细胞介素 II促进 淋巴细胞杀死肿瘤功能微小，但是它却明显地促进调节性T细胞功能，增加外周血调节性 T细胞（T抑制细胞）（⑶4+⑶25+细胞）的数量（JEM201:723-735)，进一步抑制浸润淋巴细 胞的功能和增殖，并抑制抗肿瘤免疫反应（JI26:85-93);在高剂量下，白细胞介素 II能引 起病人疼痛、高烧、恶心、呕吐、肺水肿、血管渗漏、甚至死亡（JC021:3127-3132)。由于具有 杀死肿瘤细胞和促进抑制细胞的双重功能，目前，白介素 II的临床应用因其严重毒性而受 到很大限制，据估计，仅有20%左右的相关疾病患者能够采用白介素 II进行治疗。


【发明内容】

[0006] 为了解决人白介素 II副作用明显的缺陷，本发明提供了一种低毒高效副作用小 的人白介素 II突变体，同时保持了激活自然杀伤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞功能，从而扩大 其在临床上的应用。
[0007] 本发明第一个方面是提供一种人白细胞介素 II突变体，包括一种序列，所述序列 为人白细胞介素 Π 氨基酸序列中，在与人白细胞介素 II的α和/或β受体结合点发生 突变的序列；其中，与α受体结合点的突变降低所述人白细胞介素 II与α受体的亲和力； 与β受体结合点的突变增强与β受体的亲和力。
[0008] 在本发明的一种优选实施例中，所述结合点选自人白细胞介素 II氨基酸序列的 37、38、41-45、61、62、65、68、72、80、81、85、86、92位点中的任意一个或多个。
[0009] 在本发明的一种优选实施例中，所述发生突变的结合点至少为3个，更优选为至 少为5个，更优选为至少为6个。
[0010] 在本发明的一种优选实施例中，所述发生突变的结合点至少包括人白细胞介素 II 氨基酸序列的65、80、81、85、86、92位点。
[0011] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变包括氨基酸的缺失或者替代，并优选为 人白细胞介素 II序列中的相应的氨基酸被其它不同氨基酸替代。
[0012] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序列 的65位点的氨基酸Pro被氨基酸Arg替代。
[0013] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序列 的80位点的氨基酸Leu被氨基酸Phe替代。
[0014] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序 列的81位点的氨基酸Arg被氨基酸Asp替代。
[0015] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序列 的85位点的氨基酸Leu被氨基酸Val替代。
[0016] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序列 的86位点的氨基酸lie被氨基酸Val替代。
[0017] 在本发明的一种优选实施例中，所述突变至少包括：人白细胞介素 II氨基酸序列 的92位点的氨基酸lie被氨基酸Phe替代。
[0018] 在本发明的一种优选实施例中，所述人白细胞介素 II突变体包括序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
[0019] 在本发明的一种优选实施例中，所述人白细胞介素 II突变体为序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列，或者包括SEQ ID No. 3氨基酸序列的融合蛋白。
[0020] 本发明第二个方面是提供一种合成所述人白细胞介素 II突变体的方法，包括：
[0021] 合成表达所述人白细胞介素 II突变体氨基酸序列的基因，并将所述基因重组至 表达载体；
[0022] 用表达载体转染宿主，进行人白细胞介素 II突变体的生产。
[0023] 在本发明的一种优选实施例中，所述宿主可以是任意能够接纳所述表达载体的真 核细胞。
[0024] 所述真核细胞可以是动物细胞、植物细胞、人类细胞中的任意一种或几种，并优选 为动物细胞和人类细胞中的任意一种或几种，如肌细胞、肝细胞、红细胞、卵巢细胞等。
[0025] 本发明第三个方面是提供一种药物，所述药物至少包括所述人白细胞介素 II突 变体。
[0026] 在本发明的一种优选实施例中，所述药物优选为注射剂型，如溶液、乳液、悬液、粉 齐U (更优选为冻干粉剂）等。
[0027] 在本发明的一种优选实施例中，所述药物中还可以包括载体蛋白。
[0028] 在本发明的一种优选实施例中，所述药物还可以包括辅料，如pH值调节剂、防冻 齐?、表面活性剂(如增溶剂、助悬剂等)、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、渗透压调节剂(如氯化钠、 葡萄糖)、填充剂。
[0029] 在本发明的一种优选实施例中，所述药物还可以包括第二活性成分，所述第二活 性成分可以是治疗活性成分、减少刺激的活性成分中的任意一种或几种。
[0030] 所述减少刺激的活性成分优选为止痛剂、去热感剂等中的任意一种或几种。
[0031] 本发明所述的药物可以是用于治疗病毒、杆菌和寄生菌感染的药物，治疗癌症及 其并发症的药物，免疫调节剂，疫苗，治疗自身免疫性疾病的药物中的任意一种或几种。
[0032] 其中，所述病毒、杆菌和寄生菌可以是乙肝病毒、流感病毒、结核病毒、甲肝病毒、 丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、疱疹病毒、狂犬病毒、艾滋病毒、白色念珠菌等。
[0033] 其中，所述癌症可以是肾癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、淋巴癌、直肠癌、肺 >rg· 寺。
[0034] 其中，所述自身免疫性疾病可以是甲亢、糖尿病、肌无力、肝硬化、类风湿性关节 炎、系统性脉管炎、天疱疮、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、溃疡等。
[0035] 应当理解的是，本发明上述各个方面及其各种优选实施例，可以由本领域技术人 员不受限制的的进行任意组合，并且所述组合也包含在本
【发明内容】
范围内。
[0036] 本发明人白细胞介素 II突变体，相比于原生体，在与α受体结合的位点上发生突 变，降低α受体（CD4CD25)和白介素 II的亲和力，从而进一步影响促进调节性Τ细胞的能 力，所以减弱α受体结合的白介素 II基因突变将有减少促进抑制Τ细胞增殖活性的功能。 同时，本发明突变体减少了对肺上皮细胞α受体的结合，从而降低和消除高剂量引起肺水 肿的毒副作用。
[0037] β受体结合点突变主要表达在自然杀伤（ΝΚ)细胞，淋巴因子细胞和杀伤细胞的 表面。通过80,81，85,86和92氨基酸位点的突变，结构变化的白介素 II增强与β受体结 合的结合，因此可提高和促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞能力。
[0038] 实验结果表明，本发明通过对人白细胞介素 II氨基酸序列进行定点突变，降低了 诱导调节性Τ细胞的功能，减少或消除其毒副作用，同时保留了白介素 II对自然杀伤细胞 免疫活性的属性，因此白介素 II的突变体可刺激免疫系统，增强抑制肿瘤生长功能，增加 其抑制体内固体肿瘤生长的效用，从而提高其临床疗效和应用范围。
[0039] 本发明可单独作为药物或疫苗进行疾病的治疗和预防，或者与其它治疗方法进 行组合，如在手术后作为免疫调节剂使用。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1为本发明人白介素 II突变体（mutat IL-2)与人白介素 II原生体（native IL-2)免疫反应效果对比；其中，图1A为NK细胞活性，图1B为⑶8细胞活性，图1C为⑶4 和⑶25细胞活性，图1D为⑶25细胞数量对比；
[0041] 图2为小白鼠注射本发明人白介素 II突变体（mutat IL-2)与人白介素 II原生 体（native IL-2)之后对肺水肿的影响对比；
[0042] 图3为本发明人白介素 II突变体（mutat IL-2)与人白介素 II原生体（native IL-2)抗肿瘤效果对比。

【具体实施方式】
[0043] 本发明一种实施例中，对照本发明序列表SEQ ID No. 2 (人白介素 II原生体）和 SEQ ID No. 3 (本发明人白介素 II突变体)，所述突变体与原生体相比，突变位置和替代氨 基酸如下：
[0044] 表1，本发明本发明人白介素 II突变体的突变位点和替代氨基酸
[0045]

【权利要求】
1. 一种人白细胞介素 II突变体，其特征在于，包括一种序列，所述序列为人白细胞介 素 II氨基酸序列中，在与人白细胞介素 II的α和/或β受体结合点发生突变的序列；其 中，与α受体结合点的突变降低所述人白细胞介素 II与α受体的亲和力；与β受体结合 点的突变增强与β受体的亲和力。
2. 根据权利要求1所述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述结合点选自人白 细胞介素 Π 氨基酸序列的37、38、41-45、61、62、65、68、72、80、81、85、86、92位点中的任意 一个或多个。
3. 根据权利要求1所述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述发生突变的结合 点至少为3个。
4. 根据权利要求3所述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述发生突变的结合 点至少为6个。
5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述发 生突变的结合点至少包括人白细胞介素 II氨基酸序列的65、80、81、85、86、92位点。
6. 根据权利要求5所述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述突变至少包括下 述的一种或几种： 人白细胞介素 II氨基酸序列的65位点的氨基酸Pro被氨基酸Arg替代； 人白细胞介素 II氨基酸序列的80位点的氨基酸Leu被氨基酸Phe替代； 人白细胞介素 II氨基酸序列的81位点的氨基酸Arg被氨基酸Asp替代； 人白细胞介素 II氨基酸序列的85位点的氨基酸Leu被氨基酸Val替代； 人白细胞介素 II氨基酸序列的86位点的氨基酸lie被氨基酸Val替代； 人白细胞介素 II氨基酸序列的92位点的氨基酸lie被氨基酸Phe替代。
7. 根据权利要求1述的人白细胞介素 II突变体，其特征在于，所述人白细胞介素 II突 变体包括序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
8. -种合成权利要求1所述人白细胞介素 II突变体的方法，其特征在于，包括： 合成表达所述人白细胞介素 II突变体氨基酸序列的基因，并将所述基因重组至表达 载体； 用表达载体转染宿主，进行人白细胞介素 II突变体的生产。
9. 一种药物，其特征在于，所述药物至少包括权利要求1所述人白细胞介素 II突变体。
10. 根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还可以包括选自载体蛋白、辅 料、第二活性成分的组分。
【文档编号】A61K39/39GK104231068SQ201410040477
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】刘根桃, 岳喜连 申请人:苏州发士达生物科技有限公司