针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新颖抗体，尤其涉及针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体，而且尤其涉及III型缺失突变体EGFRvIII。本发明也涉及针对表皮生长因子受体的缺失突变体的人类单克隆抗体，而且尤其为EGFRvIII。本发明也提供这些抗体的诊断和治疗调配物，及其免疫偶联物。
【专利说明】针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
[〇〇〇1] 本申请是如下申请的分案申请：申请日为2004年6月25日、申请号为 201110233784. 9、发明名称为针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用。 【技术领域】
[0002] 本实施例涉及新颖抗体，尤其涉及针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体， 而且尤其涉及III型缺失突变体EGFRvIII。本实施例也涉及针对表皮生长因子受体的缺失 突变体的人类单克隆抗体，而且尤其为EGFRvIII。本实施例也涉及这些抗体的变体。本发 明也提供这些抗体的诊断和治疗配方，及其免疫偶联物。 【背景技术】
[0003] 自上世纪以来，已寻求有助于更好诊断和治疗人类和动物癌症的肿瘤特异分子。 除了那些基于病毒诱导癌症并包含由病毒基因规定的分子结构的癌症之外，在大多数类型 的人类癌症中，很难提供对基于分子结构资料的肿瘤特异物质的确切证据。极少有关于基 于新颖分子结构的肿瘤特异分子的实例。在恶性人类神经胶质瘤和其它与表皮生长因子受 体分子的放大或变化潜在相关的肿瘤（诸如乳腺癌和其它人类癌症）的情况下，尚无关于 具有独特序列的结构变化分子的明确论证。
[0004] 表皮生长因子受体（EGFR)是原致癌基因 c-erb B的170千道尔顿（kilodalton) 膜糖蛋白产物。已知EGFR基因的序列（Ullrich等人，1984)。"Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431Epidermoid Carcinoma Cells. "Nature309 :418-425)。EGFR 基因是最初在鸟类红细 胞增多症病毒中识别的erbB致癌基因的细胞同系物（Downward等人（1984))。"Close Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v~erb B Oncogene Protein Sequence. " Nature307 :521-527，Ullrich等人（1984)。已在各种人类肿瘤中观察到 这种致癌基因通过基因放大的活化（Haley等人（1987A))。"The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in :0ncogenes，Genes，and Growth Factors"，Guroff，G 编，第 12 版，第2章，第40-76页，Wiley，N. Y.，且尤其为神经胶质源性的那些表皮生长因子受体 基因 （Libermann 等人，（1985)。"Amplification，Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin"， Nature313 :144-147 ;Wong 等人，（1987)。"Increased Expression ofthe Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903 ;Yamazaki 等人，（1988) 〇 "Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene (c-erbB)in Human Brain Tumors. ''Molecular and Cellular Biology8 : 1816-1820，Maiden 等人，（1988)。"Selective Amplification ofthe Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme· ''Cancer Research4 :2711-2714)。
[0005] 已证实EGF-r在多种类型的人类固体肿瘤中过量表达。Mendelsohn Cancer Cells7 :359(1989), Mendelsohn Cancer Biologyl :339-344(1990)，Modjtahedi and Dean Int' lj.〇nc〇l〇gy4:277-296(1994)。例如，已在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑 癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌中观察到EGFR过量表达。Modjtahedi and Dean Int' lj.0ncology4 :277-296(1994)。已证实表皮生长因子（EGF)和转化生长因 子-α (TGF-α)都结合至EGF-n而且导致细胞增殖和肿瘤生长。
[0006] v-erb B致癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是 正常受体截断氨基的变型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸激 酶结构域（Fung 等人，（1984))。Activation ofthe Cellular Oncogene c_erb B by LTR Insertion ：Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell33 :357-368 ;Yamamoto 等人，（1983)。"A New Avain Erythroblastosis Virus， AEV-H Carries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma. " Cell34 :225_232，Nilsen 等人，（1985)。"c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis ：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truneated EGF Receptor. ，'Cell41:719-726 ;Gammett 等 人，（1986) 〇 "Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 :6053-6057)。这导致了不 可以结合表皮生长因子（EGF)，但仍可以磷酸化其它物质的蛋白质（Gilmore的，（1985))。 ^Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell40 :609-618 ;Kris 等人，（1985)。Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity ot the Avian EGF Receptor and v~erB Protein. "Cell40 :619-625),且导致以下推测：v-erb B蛋白质为致癌基因性的是因为激酶 结构域未经调节且结构上为活性的（Downward等人，1984)。
[0007] 各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末 端中发生氨基酸的取代和缺失。然而，可获得的证据表明氨基截断对于致癌作用尤 为关键。氨基截断是所有v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的插入或逆 转录病毒转导引起的那些氨基截断（Nilsen等人，（1985))。"c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis ：Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.，'Cell41 :719-726 ;Gammett 等 人，（1986)〇 "Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 :6053-6057) 〇
[0008] 相反，羧基-末端缺失似乎只与由逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似 乎决定了宿主范围和肿瘤类型的特异性（Gammett等人，1986 ;Raines等人，（1985)。 ^c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis ：Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles. ,?Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :2287-2291)。以氨基-截断鸟类c-erb B基因或感染性病毒致癌基因-人 类EGF受体的转染实验表明该缺失单独即足以产生转化蛋白质（Pelley等人，（1988))。 "Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic :Characterization of a Replication Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB. ''Journal of Virology62 :1840-1844 ;Wells 等人，（1988)。"Genetic Determinants of Neoplastic Transformation by the Retroviral Oncogene v-erbB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 ： 7597-7601)。
[0009] EGFR基因的放大发生于40%的恶性人类神经胶质瘤中（Libermann等人，（1985)。 "Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin，'，Nature313 :144-147 :Wong 等 人，(1987) 〇 ''Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903),受体基因的重排在许多具有基因放大的肿瘤中较为明显。 结构变化似乎优先影响基因的氨基末端一半（Yamazaki等人，（1985)。"Amplification， Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene m Primary Human BrainTumours ofGlial Origin"，N ature313 :144-147 :Maiden 等人，（1988)。"Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme· " Cancer Research4 :2711-2714)，但重排的性质当时并未在 任何肿瘤中准确表征。
[0010] 已报导在若干人类癌症中的大小变体EGFR基因和放大（Humphrey等人， (1988))〇 "Amplification and Expression ofthe, Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts，'· Cancer Research48 :2231_2238 ;Bigner 等人，（I988) J. Neuropathol. Exp. Neural. ,47 :191-205 ;Wong 等人，（1987)。"Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification" · Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :6899-6903 ;和 Humphrey等人。表皮生长因子受体基因在人类神经胶质瘤异种移植中的放大和表达， Cancer Res. 48(8) :2231-8(1988))。然而，尚无关于细胞中经改变EGFR分子的分子基的 测定。1989年，Drs. Bigner和Vogelstein的著作说明已知为III型突变体的EGF受体突 变体的序列（也称为δ-EGFr或EGFR VIII)。此著作描述于美国专利第 6,455,498 号、第 6,127, 126 号、第 5,981,725 号、第 5,814,317 号、第 5,710,010 号、第 5, 401，828 号和第 5, 212, 290 号中。
[0011] EGFR变体是由基因重排伴随EGFR基因放大而引起的。存在八种主要的EGFr变 体，已知为：⑴EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域，（ii)EGFRvII由EGFR的细胞外 结构域中的83aa框内缺失组成，（iii)EGFRvIII由EGFR的细胞外结构域中的267aa框内 缺失组成，（iv)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失，（v)EGFRvV含有EGFR的细胞 质结构域中的缺失，（vi) EGFR. TDM/2-7含有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复， (vii)EGFR. TDM/18-25含有EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复，和（viii) EGFR. TDM/18-26含有EGFR的酪氨酸激酶结构域中的外显子18-26的重复（Kuan等人，EGF 突变体受体vIII在治疗癌症中作为分子目标，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001))。 另外，存在第二种更为罕见的具有第二种在外显子11和14之间的连接点引入新颖组氨酸 残基的缺失的EGFRvIII突变体（EGFRvIII/A12-13) (Kuan等人，EGF突变体受体viii在治 疗癌症中作为分子目标，Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96(2001))。
[0012] EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子（EGF)受体最常见发生的变体（Kuan 等人，EGF突变体受体vIII在治疗癌症中作为分子革巴标，Endocr Relat Cancer. 8(2): 83-96(2001))。在基因放大的过程中，在细胞外结构域中发生267个氨基酸缺失，产 生肿瘤特异单克隆抗体可指向的新颖连接点。EGF受体的这种变体以配位体独立的 方式有助于肿瘤通过组成型信号发出而发展。已知EGFrVIII未表达于任何正常组 织上(Wikstrand, CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research55 (14) :3140-3148(1995) ;01apade_01aopa，E0.等人"Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Bi* J Cancer. 82(1) :186-94(2000))。然而，EGFRvIII显示在肿瘤细胞中的显著表达， 例如，27?76 %乳腺癌活组织检查表达EGFRvIII (Wikstrand，CJ.等人"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. " Cancer Research55 (14) :3140-3148 (1995) ；Ge H.等人，"Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression with EGFR in human invasive breast cancer by laser capture microdissection and immunohistochemical analysis.，' Int J Cancer. 98 (3) :357-61 (2002))，50 ?70%神经胶 质癌表达 EGFRvIII (Wikstrand，CJ.等人，"Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research55(14) :3140-3148(1995) ;Moscatello， G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in
[0013] multiple human tumors.，'Cancer Res. 55 (23) :5536-9 (1，995))，16 % NSCL 癌 症表达 EGFRvIII (Garcia de Palazzo，IE.等人，"Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.，'Cancer Res. 53 (14)： 3217-20 (1993))，75%卵巢癌表达 EGFRvIII (Moscatello，G.等人，"Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. ''Cancer Res. 55(23) :5536-9(1995)) ?
[0014] 和 68 % 前列腺癌表达 EGFRvIII (Olapade-Olaopa，E0.等人，"Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. " Br J Cancer. 82(1) : 186-94(2000))。
[0015] 缺失267个氨基酸并替换为甘氨酸产生可定靶抗体的独特连接。此外，鉴于 EGFRvIII在某些肿瘤中的表达及其在正常组织中的表达缺乏，EGFRvIII在肿瘤治疗中可 作为用于定靶药物的理想靶标。具体而言，EGFRvIII似乎可作为肿瘤免疫偶联物治疗的理 想候选物（例如，与抗肿瘤剂或毒素偶联的抗体）。另一种治疗过量表达EGFRvIII的癌症 的方法涉及使用特异性定靶至未分离正常EGFR的变体受体的肿瘤特异性核酶。发现核酶 在无胸腺裸鼠中显著抑制乳腺癌生长（Luo等人，Int. J. Cancer. 104(6) :716-21 (2003))。 已描述用于整个EGFRvIII蛋白质的通用抗体。
[0016] 见国际专利申请案第 W001/62931 号和 Kuan 等人，"EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy. ''Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96(2001) ;Kuan 等人，"EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy. '^Brain Tumor Pathol. 17(2) :71-78(2000) ;Kuan 等人，"Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv. ^International Journal of Cancer. 88(6) :962-969(2000) ;Landry 等人，"Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen ：Fv-peptide complex of an antibody fragment specific fbr the mutant EGF receptor, EGFRvIII. Journal of Molecular Biology. 308(5)： 883-893(2001) ;Reist 等人，"Astatine_2111abeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N_succinimidyl5-[21 lAt] astato-3-pyridinecarboxylate.，' Nuclear Medicine and Biology. 26 (4) :405-411 (1999) ;Reist 等人，" In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody ：comparison with its murine parent.，'Nuclear Medicine and Biology. 24 (7) :639-647 (1997)； Wikstrand 等人，"Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigen system. Cancer Immunology, Immunotherapy.50(12)： 639-652(2002) ;Wikstrand 等人，"Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. ''Cancer Research. 55 (14) :3140-3148(1995) ;Wikstrand 等人，"The class III variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRVIII) ：characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4(2) ： 148-158(1998) ；Wikstrand 等 人，"The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII): characterization and utilization as an immunotherapeutic target.，'J. Neurovirol. 4 (2) :148-158(1998) ;Jungbluth 等人，"A monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor.，'Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2) :639-44(2003) ;Mamot 等人，"Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells. ''Cancer Researches :3154-3161 (2003))。然而，每一种上述抗体在变化和/或恒定区内都具有或含 有鼠科序列。
[0017] 这些鼠科衍生蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致抵抗患者体内抗体 的免疫反应的产生。另外，即使在亲和力成熟之后，这些抗体仍具有2. 2xl(T8至1. 5xl(T9级 别的相对低的亲和力。（Kuan 等人，"EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy. "，Endocr Relat Cancer. 8 (2) :83-96 (2001))。
[0018] 为避免使用鼠科或大鼠衍生抗体，研究者已将人类抗体功能引入啮齿动物以 使得卩齿齿动物可产生完全人类抗体，见例如Mendez等人，"Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. "Nat Genet. 15(2) :146-56(1997)。这种方法已结合针对野生型EGFR的成功抗体 的产生而使用，见例如 Yang X 等人，"Development of ABX-EGF，a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody, for cancer therapy. ,?Crit Rev Oncol Hemato38(l)： 17-23(2001) ;Yang X_D 等人，"Eradication ofEstablished Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy，，，Cancer Research59 (6) :1236-1243(1999)和美国专利第 6, 235, 883 号。
【发明内容】
[0019] 在一个实施例中，本发明包含特异性结合至EGFRvIII的经分离人类单克隆抗体 和包含序列LEEKKGNYVVTDHC的肽（SEQ ID NO :56)。在另一个实施例中，本发明包含 特异性结合至于包含L EEKKGNYVVTDHC的序列（SEQ ID NO :56)中含有的表位的经分离人类 单克隆抗体，其中如由SPOTs排列中的丙氨酸扫描所测定，结合所需的残余物选自由EEK、 KKNYV、LEK、EKNY 和 EEKGN 组成的群组。
[0020] 另外的实施例包括包含由VH3-33基因编码的重链可变区氨基酸序列的经分离人 类单克隆抗体。重链可变区氨基酸序列可包括由JH4b基因编码的氨基酸序列，或由选自由 D6-13和D3-9组成的群组的D基因编码的氨基酸序列。
[0021] 其它实施例包括包含由A23(VK2)基因编码的轻链可变区氨基酸序列的经分离人 类单克隆抗体。轻链可变区氨基酸序列可包括由JK1基因编码的氨基酸序列。
[0022] 其它实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体或其片段，而且其包含选自由标 识为（SEQ ID)N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗体13.1.2、131、170、150、095、 250、139、211、124、318、342和333的重链氨基酸序列组成的群组的重链氨基酸序列。抗体 可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。抗体或片段可与医药学上可接受的 载剂或稀释剂缔合，而且可与治疗剂偶联。治疗剂可为毒素。治疗剂可为诸如DM-UAEFP、 AURISTATINE或ZAP的毒素。所述药剂可经连接剂与抗体缔合。所述毒素可经第二抗体与 抗体缔合。另外的实施例包括产生抗体的杂交瘤细胞株和包含编码抗体基因的转型细胞。 例如，所述细胞可为中国地鼠卵巢细胞。
[0023] 另外的实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其包 含以有效量的抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。在一个实施例中，抗体包含选自由 抗体 13. 1. 2(SEQ ID NO :138)、131(SEQ ID NO :2)、170(SEQ ID NO :4)、150(SEQ ID N0 :5)、 095(SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、124(SEQ ID NO :13)、318(SEQ IDN0 :15)、342(SEQ IDN0 :16)和333(SEQ IDN0 :17)的重链氨基酸序列组 成的群组的重链氨基酸序列。该方法在活体内进行，而且在哺乳动物（诸如人类）体内进 行，所述哺乳动物经受涉及上皮细胞增殖的癌症，诸如肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、 乳腺癌、胶质母细胞瘤或卵巢癌。
[0024] 另外的实施例包括杀死靶细胞的方法。这可以通过使靶细胞和与毒素缔合的抗体 接触来达到。抗体结合至肽LEEKKGNY(SEQ ID NO :133)。在一个实施例中，抗体对于肽具有 大于1. 3xlO_9M的结合亲和力。在一个实施例中，毒素选自AEFP、DM-1和ZAP。在一个实施 例中，抗体毒素化合物对靶细胞的毒性是对无肽细胞毒性的10倍多。在一个实施例中，抗 体包含选自由抗体 13. 1. 2 (SEQ ID N0 :138)、131 (SEQ ID NO :2)、170 (SEQ ID NO :4)、150 (SEQ ID NO :5)、095(SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、 124 (SEQ ID NO :13)、318 (SEQ ID NO :15)、342 (SEQ ID NO :16)和 333 (SEQ ID NO :17)的重链 氨基酸序列组成的群组的重链氨基酸序列。在另一个实施例中，抗体经肽连接剂或第二抗 体与毒素缔合。
[0025] 本发明另外的实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体，且其包含重链氨基酸 序列，其包含以下互补决定区（⑶R):
[0026] (a)CDRl，由选自由标识为 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?1区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成；
[0027] (b)CDR2，由选自由标识为SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?2区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成；和
[0028] (c)CDR3，由选自由标识为SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成。
[0029] 在一个实施例中，抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人类或人源化抗体。在一个实施 例中，抗体与医药学上可接受的载剂、稀释剂和/或治疗剂缔合。在一个实施例中，所述治 疗剂为毒素。
[0030] 在一个实施例中，所述毒素为DM-1或AuristatinE。
[0031] 也包括结合至EGFRvIII的经分离抗体或其片段，而且其包含选自由标识为（SEQ 10)吣：140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、 139、211、123、318、342和333的轻链氨基酸序列组成的群组的轻链氨基酸序列。抗体可为 单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。其可与医药学上可接受的载剂或稀释剂缔 合，或与治疗剂（诸如毒素，例如DM1或AURISTATIN E)偶联。
[0032] 在一个实施例中，涵盖产生抗体的杂交瘤细胞株或转型细胞，该抗体包含选自由 标识为（SEQ ID)N0 :140、19、20、21、29、23、25· 26、26、28、33、31 和 32 的抗体 13. 1. 2、131、 170、150、095、250、139、211、123、318、342和333的轻链氨基酸序列组成的群组的轻链氨基 酸序列。另外的实施例包括产生该抗体的杂交瘤细胞株和包含编码抗体基因的转型细胞， 诸如中国地鼠卵巢细胞。
[0033] 另一个实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其包 含以有效量的上述抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。该方法在活体内进行，而且在哺 乳动物（诸如人类）体内进行，所述哺乳动物经受涉及上皮细胞增殖的癌症，诸如肺癌、结 肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或卵巢癌。
[0034] 另一个实施例包括结合至EGFRvIII的经分离抗体，且其包含轻链氨基酸序列，其 包含以下互补决定区（⑶R) :
[0035] (a)CDRl，由选自由标识为 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗体 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1区的氨基酸序 列组成的群组的序列组成；
[0036] (b)CDR2,由选自由标识为 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗体 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1区的氨基酸序 列组成的群组的序列组成；和
[0037] (c)CDR3,由选自由标识为 SEQ IDN0 :140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32 的抗体 13. 1. 2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和 333 的0?1区的氨基酸序 列组成的群组的序列组成。
[0038] 上段所识别的抗体可进一步包括重链氨基酸序列，其包含以下互补决定区 (CDR):
[0039] (a)CDRl，由选自由标识为 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?1区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成；
[0040] (b)CDR2，由选自由标识为SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和 333 的0?2区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成；和
[0041] (c)CDR3,由选自由标识为 SEQ ID N0 :138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16 和 17 的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的 CDR3 区的氨基酸序列组 成的群组的序列组成。
[0042] 另外的实施例包括一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法，其包 含以有效量上述抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。该方法在活体内进行，而且在哺乳 动物（诸如人类）体内进行，所述哺乳动物经受涉及上皮细胞增殖的癌症，诸如肺癌、乳腺 癌、头颈癌、前列腺癌或胶质母细胞瘤。
[〇〇43] 其它实施例包括经分离的多聚核苷酸分子，其包含编码重链氨基酸序列的多聚核 苷酸序列或其片段，其选自由标识为SEQIDN0:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17的抗 体 13. L 2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342 和 333 的重链氨基酸序列组成的 群组，或包含编码轻链氨基酸序列的多聚核苷酸序列或其片段，其选自由标识为SEQ ID N0 : 140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31 和 33 的抗体 13. 1. 2、131、170、150、095、139、250、 211、318、342和333的轻链氨基酸序列组成的群组。
[0044] 另外的实施例包括包含容器，含于其中的组合物和表明所述组合物可用于治疗以 EGFRvIII的表达为特征的癌症的包装说明书或标签的产品，其中所述组合物包含如上文所 述的抗体。所述癌症包括肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌或胶质母细胞瘤。也包括用于检 测哺乳动物组织或细胞中的EGFRvIII来筛选肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌或卵巢癌 的检定试剂盒，其中EGFRvIII为由上皮癌症表达的抗原，试剂盒包含结合抗原蛋白质的抗 体和用于指示抗体与抗原的反应的构件（如果存在）。所述抗体可为经标记的单克隆抗体， 或所述抗体可为未经标记的第一抗体，且用于指示反应的构件包含为抗免疫球蛋白的经标 记第二抗体。结合抗原的抗体可由选自由萤光染料、酶、放射性核素和不透射线材料组成的 群组的标记物来标记。结合抗原的抗体也可结合至过量表达的wtEGFR。该试剂盒可供患者 选择临床使用。
[0045] 另一个实施例包括特异性识别含有新颖Gly残基的EGFRvIII表位的抗体。
[0046] 另一个实施例包括EGFRvIII的变体。所述变体可具有pFLAG插入物，可由SEQID N0 :56氨基酸组成，且可存在于计算机模拟中。
[0047] 另一个实施例包括结合至识别序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)的抗体或其变体。
[0048] 另一个实施例包括特异性结合至EGFRvIII的抗体变体。所述抗体变体可进一步 结合至包含SEQ ID N0 :57的肽。抗体变体可具有与肽中的残基EKNY或EEKGN相互作用的残 基。在一个实施例中，抗体变体结合至肽序列比其结合至野生型的EGFR蛋白质紧10倍多。 在一个实施例中，抗体变体特异性结合至EGFRvIII和SEQID N0 :56肽。在一个实施例中，经 分离的抗体或变体具有包含深腔的互补决定区，其中所述腔由重链的CDR2和CDR3、轻链的 CDR3和轻链CDR1的一小部分形成。在一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃结合腔中 具有残基 31、37、95-101、143-147、159、162-166、169-171、211-219、221和 223。在一个实施 例中，经分离的抗体或变体具有包含浅槽的互补决定区，其中所述槽由重链CDR2和CDR3与 轻链CDRUCDR2和CDR3形成。在一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃结合沟槽中具 有残基 31、33、35-39、51、54-56、58-61、94-101、144-148、160、163-166、172 和 211-221。在 一个实施例中，经分离的抗体或变体在5埃结合沟槽中具有残基31-33、35、37、55、96-101、 148、163、165、170、172、178、217和218。在一个实施例中，经分离的抗体或变体具有一成型 互补位，以使得当肽EEKKGN(SEQ ID N0127)的抗体决定基结合至抗体的互补位时，在选自由 E2和Y172、K3和H31、K4和H31、N6和D33、N6和Y37及N6和K55组成的群组的两个残基 之间形成至少一个键。在一个实施例中，经分离的抗体或变体具有一成型互补位，以使得当 肽EEKKGNY (SEQ ID N0131)的抗体决定基结合至抗体的互补位时，在选自由K4和Q95、K4和 Q95、N6和Q98、G5和H31、Y7和H31及Y7和W165组成的群组的两个残基之间形成至少一 个键。在一个实施例中，抗体具有一结构或与计算机模拟中测定的结构相互作用。
[0049] 另一个实施例提供一种用于选择以特定结合特征结合至EGFRvIII的变体的方 法，所述方法包含使用分子结构以形成互补位，使用分子结构以形成表位，计算二者之间的 相互作用能并将所述能级与mAb变体的表位和第二互补位的能级相比较，和基于能级差异 选择变体。所述方法可进一步包括使用互补位的第二变体与表位之间的相互作用能来测定 第三相互作用能并比较第三相互作用能和第二相互作用能来决定选择哪个变体。在一个实 施例中变体形成并进行结合测试。
[0050] 另一个实施例提供一种选择以特定结合特征结合至EGFRvIII的变体的方法，所 述方法检验与互补位相互作用的表位的残基，选择重要残基以形成识别序列，使用所述序 列以形成EGFRvIII变体，并使用所述EGFRvIII变体来选择mAb变体。
[0051] 另一个实施例提供一种使抗体变体形成EGFRvIII的方法，所述方法包含分析与 互补位相互作用的表位的残基，选择表位的较重要残基以形成识别序列，使用所述识别序 列以形成EGFRvIII变体，并使用所述EGFRvIII变体来选择抗体变体。在一个实施例中，在 计算机模拟中达成抗体的选择。在一个实施例中，通过产生抵抗EGFRvIII变体的抗体来达 到经使用EGFRvIII变体来选择抗体。
[0052] 在一个实施例中，其中经分离的抗体变体结合至EGFRvIII和SEQ ID N0 :57肽， 抗体可进一步包含以下点突变：Tyrl72Arg、Leu99Glu、ArglOlGlu、Leu217Glu、Leu99Asn、 Leu99HiS、L99T、Argl01ASp或其某些组合。在一个实施例中，抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、 人源化抗体或人类抗体。
[0053] 在一个实施例中，抗体或其变体结合至序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)，且所述抗 体或变体具有次纳摩尔结合能力。
[0054] 在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且抗体具有结合至表位的互补位，且表 位具有一组与包括E、K、N和Y的互补位相互作用的残基。在一个实施例中，所述抗体为抗 体 131。
[0055] 在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且抗体具有结合至具有一组与包含E、 E、K、G和N的互补位相互作用的残基的表位的互补位。在一个实施例中，表位的主要结构 为EEKKGNY(SEQ ID NO :131)。在一个实施例中，抗体为13. 1. 2。
[0056] 在又一个实施例中，抗体结合至EGFRvIII且具有小于1.3χ1(Γ9Μ、小于1.0χ1(Γ 9Μ 或小于500ρΜ的KD。在一个实施例中，与野生型的EGFR肽相比，抗体对于SEQ ID NO :56具 有特异性。在一个实施例中，抗体对野生型的EGFR肽（SEQ ID NO :134)的非特异性结合低 于抗体对EGFRVIII(SEQ ID NO :135)的特异性结合的10%。在一个实施例中，抗体选自由 131、139和13. 1. 2组成的群组。在一个实施例中，抗体经内在化。在一个实施例中，至少约 70 %或至少约80%的抗体都发生内在化。
[0057] 在一个实施例中，与对于野生型的EGFR蛋白质或其变体（SEQ ID N0 :134)相比，变 体人类单克隆抗体优先结合至对于EGFRvIII蛋白质实质上独特的表位。
[0058] 在一个实施例中，变体包含对应于典范类1的重链互补决定区（⑶R1)。在一个实 施例中，变体包含对应于典范类3的重链互补决定区（CDR2)。
[0059] 在一个实施例中，变体包含对应于典范类4的轻链互补决定区（⑶R1)。
[0060] 在一个实施例中，变体包含对应于典范类1的轻链互补决定区（⑶R2)。在一个实 施例中，变体包含对应于典范类1的轻链互补决定区（CDR3)。在一个实施例中，变体包含 对应于典范类1的第一重链互补决定区（CDR1)、对应于典范类3的第二重链互补决定区 (CDR2)、对应于典范类4的第一轻链互补决定区（CDR1)、对应于典范类1的第二轻链互补决 定区（⑶R2)和对应于典范类1的第三轻链互补决定区（⑶R3)，其中形成这些互补决定区以 使得变体可结合至与对于EGFR蛋白质相比，对于EGFRvIII蛋白质实质上独特的表位。在 又一个实施例中，提供一种抑制与EGFRvIII的表达相关联的细胞增殖的方法。
[0061] 所述方法涉及以有效量的抗体或其片段处理表达EGFRvIII的细胞，其中所述抗 体或其片段结合至EGFRvIII，其中所述抗体与毒素结合，且其中所述抗体包含选自由抗体 13. 1. 2(SEQ ID NO ：138)U31(SEQ ID NO ：2)U70(SEQ ID NO ：4)U50(SEQ ID NO :5),095 (SEQ ID NO :7)、250(SEQ ID NO :9)、139(SEQ ID NO :10)、211(SEQ ID NO :12)、124(SEQ ID NO :13)、 318 (SEQ ID NO : 15)、342 (SEQ ID NO : 16)和 333 (SEQ ID NO : 17)的重链氨基酸序列组成的群 组的重链氨基酸序列。该方法在活体内在哺乳动物体内进行，所述哺乳动物可为人类，且可 经受涉及上皮细胞增殖的癌症，且所述癌症可包含肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳 腺癌、胶质母细胞瘤或卵巢癌。所述毒素可为DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATINE或ZAP。
[0062] 在又一个实施例中，提供一种抑制表达EGFRvIII细胞的细胞增殖的方法。该方法 涉及以有效量的抗体或其片段处理表达EGFRvIII的细胞，其中所述抗体与毒素结合，且其 中所述抗体具有选自由标识为（SEQ ID)N0 :19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32的抗体 13. L 2、131、170、150、123、095、139、250、211、342、333 和 318 的轻链氨基酸序列组成的群 组的轻链氨基酸序列，其中所述经分离的多聚核苷酸分子将结合具有以SEQ ID N0 :56识别 的序列的肽。该方法在活体内在哺乳动物体内进行，所述哺乳动物可为人类，且可经受涉及 上皮细胞增殖的癌症，且所述癌症可包含肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质 母细胞瘤或卵巢癌。所述毒素可为DM-1、AEFP、MMAE、AURISTATINE或ZAP。 【专利附图】
【附图说明】
[0063] 图1为野生型的EGFR和EGFRvIII之间的显示267氨基酸缺失和G替换的序列比 对。
[0064] 图2为EGFRvIII PEP314-mer肽的设计图。在图2A中，具有氨基酸LEEKK的 EGFRvIII的N-末端序列。（SEQ ID NO :58) (1-5)与EGFR的N-末端序列相同，继而为独特甘 氨酸残基，继而为与EGFR中的残基273至280相同的氨基酸。图2B代表EGFRvIII (6-272) 中缺失的EGFR的氨基酸。
[〇〇65] 图3A-L提供本发明抗体的序列。对于每一种所提供的抗体，对于重链和轻链可变 区均提供多聚核苷酸和氨基酸序列。因此，对于每一种所列抗体提供四个序列。
[〇〇66] 图4为13. 1. 2抗体重链区与特定种系重链区比较的表格，表示杂交瘤重链区 的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基来表示。 [〇〇67] 图5为13. 1. 2抗体轻链区与特定种系轻链区比较的表格，表示杂交瘤轻链区 的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基来表示。 [0068] 图6为各种杂交瘤衍生抗体重链区与特定种系重链区比较的表格，表示杂交 瘤重链区的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基 来表示。
[〇〇69] 图7为各种杂交瘤衍生抗体轻链区与特定种系轻链区比较的表格，表示杂交 瘤轻链区的氨基酸残基与那个特定位置处的种系相同。自种系的偏移由合适的氨基酸残基 来表示。
[0070] 图8为显示重组EGFRvIII mAb与表达EGFRvIII的细胞（NR6细胞）的结合的代表 图。菱形代表95,三角形代表133,正方形代表139, "X"代表150,星号代表170,圆形代表 221，直线代表230,和长方形代表250。
[0071] 图9A显示对于人类抗-EGFR抗体（ABX-EGF)至H80的染色分析。
[0072] 图9B显示对于抗体131至H80的FACS染色分析。
[0073] 图9C显示对于抗体139至H80的FACS染色分析。
[0074] 图9D显示对于抗体13. 1. 2至H80的FACS染色分析。
[0075] 图9E显示对于ABX-EGF至H1477的FACS染色分析。
[0076] 图9F显示对于抗体131至H1477的FACS染色分析。
[0077] 图9G显示对于抗体139至H1477的FACS染色分析。
[0078] 图9H显示对于抗体13. 1. 2至H1477的FACS染色分析。图91显示对于ABX-EGF 至A549的FACS染色分析。
[0079] 图9J显示对于抗体131至A549的FACS染色分析。
[0080] 图9K显示对于抗体139至A549的FACS染色分析。
[0081] 图9L显示对于抗体13. 1. 2至A549的FACS染色分析。
[0082] 图9M为展示EGFRvIII mAb与胶质母细胞瘤细胞的结合的曲线图。实心三角形代 表结合至H1477的抗体131。实心正方形代表结合至H1477的抗体13. 1.2。空三角形代表 结合至H80的抗体131。空正方形代表结合至H80的抗体13. 1. 2。
[0083] 图9N为展示EGFRvIII mAb至人类表皮样癌细胞株A431的结合的曲线图。实心正 方形代表抗体13. 1. 2。实心三角形代表抗体131。
[0084] 图90为展示抗体13. 1. 2至NR6鼠科成纤维细胞细胞株的结合的曲线图。正方形 代表NR6。三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圆形代表具有EGFRvIII的NR6。
[0085] 图9P为展示抗体131至鼠科成纤维细胞细胞株的结合的曲线图。正方形代表NR6。 三角形代表具有野生型EGFR的NR6。圆形代表具有EGFRvIII的NR6。
[0086] 图10A显示对于人类抗-EGFR抗体（ABX-EGF)结合至表达EGFR细胞（A431)的 FACS染色分析。
[0087] 图10B显示对于抗体131至表达EGFR细胞（A431)的FACS染色分析。
[0088] 图10C显示对于抗体139至表达EGFR细胞（A431)的FACS染色分析。
[0089] 图10D显示对于抗体13. 1. 2至表达EGFR细胞（A431)的FACS染色分析。
[0090] 图11A显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体13. 1. 2的活体外毒性。
[0091] 图11B显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体13. 1. 2的活体外毒性。
[0092] 图11C显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体13. 1. 2的活体外毒性。
[0093] 图11D显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
[0094] 图11E显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
[0095] 图11F显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体95的活体外毒性。
[0096] 图11G显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒性。
[0097] 图11H显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒性。
[0098] 图111显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体131的活体外毒性。
[0099] 图12A显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒性。
[0100] 图12B显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒性。
[0101] 图12C显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体139的活体外毒性。
[0102] 图12D显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
[0103] 图12E显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
[0104] 图12F显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
[0105] 图12G显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体170的活体外毒性。
[0106] 图12H显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
[0107] 图121显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的EGFRvIII抗体150的活体外毒性。
[0108] 图13A显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
[0109] 图13B显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
[0110] 图13C显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体211的活体外毒性。
[0111] 图13D显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
[0112] 图13E显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
[0113] 图13F显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体250的活体外毒性。
[0114] 图13G显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的AEFP结合相对于与未 表达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体IgGl (消极对比）的活体外毒性。
[0115] 图13H显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的DM1结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体IgGl (消极对比）的活体外毒性。
[0116] 图131显示间接与表达EGFRvIII细胞（H1477,圆形）中的ZAP结合相对于与未表 达EGFRvIII (H80,正方形）的细胞结合的抗体IgGl (消极对比）的活体外毒性。
[0117] 图14A为条形图，其表明EGFRvIII抗体（13. 1.2、131和139)当结合至AEFP时抑 制复制生成检定中H1477细胞的菌落形成。
[0118] 图14B为条形图，其表明EGFRvIII抗体（13. 1.2、131和139)当结合至DM1时抑 制复制生成检定中H1477细胞的群落形成。
[0119] 图15A为显示抗-EGFRvIII抗体（13. 1. 2)与毒素（MMAE)在表达EGFRvIII细胞 (H1477,圆形）中相对于在未表达EGFRvIII (H80,正方形）中的直接偶联物的活体外毒性的 曲线图。图15B为显示抗-EGFRvIII抗体（13. 1. 2)与毒素（AEFP)在表达EGFRvIII细胞 (H1477,圆形）相对于在未表达GFRvIII(H80,正方形）的细胞中的直接偶联物的活体外毒 性的曲线图。
[0120] 图15C为显示抗-EGFRvIII抗体（13. 1.2)与毒素（DM1)在表达EGFRvIII细胞 (H1477)相对于在未表达GFRvIII(H80)的细胞中的直接偶联物的活体外毒性的曲线图。
[0121] 图16显示其中具有确定肿瘤异种移植的小鼠经抗-EGFRvIII (或dEGFR)抗体 (13. 1. 2)(直接结合至毒素（DM1、MMAE或AEFP))处理的活体内动物模型的结果。实心正 方形代表250微克dEGFR-DMl。实心顶角向上的三角形代表75微克相同物质。实心顶角 向下的三角形代表75微克dEGFR-MMAE。菱形代表250微克相同物质。较浅的正方形代表 75微克dEGFR-AEFP。空正方形代表250微克相同物质。空心顶角向上的三角形代表dEGFR 和自由DM1。空心顶角向上的抗体代表PBS。所有使用的抗体为13. 1.2。箭头表示前药处 理。图17显示抗体131结构模型的分子表面。六个CDR被遮蔽为不同的阴影以标记它们 的边界。结合腔位于接近中心处。图18显示抗体13. 1. 2分子表面的结构模型。六个⑶R 区域遮蔽为阴影且由数字识别。长槽大概沿垂直中心线分布。图19A为13. 1.2抗体和肽 EEKKGN(SEQ ID NO :127)错合物的可能扩展模型。⑶R区域遮蔽为阴影以指示边界。
[0122] 图19B显示13. 1. 2抗体和肽EEKKGN(SEQ ID NO :127)错合物的可能扩展模型中的 氢键。如图18，CDR圈的阴影与残基相同。肽残基自图顶部的N-末端至C-末端编号为1至 6。由虚线指示六个氢键。氢键形成的六对氨基酸如下：E2. ..Y172、K3. ..H31、K4. ..H31、 Ν6· · · D33、Ν6···Υ37 和 Ν6· · · Κ55。
[0123] 图20为表明对于所选扩展模型之一的表位-抗体结合能与Kd的对数之间的关联 的曲线图。
[0124] 图21描绘肽-13. 1. 2抗体错合物的精确扩展模型。肽以空格实心形式呈现。
[0125] 图22描绘精确扩展模型中的氢键。
[0126] 图23为描绘抗体-抗原结合能相对于相对亲和力的对数的线性拟合的曲线图。 【具体实施方式】
[0127] 如上文所述，EGFRvIII为EGFR的缺失突变体，其中EGFr的细胞外结构域中的267 氨基酸缺失，且于连接处以甘氨酸进行单一氨基酸替换。这些特征显示于图1中野生型 EGFR与EGFRvIII之间的序列比对中。鉴于在缺失的连接处的甘氨酸的氨基酸替换，理论上 可能产生针对存在于EGFRvIII中而不存在于野生型的EGFR中的新颖表位的抗体。因此， 如图2中所示，设计用于免疫和筛选的肽，称为PEP3 (Kuan等人，EGFmutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy, Endocr Relat Cancer. 8(2) :83-96 (2001)) 〇 这 种14-mer肽具有对于EGFRvIII和野生型的EGFR常见的5个n-末端氨基酸，独特甘氨酸 连接位点和野生型的EGFR(对应于残基273-280)与EGFRvIII (对应于残基7-14)之间的 保守序列中所含的8个氨基酸残基。此外，胶质母细胞瘤细胞和以基因编码的EGFRvIII转 染的细胞（B300. 19细胞）也可用于免疫和筛选（在本文有时称为B300. 19/EGFRvIII转染 子）。
[0128] 为产生抵抗EGFRvIII的人类抗体，将转基因 XenoMouse?小鼠以胶质母细胞瘤 细胞/EGFRvIII、B300. 19/EGFRvIII细胞和针对在与野生型的EGFR相比的EGFRvIII中表 示的新颖细胞外结构域中的连接区的肽（PEP3)的组合进行免疫。将来自经免疫小鼠中的 B细胞分离并用于产生胶质母细胞瘤，继而筛选以结合至EGFRvIII或使用XenoMaWSLAM? 技术直接用于筛选以结合至 EGFRvIII (Babcook 等人，A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities，Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (15) :7843-8 (1996)和美国专利第 5, 627, 052号）。经识别结合至EGFRvIII的抗体经一系列检定筛选以确定EGFRvIII的特 异性识别。经过这个过程来产生、分离并表征结合至EGFRvIII且对EGFRvIII具有特异性 的人类单克隆抗体群体。随后独特表明表位定位，但重叠了特异性。在活体外进一步评估 所有抗体以评估其为了将细胞毒素药物传递到细胞而通过细胞进行内在化的能力。表明有 效传递药物的抗体与细胞毒素药物直接结合，并检测其杀死活体外和活体内表达EGFRvIII 的肿瘤细胞的能力。这些研究为用于治疗患者癌症的抗体药物偶联物的下一次产生提供了 基础，这些患者的肿瘤隐藏有特异性基因病变。
[0129] 通过上述过程产生完全人类抗-EGFRvIII抗体的群体。使用杂交瘤方式，产生对 于野生型的EGFR具有有限交叉反应性的几种抗体，包括对用于与PEP3结合的ELISA呈 阳性的抗体13. 1、13. 2、13. 3和13. 4。除了这些，选择抗体13. 1(和尤其为它的亚克隆 13. 1. 2)以供进一步研究和发展。使用XenoMax方式，产生抗体群体，包括抗体131、139、250 和095,其对于与p印3寡核苷酸的结合具有高度特异性，且与野生型的EGFR具有有限的交 叉反应性。其中，131抗体具有最令人感兴趣的特性。在图4-7中展示每一种抗体的序列 (SEQ ID NO :1-33和141-144)。对各种抗体的序列和结合能力进行比较并将结果展示于图 4-10中。如图9A-9L和图10A-10D中可见，与ABX-EGF相比，抗体131、139和13. 1. 2都表 现出对于EGFRvIII表达细胞（H1477)的较佳选择性。某些结果显示于图9M-9P中的曲线 图中，其表明简单与EGFRvIII细胞相比，至少两种抗体13. 1. 2和131表现出对于EGFRvIII 表达细胞的较佳选择性。此外，检测本实施例抗体的几种可能用途；其结果显示于图11-16 中。最后，基于预测的结构模型，形成抗体的变体以获得具有变化结合特征的抗体。
[0130] 另外，本发明抗体对于结合至相同或类似表位的其它抗体的筛选极为有用。本发 明抗体可用于阐明其它抗体的交叉竞争研究中，预期其它抗体对于形成的抗原-抗体错合 物的特征具有相同或经改良的影响。
[0131] 每一种对于EGFRvIII具有极高亲和力131抗体和13. 1.2都通过细胞良好内 在化，且当结合至毒素时表现出可高效杀死细胞。令人感兴趣的是，不管是否产生于 XenoMouse小鼠的不同免疫中，且不管是否使用不同的技术，两种抗体都衍生于极为类似的 种系基因。然而，基于表位定位操作，每一种抗体似乎结合至EGFRvIII分子上稍微不同的 表位，且具有对于结合必要的EGFRvIII上稍微不同的残基。这些结果表明使用种系基因对 于定靶EGFRvIII的抗体疗法的产生尤为重要，且小变化可通过基于这些结构发现进一步 设计抗体和其它疗法来改良抗体的结合和影响。
[0132] 高度需要结合至相同表位，或竞争与13. 1. 2和131抗体结合的抗体。如下文更详 细讨论，已通过SPOTs排列的丙氨酸扫描阐明对于特定抗体结合重要的残基。因此，也高度 需要共享重要结合残基的抗体。
[0133] 定义
[0134] 除非另外定义，本文所用的科学和技术术语将具有所属领域的一般技术人员通常 了解的含义。另外，除非本文另外要求，单数术语包括复数形式且复数术语包括单数形式。 一般而言，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学及蛋白质和寡核苷酸或多聚核苷 酸化学及杂交的术语及其技术是此项技术中已熟知且通常使用的那些术语。标准技术用于 重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转型（例如，电击、脂质转染）。根据生产者的说明 或此项技术中通常实现的或如本文所述进行酶反应和纯化技术。通常根据此项技术中熟知 的常规方法和如本说明书通篇所引用和讨论的各种通用和更详尽参考文献中所述来进行 前述技术和程序。见，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν· Υ·，1989)。本文所述的 关于分析化学、合成有机化学和药物及医药化学而使用的术语及其试验程序和技术在此项 技术中已熟知且通常使用。
[0135] 标准技术用于化学合成，化学分析，医药制备、调配和传递以及治疗患者。
[0136] 如本文所用的术语"经分离多聚核苷酸"意思是染色体组、cDNA或合成源的多聚核 苷酸或其某种组合，由于其来源，"经分离多聚核苷酸"（1)与所有或一部分其中"经分离多 聚核苷酸"在自然界中发现的多聚核苷酸无关，（2)可操作性地连接至多聚核苷酸，在自然 界中并未连接，或（3)在自然界中并未作为较大序列的部分而发生。本文中提到的术语"经 分离蛋白质"是指cDNA、重组RNA或合成源的蛋白质或其某种组合，由于其来源或衍生源， "经分离蛋白质"（1)与自然界中发现的蛋白质无关，（2)不含来自相同源的其它蛋白质，例 如，不含鼠科蛋白质，（3)由来自不同物种的细胞来表达，或（4)在自然界中并未发生。
[0137] 术语"多肽"在本文中用作一般术语，是指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。 因此，天然蛋白质、片段或类似物是多肽类物质。根据本发明的优选多肽包含人类重链免疫 球蛋白分子和人类κ轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫 球蛋白分子（诸如κ轻链免疫球蛋白分子或λ轻链免疫球蛋白分子）的组合形成的抗体 分子，且反之亦然，以及其片段和类似物。
[0138] 如本文所用的应用于一种物体上的术语"天然发生"是指在自然界中可发现一种 物体的这个事实。例如，存在于可自天然源分离的有机体（包括病毒）中，而且未经在实验 室中人为或以其它方式有意改质的多肽或多聚核苷酸序列是天然发生的。
[0139] 如本文所用的术语"可操作性连接"是指所述组分的位置处于可允许它们以其所 预期的方式发挥功能的关系中。对照序列"可操作连接"至编码序列是以在与对照序列相 容的条件下可达到表达编码序列的方式加以绑扎。
[0140] 本文所用的术语"对照序列"是指对于实现多聚核苷酸序列所连接的编码序列的 表达和处理有必要的多聚核苷酸序列。这些对照序列的本质视其宿主生物体而不同，在原 核生物中，这些对照序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物 中，这些对照序列通常包括启动子和转录终止序列。术语"对照序列"意味着包括至少其存 在对于例如先导序列和融合伙伴序列的表达和处理所必需的所有组分，而且也包括其存在 对于例如先导序列和融合伙伴序列有利的其它组分。
[0141] 本文所提及的术语"多聚核苷酸"意思是长度至少为10个基的核苷酸的聚合形 式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的改质形式。术语包括DNA的单链和双 链形式。
[0142] 本文提及的术语"寡核苷酸"包括天然发生的和由天然发生与非天然发生的寡核 苷酸连接子连接在一起的改质核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更短长度的多聚 核苷酸亚组。寡核苷酸优选长度为10到60个碱基，且最优长度为12、13、14、15、16、17、18、 19或20到40个碱基。寡核苷酸通常为单链，例如用作探针；尽管寡核苷酸可为双链，例如 用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可为正义或反义寡核苷酸。
[0143] 本文提及的术语"天然发生的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文 提及的术语"改质核苷酸"包括含有改质或取代糖基的核苷酸及其类似物。本文提及的术 语"寡核苷酸连接子"包括寡核苷酸连接子，诸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、 二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酰胺酯及其类似物。见，例如LaPlanche 等人，Nucl. Acids Res. 14 :9081 (1986) ;Stec 等人，J. Am. Chem. Soc. 106 :6077 (1984); Stein 等人，Nucl. Acids Res. 16 :3209(1988) ;Zon 等人，Anti-Cancer Drug Design6 : 539 (1"1) ;Zon 等人，Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach，第 87_l〇8 页（F. Eckstein 编，Oxford University Press，Oxford England (1991)) ;Stec 等人，美国专 利第 5,151，510 号；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews90 :543 (1990)。如果需要，寡核 苷酸可包括用于检测的标签。如本文所用的术语"变体"为不同于所列举的多肽或多聚核苷 酸的多肽、多聚核苷酸或分子，但只是为了不对蛋白质活性造成不利改变。可存在表位的变 体。可存在抗体的变体。在优选实施例中，蛋白质变体结合至表位的能力未不利改变。在 一个实施例中，蛋白质变体可以与野生型mAb能力的10-500 %结合。例如，蛋白质变体可以 与野生型mAb能力的10 %、50 %、110 %、500 %或大于500 %结合。在一个实施例中，包括在 10-500%范围之间的结合能力。结合能力可通过多种方式反映，包括（但不限于）变体对 表位的k a、kd或KD。在一优选实施例中，表位是本说明书中所述的表位。
[0144] 在一个实施例中，变体抗体可通过替换、缺失或添加5个或更少氨基酸而不同于 野生型的序列。这些变体通常可通过改质所揭示多肽序列之一，并使用例如本文所述的代 表性程序评估经改质多肽的结合特性来识别。在另一个实施例中，多肽变体优选展示与经 识别多肽至少约70%、更优至少约90%且最优至少约95%的同一性。优选地，变体只在保 守替换和/或改质上不同。变体蛋白质包括那些与本说明书所述的蛋白质结构在结构上类 似和功能相当的蛋白质。在另一个实施例中，如果蛋白质与本说明书中所述蛋白质功能上 相当，那么这种蛋白质可以是变体，只要变体的互补位与本说明书中所述的互补位类似。在 一个实施例中，任何具有与图17中所述互补位类似形状的物质都是变体。在一个实施例 中，任何具有与图18中所述互补位类似形状的物质都是变体。在一个实施例中，任何具有 与图19A和19B中所述相互作用表面类似形状的物质都是变体。
[0145] 在一个实施例中，如果核酸序列在严格条件下可选择性地与野生型的序列杂交， 那么抗体为变体。在一个实施例中，合适的适度严格条件包括在5xSSC溶液中预洗，0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8 :0);在50C-65°C下杂交，5xSSC，隔夜或如果为种间同源物，则在45°C 下，0. 5xSSC ;继而在65°C下以每次含有0. 1% SDS的2x、0. 5x和0. 2xSSC洗脱两次，历时 20分钟。这些杂交DNA序列也属于本发明的范畴中，由于编码的简并性，如核苷酸序列编 码的抗体多肽也由杂交DNA序列所编码。本文提及的术语"选择性杂交"意思是可检测地 且特异性地结合。根据本发明的多多聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在一定杂交和洗脱条件 下与核酸选择性杂交，所述杂交与洗脱条件可以减小与非特异核酸的可检测结合的可测 量。高度严谨条件可用于达到如此项技术中已知且于本文中所讨论的选择性杂交条件。一 般而言，本发明的多多聚核苷酸、寡核苷酸和片段与令人感兴趣的核酸序列之间的核酸序 列同源性至少为80%，且更一般的为优选至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同 源性。如果在两种氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，那么这两种氨基酸序列即为同 系。例如，85%同源性意思是当两种序列进行最大匹配比对时，85%的氨基酸一致。在最 大化匹配中允许存在间隙（两种序列的任一种相匹配）；优选为5或更少的间隙长度，2或 更少为更优。或者或优选地，如本文所用的这个术语，如果使用含有突变数据矩阵和6或 更多间隙代价的ALIGN程序，两种蛋白质序列（或自长度为至少30个氨基酸的蛋白质中 衍生的多肽序列）具有多于5的比对分值，那么它们同源。见Dayhoff，M. 0.，in Atlas of Protein Sequence and Structure,第 101-110 页（第 5 卷，National Biomedical Research Foundation(1972))和此卷的第2期增刊，第1-10页。如果两种序列或其部分的氨基酸当 使用ALIGN程序最佳比对时大于或等于50%-致，那么这两种序列或其部分更优同源。本 文所用的术语"对应于"意思是多多聚核苷酸序列与参考多聚核苷酸序列同源（即，一致， 但非严格演化相关），或多多聚核苷酸序列与参考多聚核苷酸序列一致。对比而言，本文所 用术语"互补"意思是互补序列与参考多聚核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸 序列"TATAC"对应于参考序列"TATAC"且与参考序列"GTATA"互补。
[0146] 以下术语用于描述两种或两种以上多聚核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系： "参考序列"、"比较窗口 "、"序列一致性"、"序列一致性百分率"和"实质一致性"。"参考序 列"为已确定的序列，用作序列比较的基准；参考序列可为更大序列的亚组，例如，如序列列 表中给定的全长cDNA或基因序列的片段，或可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，参考 序列长度至少为18个核苷酸或6个氨基酸，长度经常为至少24个核苷酸或8个氨基酸，且 长度通常为至少48个核苷酸或16个氨基酸。由于两个多聚核苷酸或氨基酸序列可能每一 个（1)包含在两个分子之间类似的序列（即，完整多聚核苷酸或氨基酸序列的一部分），和 (2)可能进一步包含在两个多聚核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列，一般通过经"比较窗 口"比较两个分子的序列以识别和比较序列类似的局部区域来进行两个（或更多）分子之 间的序列比较。如本文所用的"比较窗口"是指至少18个邻接核苷酸位置或6个氨基酸的 概念片段，其中多聚核苷酸序列或氨基酸序列可与至少18个邻接核苷酸或6个氨基酸序列 的参考序列相比较，且其中多聚核苷酸序列在比较窗口中的位置与参考序列（其不包含添 加或缺失）相比，可包含20%或更少的添加、缺失、替换及其类似物（即，间隙），以供两个 序列的最优序列比对。可通过Smith和Waterman,Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)的局部同系 物算法，通过Needleman和Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同系物比对算法，通过用 于 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85 :2444 (1988)的类似方法的研究， 通过这些算法的计算机执行过程（GAP，BESTFIT，FASTA和Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0 中的 TFASTA, (Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, Wis. )，Geneworks或Mac Vector软件封装），或通过观测来进行用于比对比较窗口的序列 的最优序列比对，且选择由各种方法产生的最佳序列比对（即，导致同系物于比较窗口上 的最高百分比）。
[0147] 术语"序列一致性"意思是两个多聚核苷酸或氨基酸序列于比较窗口上一致（即， 在核苷酸X核苷酸或残基X残基的基础上）。术语"序列一致性百分比"通过比较两个 在比较窗口上最优比对的序列，测定于两个序列中发生一致核酸基（例如，A、T、C、G、u或 I)或残基以产生匹配位置编号的所在位置的编号，将匹配位置的编号除以比较窗口中的位 置总数（即，窗口大小），且将所得结果乘以1〇〇,以产生序列一致性百分比。如本文所用 的术语"实质一致性"表示多聚核苷酸或氨基酸序列的特征，其中与至少18个核苷酸（6个 氨基酸）位置的比较窗口上，经常于至少24-48个核苷酸（8-16个氨基酸）位置的窗口上 的参考序列相比，多聚核苷酸或氨基酸包含至少85%序列一致，优选至少90%至95%序列 一致，更通常至少99%序列一致的序列，其中通过将参考序列与可能包括比较窗口上总计 20 %或更少参考序列的缺失或添加的序列相比较来计算序列一致性百分比。参考序列可为 更大序列的亚组。与野生型的蛋白质或核酸实质上一致的氨基酸或核酸为野生型的蛋白质 或核酸的变体实例。
[0148] 如本文所用的20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis (第 2 版，Ε· S. Golub and D. R. Gren 编，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。20种常规氨基酸（例如，D-氨基酸），人造氨基酸（诸如a-氨基酸、a-双取代氨 基酸、N-烷基氨基酸、乳酸）及其它非常规氨基酸的立体异构体也可以作为用于本发明多 肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4_羟基脯氨酸、γ -羧基谷氨酸、e-N，N，N-三甲 基赖氨酸、c-N-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲 基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ -N-甲基精氨酸及其它类似氨基酸和亚氨基酸（例如4-羟基 脯氨酸）。在本文所用的多肽符号中，根据标准用途和常规，左手方向为氨基末端方向，且右 手方向为羧基末端方向。
[0149] 类似地，除非另外指明，单链多聚核苷酸序列的左手端为5'端，双链多聚核苷酸 序列的左手端称为Υ方向。初生RNA转录的Υ至:V添加的方向称为转录方向，具有与 RNA相同的序列且为RNA转录的5'至5'端的DNA链上的序列区域称为"上游序列"，具有 与RNA相同的序列且为RNA转录的3'至3'端的DNA链上的序列区域称为"下游序列"。
[0150] 如应用于多肽的术语"实质一致性"意思是当两个肽序列诸如通过使用默认间隙 重量的GAP或BESTFIT程序最优比对时，两个肽序列共享至少80 %的序列一致性，优选为 至少90 %的序列一致性，更优为至少95 %的序列一致性，且最佳为至少99 %的序列一致 性。优选地，非一致的残基位置通过保守氨基酸替换而不同。保守氨基酸替换是指具有类 似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸群组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸群组为丝氨酸和苏氨酸；具有含氨化物 侧链的氨基酸群组为天冬酰胺和谷酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸群组为苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸群组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的 氨基酸群组为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换基团为：缬氨酸-亮氨酸-异 亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰 胺-谷酰胺。实质上一致的多肽可为变体。
[0151] 变体蛋白质也包括具有微小变化的蛋白质。如本文所讨论，考虑到了本发明所包 含的抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化，只要氨基酸序列中的变化保持在 至少75 %，更优至少80 %、90 %、95 %，且最优为99 %。尤其而言，也考虑到了保守氨基酸的 置换。
[0152] 保守置换为那些发生于与其侧链相关的氨基酸家族中的置换。经基因编码的氨 基酸通常分为以下家族：（1)酸性-天冬氨酸、谷氨酸；（2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸； (3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和（4) 不带电极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优的家族 为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷酰胺为含氨化物家族；丙氨酸、缬 氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族，且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为脂肪族家族。例如， 可合理预期以异亮氨酸或缬氨酸经分离置换亮氨酸，以谷氨酸经分离置换天冬氨酸，以丝 氨酸经分离置换苏氨酸或以结构相关的氨基酸经分离置换氨基酸的类似置换将不会对所 得分子的结合或特性具有重要影响，尤其如果置换不涉及框架位点内部的氨基酸时。氨基 酸变化是否导致功能肽可易于通过检定多肽衍生物的特异性活性来测定。检定于下文中加 以详述。所属领域的一般技术人员可易于制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优 选片段或类似物的氨基和羧基-末端发生于功能结构域的边缘附近。可通过将核苷酸和/ 或氨基酸序列数据与公开或专有序列数据库相比较来识别结构和功能结构域。优选地，使 用计算机比较方法来识别发生于其它已知结构和/或功能地蛋白质中的序列基元或预测 蛋白质构型结构域。已知用于识别折叠为已知的三维结构的蛋白质序列的方法。Bowie等 人，Science253 :164 (1991)。因此，前述实例表明，所属领域的技术人员可识别可用于根据 本发明的抗体界定结构和功能结构域的序列基元和结构构型。
[0153] 优选氨基酸替换为以下替换：（1)减少对蛋白水解作用的敏感性，（2)减少对氧化 作用的敏感性，（3)改变供形成蛋白质错合物的结合亲和力，（4)改变结合亲和力且（5)授 予或改质这些类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括除天然发生的肽序列之 外的序列的各种突变蛋白质。例如，可在天然发生的序列（优选为形成分子间接触的结构 域外部的多肽部分）中进行单一或多重氨基酸替换（优选为保守氨基酸替换）。保守重氨 基酸替换不应实质上改变亲本序列的结构特征（例如，置换氨基酸不应破坏发生于亲本序 列中的螺旋体，或干扰表征亲本序列的二级结构的其它类型）。在Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton 编，W. H. Freeman and Company, New York (1984))、 Introduction To Protein Structure (C. Branden 和 J. Tooze 编，Garland Publishing, New York，N.Y. (1991))和Thornton等人，Nature354 :105(1991)中描述此项技术识别的多肽 二级和三级结构的实例。
[0154] 如本文所用的术语"多肽片段"是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失的多 肽，但其中残留的氨基酸序列与自（例如）全长cDNA序列引出的天然发生的序列中的对应 位置一致。片段一般为至少5、6、8或10个氨基酸长，优选为14个氨基酸长，更优为至少20 个氨基酸长，通常为至少50个氨基酸长，且甚至更优为至少70个氨基酸长。如本文所用的 术语"类似物"是指包含与引出的氨基酸序列的一部分实质上一致的至少25个氨基酸片段 的多肽。类似物一般为至少20个氨基酸长，优选为至少50个氨基酸长且可经常长至全长 的天然发生多肽。片段和类似物都是变体形式。
[0155] 肽类似物通常以类似于模板肽的特性而作为非肽药物用于医药工业中。这些类型 的非肽化合物称为"肽的模拟物"和"肽模拟物"，Fau Chere，J. Adv. Drug Res. 15 :29(1986); Veber and Freidinger TINS，第 392 页（1985)和 Evans 等人，J. Med. Chetn. 30 :1229 (1987)。 通常借助于计算机分子模型来研发这些化合物。结构类似于治疗用肽的肽模拟物可用于产 生相当的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物在结构上与样式多肽类似（即，具有生物化 学特性或药理学活性的多肽），诸如人类抗体，但其中一个或一个以上肽连接子通过此项技 术中熟知的方法视情况由选自由 -CH2NH -、一CH2S-、-CH2_CH2-、一CH = CH-(顺式和反 式）、一coch2-、一ch(oh)ch2-和-ch2so-组成的群组的连接子所置换。以相同类型的 D-氨基酸系统替换一个或一个以上统一序列的氨基酸（例如，以D-赖氨酸代替L-赖氨酸） 可用于产生更稳定的肽。此外，可由此项技术中已知的方法产生包含统一序列或实质上一 致的统一序列变化的限定肤（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992));例如， 通过添加可形成环化肽的分子内双硫桥的内部半胱氨酸残基。肽的模拟物和肽模拟物都是 变体形式。
[0156] "抗体"或"抗体肽"是指完整抗体或其与供特异性结合的完整抗体竞争的结合片 段。通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶分解或化学分解来产生结合片段。结合片段包 括？ &134&13'、？(&13')24￥和单链抗体。除"双特异性"或"双功能"抗体之外的抗体应理 解为其每一个结合位点一致。当过量抗体将结合至反受体的受体量减少至少约20%、40%、 60%或80%，且更通常大于约85% (如由活体外竞争性结合检定所测量）时，抗体实质上 抑制受体粘合至反受体。术语"表位"包括任何可特异性结合至免疫球蛋白或T-细胞受体 或否则与分子相互作用的蛋白质决定簇。表位簇通常由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链 分子的化学活性表面群组组成，且通常具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表 位可为"线性"或"构型"。在线性表位中，蛋白质与相互作用的分子（诸如抗体）之间的所 有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构型表位，相互作用点于彼此分离 的蛋白质上的氨基酸上交叉发生。据说当解离常数彡1 μ Μ，优选彡ΙΟΟηΜ且更优彡ΙΟηΜ，且 甚至更优< InM时，抗体特异性结合抗原。一旦确定抗原上需要的表位，就可能例如使用本 发明所述技术产生对于那个表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生和特征可阐明所 需表位的信息。基于这些信息，随后可能竞争性地筛选用于结合至相同表位的抗体。一种达 到此目的的方式是进行寻找彼此竞争性结合的抗体（例如，竞争结合至抗原的抗体）的交 叉竞争研究。一种基于其交叉竞争的用于"结合"抗体的高产量处理描述于国际专利申请案 第TO03/48731号。如由所属领域的技术人员所了解的，抗体可特异性结合至的任何特定物 质都可以是表位。表位可包含抗体结合至的那些残基。在一个实施例中，表位为EGFRvIII 表位。在一更优实施例中，表位为本说明书实例4中所述的表位。在一个实施例中，表位为 实例14中所述的表位。在一个实施例中，表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO :59)。在 一个实施例中，表位包含序列EEKKGNYWT(SEQ ID NO :57)。在一个实施例中，表位包含序列 EKNY(SEQ ID NO :60)。在一个实施例中，表位包含序列EEKGN(SEQ ID NO :61)。所属领域的 技术人员将了解到这些实际上不必在单肽上以此顺序组合，而这些是形成与互补位相互作 用的表位的残基。如所属领域的技术人员所将了解的，由产生分子形状的残基或侧链占据 的空间有助于测定表位为何。同样，与表位相关的任何官能基、范德华相互作用、侧链的移 动度等都可测定表位实际上为何。因此，表位也可以包括能量互动。
[0157] 术语"互补位"意味着描述测定对于表位的结合的结合区的通用结构。这个结构影 响结合区是否结合至表位及其结合的方式。互补位可指负责抗体或其片段结合至表位簇的 抗体的抗原位点。互补位也指抗体的独特位，和结合至表位的互补决定区（CDR)。在一个实 施例中，互补位是图17中的1^110、1^230、1^350、!1120、!1240和!1360的抗体区。在一个实施 例中，互补位是包含实例16中用于LI、L2、L3、HI、H2和H3的⑶R序列的抗体区。在一个 实施例中，互补位是图18中的L1，110、L2,130、L3,150、H1120、H2140和H3160的抗体区。 在一个实施例中，互补位是包含实例18中用于LI、L2、L3、HI、H2和H3的⑶R序列的抗体 区。在一个实施例中，互补位包含实例18中所列的序列。在一个实施例中，互补位包含与 表位相互作用的残基，如图19A和图19B中所示。实体黑色结构为肽结构。在一个实施例 中，互补位包含13. 1. 2mAb的残基Tyrl72Arg。在一个实施例中，13. 1. 2mAb的互补位包含选 自由以下各残基组成的群组的至少一个残基：Tyrl72Arg、Argl01Glu、Leu99Asn、Leu99His、 Argl01Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Argl01Gln 和 Asn35Gly。如所属领域的技术 人员所将了解的，任何抗体的互补位或其变体都可由本申请案所陈述的方式来测定。如果 残基预测可贡献10 %的结合能，就认为残基"重要"。在一个实施例中，如果残基预测可贡献 2%的结合能，就认为残基"重要"。在一个实施例中，如果残基预测可贡献50%的结合能， 就认为残基"重要"。在一个实施例中，如果残基预测与表位表面或互补位表面相互作用，就 认为残基"重要"。在一个实施例中，如果改变残基导致结合损失，就认为残基"重要"。
[0158] 术语"特异性"或"优先"结合至，或类似措辞并不意味着表示抗体只可结合至那 个表位。相反，意思是抗体或其变体可结合至那个表位，其程度比抗体结合至抗体所暴露的 至少一种其它物质的程度更高。在一个实施例中，特异性结合抗体将以比其至EGFR蛋白质 更大的亲和力结合至EGFRvIII蛋白质（更紧，或较低的K D)。例如，特异性结合抗体的结合 将更紧至少增加 1 %、1-2 %、2-5 %、5-10 %、10-20 %、20-30 %、30-50 %、50-70 %、70-90 %、 90-120 %、120-150 %、150-200 %、200-300 %、300-500 %、500-1000 % 或更多。
[0159] 氨基酸，编号，氨基酸的缩写形式，例如Leu217Gln表示编号氨基酸从第一种氨基 酸到第二种氨基酸的突变。因此，Tyrl72Arg意思是当野生型的蛋白质具有172位置的酪 氨酸时，突变具有172位置的精氨酸。
[0160] 本文所用的术语"药剂"表示化合物、化合物的混合物、生物高分子或从生物物质 形成的萃取物。
[0161] 本文所用的"哺乳动物"指认为是哺乳动物的任何动物。哺乳动物优选人类。
[0162] 含有酶（木瓜蛋白酶）的抗体的消化导致两种一致的抗原结合片段，也称为 "Fab"'片段和"Fc"片段，其不具有抗原结合活性，但具有结晶能力。含有酶（胃蛋白酶） 的抗体的消化导致F(ab' )2片段，其中抗体分子的两臂保持连接，且包含两个抗原结合位 点。F(ab' )2片段具有交联抗原的能力。
[0163] 本文所用的"Fv"指保持抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。这些片段 也可认为是抗体的变体。
[0164] 本文所用的"Fab"指包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的抗体片段。
[0165] 术语"mAb"指单克隆抗体。
[0166] 对于XenoMax方法产生的抗体序列的描述编码如下："AB" -指抗体， "EGFRvIII " -指抗体的结合特异性，"X"指衍生自小鼠的XenoMouse，"G1" -指IgGl 同位型或"G2"_指IgG2同位型，最后三个数字指抗体自其衍生的单细胞编号，例如： AB-EGFRvIII-XGl-095为具有IgGl同位型XenoMouse小鼠对EGFRvIII的结合特异性的抗 体，且细胞编号为95。
[0167] 术语"SC"指单细胞，且特定XenoMax方法衍生的抗体可称为SC，其后紧跟三个数 字，或只有三个数字，在本文中指抗体衍生的单细胞编号。
[0168] 对于杂交瘤衍生的抗体序列的描述编码如下："AB"_指抗体，"EGFRvIII"-指 抗体的结合特异性，"X"指衍生自小鼠的XenoMouse, "G1" -指IgGl同位型或 "G2"-指IgG2同位型，"K"指k，"L"指λ。最后三个数字指抗体衍生的纯系，例如： AB-EGFRvIII-XGlK-13. 1. 2。
[0169] 本文所用的"标记"或"经标记"指对多肽添加的可检测部分，例如，放射性同位素 标记、萤光标记、酶标记、化学发光标记或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括3H、 14C、 15N、35S、9°Y、"Tc、mIn、125I、 131I，萤光标记可包括罗丹明（rhodamine)、镧系磷或 FITC，且 酶标记可包括辣根过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶。
[0170] 如本文所用的术语"医药剂或药物"指当适当施与患者时可产生理想治疗效果的 化合物或组合物。如由 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker，S.编， McGraw-Hill, San Francisco(1985))所例示，根据此项技术中的常规用法在本文中使用其 它化学术语。
[0171] 如本文所用的"实质上纯"意思是靶物质为主要存在的物质（即，以摩尔量计，组 合物中比任何其它个别物质都大量存在），且优选地，实质上经纯化的部分为其中靶物质占 存在的所有高分子物质至少约50% (以摩尔量计）的组合物。一般而言，实质上纯的组合 物将占组合物中存在的所有高分子物质的多于约80%，更优多于约85%、90%、95%、99% 和99.9%。最优地，将靶物质纯化至基本上为均质（通过常规检测方法检测不到组合物中 的污染物质），其中组合物基本上由单高分子物质组成。
[0172] 术语"患者"包括人类和兽医受检者。
[0173] 术语 " ;SLAM? Techno 1 ogy " 指 " Se 1 ected Lymphocyte Ant ibody Method"（Babcook 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，i93 :7843-7848 (1996)和 Schrader，美 国专利第5,627,052号）。
[0174] 术语"XenoMax?"指SLAM Technology 与 XenoMouse?小鼠的使用（如下文所述）。
[0175] 抗体结构
[0176] 已知基本抗体结构单位包含四聚物。每一四聚物由两对一致的多肽链组成，每一 对具有一个"轻链"（约25kDa)和一个"重链"（约50-70kDa)。每一个链的氨基-末端部分 包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每一个链的羧基-末端 部分界定主要负责效应子功能的恒定区。人类轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、 δ、γ、α或ε，且将抗体的同位型分别界定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链 种可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的"J"区来连接，其中重链也包括约10个 或更多个氨基酸的"D"区。一般见，Fundamental Immunology第7章（Paul,W.编，第2版， Raven Press, N. Y. (1989))。每一轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
[0177] 因此，完整抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体之外，两个结合位 点相同。
[0178] 这些链都展示由三个高变区连接的相对保守的框架区（FR)相同的通用结构，也 称为互补决定区或⑶R。每一对两个链的⑶R通过框架区比对，使得可结合至特异性表 位。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结 构域。每一结构域的氨基酸分配是根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1987 和 1991))或 Chothia & Lesk J. Mol. Bioll96 :901-917 (1987) ;Chothia 等人，Nature342 :878-883 (1989)中的定 义。
[0179] 双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人 造杂交抗体。双特异性抗体可通过多种包括杂交瘤的融合和Fab'片段的连接的方法来产 生。见例如 Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990)，Kostelny 等 人，J. Immunol. 148 :1547-1553(1992)。双特异性抗体的产生与常规抗体的产生相比可为 相对劳动密集型的工艺，而且双特异性抗体的产量和纯度通常较低。双特异性抗体不以具 有单结合位点片段的形式存在（例如，Fab、Fab'和Fv)。除了抗体的通用结构方面之外， 互补位和表位之间的更特异相互作用可通过结构方式来检验。在一个实施例中，CDR结构 形成互补位，抗体经其可结合至表位。这种互补位的结构可通过多种方式来测定。可使用 传统的结构检验方法，诸如NMR或X-射线晶体学。这些方法可检验单独互补位，或当其结 合至表位时的结构。或者，分子模型可在计算机模拟中产生。结构可借助于市售的封装，诸 如Accelrys(San Diego, CA)的Insightll模型封装，通过同系模型产生。简而言之，可利 用检验抗体序列来寻求已知结构蛋白质的数据库，诸如，蛋白质结构数据库（Protein Data Bank)。在识别具有已知结构的同系蛋白质之后，这些同系蛋白质可用作模型模板。每一种 可能模板可经比对，由此产生这些模板中基于结构的序列比对。随后可将具有未知结构的 抗体序列与这些模板比对以产生具有未知结构抗体的分子模型。如所属领域的技术人员 将了解的，存在多种在计算机模拟中产生所述结构的替代方法，可使用其中任何一种。例 如，可使用类似于Hardman等人，颁布的采用QUANTA (Polygen Corp.，Waltham, Mass.)和 CHARM(Brooks, B. R. , Bruccoleri, R. Ε· , Olafson, B. D. , States, D. J. , Swaminathan, S.和 Karplus，M.，1983, J. Comp. Chem, · 4 :187)的美国专利第 U. S. Pat. No. 5, 958, 708 号中所述 工艺的工艺。
[0180] 不但互补位的形状对于测定可能互补位是否结合至表位及其良好程度很重要，而 且表位和互补位之间的相互作用本身是设计变体抗体的大量信息来源。如所属领域的技术 人员将了解的，存在多种研究这种相互作用的方式。一种方式是使用可能如上文所述产生 的结构模型，且随后使用诸如InsightII(Accelrys，SanDiego, CA)的程序，其具有一个可 对互补位和其表位之间的构型和定位空间进行Monte Carlo研究的扩展模块。结果是可评 估表位和互补位相互作用的地点和方式。在一个实施例中，只有表位的片段或变体用于协 助测定相关的相互作用。在一个实施例中，整个表位用于互补位和表位之间相互作用的建 模。如所属领域的技术人员将了解的，这两种不同方法具有不同的优点和不足。例如，仅使 用表位片段使得可对每一侧链的可能变体进行更为详尽的检验，而无需耗费大量时间。另 一方面，通过仅使用表位片段，或仅使用表位代替整个蛋白质，表位片段的特征与整个表位 的特征可能不同，因此可能增加在计算建模过程中误导的风险。在一个实施例中，以有限程 度使用两种方法以交叉检查结果。在一优选实施例中，如果使用表位变体，可最优化以便表 位变体包含表位的最重要残基。最重要残基的一致性可通过多种方式测定，例如如本发明 实例4和14中所述。
[0181] 通过使用这些产生的结构，可测定哪些残基在表位和互补位之间的相互作用中最 重要。因此，在一个实施例中，可易于选择改变哪些残基来改变抗体的结合特征。例如，从 扩展模型显而易见，表位中某些残基的侧链可在空间上阻止表位的结合，由此将这些残基 改变为具有较小侧链一致的残基。
[0182] 这可以多种方式来测定。例如，只需观察两个模型来评估基于官能基和邻近基团 的相互作用。或者，如上文所述，可进行表位和互补位的重复组对，以获得更为有利的能量 相互作用。也可测定多种抗体变体的这些相互作用来测定其中抗体可结合至表位的替代方 式。也可将各种模型组合来测定如何改变抗体结构来获得具有所需特定特征的抗体。
[0183] 上述测定的模型可通过各种技术来测试。例如，相互作用能可由上文讨论的程序 来测定以决定需进一步检验哪种变体。又，使用库仑和范德华相互作用来测定表位和变体 互补位的相互作用能。也使用针对突变的位点来观察抗体结构中的预定变化实际上是否可 导致结合特征的所需变化。或者，可改变表位来证实模型正确或用于测定可能在互补位和 表位之间发生的一般结合主题。
[0184] 上述用于建模结构的方法可用于测定蛋白质结构中的何种变化将导致抗体的特 定所需特征。这些方法可用于测定蛋白质结构中的何种变化不会导致抗体的所需特征。
[0185] 如所属领域的技术人员将了解的，尽管这些模型将为形成本发明的抗体及其变体 提供必要的向导，但仍需要进行计算机模拟模型中的常规测试，可能通过活体外研究。此 夕卜，如所属领域的技术人员将了解的，任何改质也会对抗体活性具有另外的副效应。例如， 尽管预期导致更大结合的改变可引起更大的结合，也可引起其它会减少或改变抗体活性的 结构变化。对于是否为这种情况的测定在所属领域中很常见，而且可通过多种方式来进行 测定。例如，如实例21中，活性可通过ELISA测试来测试。或者，可以通过使用表面等离子 体共振装置来测试样品。
[0186] 抗体结合和供优自结合的夺体抗体
[0187] 在一个实施例中，上述模型用于增加抗体对其表位的结合能力。抗体可更易于结 合至表位，且因此具有较高的缔合常数（k a)。或者，抗体可较慢自表位离解，且因此具有较 低的离解常数（kd)，或表位-互补位的k d值较小，因此使得表位和互补位之间的结合程度 更高。
[0188] 在某些实施例中，设计变体抗体以相反特征结合。即，抗体不紧密结合或可能不快 速结合。
[0189] 在其它实施例中，变体抗体的KD与野生型的抗体不同，但变体抗体对于特定表位 更具特异性。这意味着经设计抗体的互补位具有较低结合至其它表位的风险。抗体可具有 已改变的其它特征。例如，变体对非特异性抗体结合更具免疫性，或即使当抗体以高浓度存 在时，在溶液中仍保持溶剂化。这种变体可存在于所讨论的抗体中。例如，尽管下文检验的 某些变体抗体的较高浓度导致了 Biacore实验中较慢的结合组分（例如，13. 1. 2mAb)，但某 些变体即使在相同浓度下仍不展示所述较慢组分，例如L217N-2. 1。可形成由上文测定的模 型预测的变体，且随后经测试来测定其实际上是否以所需特征结合。可选择与表位具有较 大总相互作用能的突变体以供进一步测试。相互作用能可以多种方式测定，其中之一如上 文所述。
[0190] 这些变体可以多种方式测试。示范性的选择包括，而且不限于KinExA(例如， Lackie 颁布的专利第 5, 372, 783 号，1994 年 12 月 13 日）（Sapidyne Instruments Inc.，ID， Boise)、表面等离子体共振（SPR) (e. g.，BIACORETM Biacore，Inc.，Pistcataway，N. J.)、停 流萤光、共振镜和萤光偏振。许多这些选择不但可以记录数据，而且可以提供用于将数据拟 合为各种理论曲线并由此测定k a、k<^PKD以及其它特性的现成构件。重要的是，应注意到 这些曲线拟合为结果数据并不排除存在一些偏差的可能性。因此，相关的缔合、离解和平衡 常数不但可以通过这些曲线拟合机理来观察，也可以根据所属领域的技术人员的知识直接 相互比较。
[0191] 人类抗体和抗体的人源化
[0192] 人类抗体避免了与具有鼠科或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的问题。这些鼠 科或大鼠衍生蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致抵抗患者体内抗体的免疫反 应的产生。为避免使用鼠科或大鼠衍生抗体，可通过将人类抗体功能引入啮齿动物以便于 啮齿动物产生完全人类抗体来产生完全人类抗体。
[0193] 克隆和重构YAC中兆碱基尺寸的人类基因座及将其引入小鼠种系的能力为说明 极大或经原始映射的基因座的功能组分以及产生人类疾病的有用模型提供了有力途径。此 夕卜，使用这种技术将小鼠基因座替换为其人类等效物可为发育期间的人类基因产物的表达 和调节、它们与其它系统的信息传递及其在疾病诱发和进展中的关联提供独特见解。
[0194] 这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的"人源化"。将人类免疫球蛋白 (Ig)基因座引入内源Ig基因已失活的小鼠中提供机会来研究抗体的程序化表达和组合及 其在B-细胞发育中的作用中的潜在机理。此外，这种策略可为产生完全人类单克隆抗体 (mAb)_ -种在人类疾病种实现抗体治疗前景的重要里程碑提供理想来源。预期完全人类抗 体可将免疫和过敏反应本质最小化为小鼠或小鼠衍生mAb，且因此增加了经投予抗体的功 效和安全性。使用完全人类抗体预期可为治疗慢性和复发性人类疾病提供实质好处，诸如 炎症、自身免疫力和癌症，这些都需要反复投予抗体。
[0195] 一种针对这个目的的方法是设计不足以用于具有人类Ig基因座大片段的小鼠抗 体生产的小鼠品系，以预期这些小鼠可在无小鼠抗体的情况下产生人类抗体的大指令系 统。大的人类Ig片段可保持大的可变基因多样性以及对抗体生产和表达的合适调节。通 过采用用于抗体多样化和选择的小鼠工具和对于人类蛋白质免疫耐受性的缺乏，这些小鼠 品系中再现的人类抗体指令系统应产生对于任何感兴趣的抗原（包括人类抗原）都具有高 亲和力的抗体。使用杂交瘤技术，可易于生产和选择具有所需特异性的抗原-特异性人类 mAb。如1994年所公开的，结合第一代XenoMouse品系表明这种一般策略（见Green等人， Nature Genetics7 :13-21 (1994))。XenoMouse品系设计为具有分别含有人类重链基因座和 κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体（YAC)，其含有核 可变核恒定区序列Id。含有YAC的人类Ig经证明与供抗体重排和表达的小鼠系统相容且 可替换为失活的小鼠 Ig基因。这可由其诱发B-细胞发育、产生完全人类抗体的类似成人 的人类指令系统和产生抗原-特异性人类mAb能力来证实。这些结果也表明，引入含有较 大编号V基因的人类Ig基因座的较大部分、另外的调节元素和人类Ig恒定区可实质上概 括完整指令系统，其以对于感染和免疫的人类体液反应为特征。Green等人的著作最近由引 入大于约80%的人类抗体指令系统扩展至分别引入兆碱基大小的人类重链基因座和κ轻 链基因座的种系构型YAC片段。见Mendez等人，Nature Geneticsl5 :146-156(1997)和美 国专利申请案第08/759, 620号，申请于1996年12月3日。
[0196] XenoMouse小鼠的产生于以下专利中进一步讨论和叙述：美国专利申请案第 07/466, 008号，申请于1990年1月12日；第07/610, 515号，申请于1990年11月8日；第 07/919, 297号，申请于1992年7月24日，第07/922, 649号，申请于1992年7月30日；第 08/031,801号，申请于1993年3月15日；第08/112,848号，申请于1993年8月27日；第 08/234, 145号，申请于1994年4月28日；第08/376, 279号，申请于1995年1月20日； 第08/430,938号，申请于1995年4月27日；第08/464, 584号，申请于1995年6月5日； 第08/464, 582号，申请于1995年6月5日；第08/463,191号，申请于1995年6月5日； 第08/462, 837号，申请于1995年6月5日；第08/486, 853号，申请于1995年6月5日； 第08/486, 857号，申请于1995年6月5日；第08/486, 859号，申请于1995年6月5日；第 08/462, 513号，申请于1995年6月5日；第08/724, 752号，申请于1996年10月2日和第 08/759, 620号，申请于1996年12月3日和美国专利第6,162, 963号、第6,150, 584号、第 6,114, 598 号、第 6, 075,181 号和第 5, 939, 598 号和日本专利第 3068180B2 号、第 3068506B2 号和第 3068507B2 号。也可见 Mendez 等人，Nature Geneticsl5 :146-156(1997)和 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495 (1998) 〇
[0197] 也可见欧洲专利第EP0463151B1号，于1996年6月12日授权公开，国际专利申 请案第W094/02602号，于1994年2月3日公开，国际专利申请案第W096/34096号，于 1996年10月31日公开，第TO98/24893号，于1998年6月11日公开，第TO00/76310号， 于2000年12月21日公开，第W003/47336号。在另一种方法中，其它公司，包括GenPharm International公司已使用"微基因座"方法。在微基因座方法中，外源Ig基因座通过包 含来自Ig基因座的物质（个别基因）来模仿。因此，一种或一种以上V H基因、一种或一 种以上DH基因、一种或一种以上JH基因、μ恒定区和第二恒定区（优选为Y恒定区）形 成为用于插入动物体内的构造。这种方法描述于以下专利中：Surani等人的美国专利第 5, 545, 807号和每一专利都属于Lonberg和Kay的美国专利第5, 545, 806号、第5, 625, 825 号、第 5, 625,126 号、第 5, 633, 425 号、第 5, 661,016 号、第 5, 770, 429 号、第 5, 789, 650 号、 第 5, 814, 318 号、第 5, 877, 397 号、第 5, 874, 299 号和第 6, 255, 458 号，Krimpenfort 和 Berns的美国专利第5, 591，669号和第6, 023. 010号，Berns等人的美国专利第5, 612, 205 号、第5, 721，367号和5, 789, 215号，及Choi和Dunnand的美国专利第5, 643, 763号，以及 GenPharm International美国专利申请案第07/574, 748号，申请于1990年8月29日、第 07/575, 962号，申请于1990年8月31日、第07/810, 279号，申请于1991年12月17日、第 07/853, 408号，申请于1992年3月18日、第07/904, 068号，申请于1992年6月23日、第 07/990, 860号，申请于1992年12月16日、第08/053,131号，申请于1993年4月26日、第 08/096, 762号，申请于1993年7月22日、第08/155, 301号，申请于1993年11月18日、第 08/161，739号，申请于1993年12月3日、第08/165, 699号，申请于1993年12月10日、第 08/209, 741号，申请于1994年3月9日。也可见欧洲专利第0546073B1号，国际专利申请案 W092/03918、TO92/22645、TO92/22647、TO92/22670、TO93/12227、TO94/00569、TO94/25585、 W096/14436、W097/13852 和 W098/24884 及美国专利第 5, 981，175 号。进一步见 Taylor 等 人，1992年；Chen等人，1993年；Tuaillon等人，1993年；Choi 等人，1993年；Lonberg等人， (1994) ;Taylor 等人，（1994)和 Tuaillon 等人，（1995) ;Fishwild 等人，（1996)。
[0198] Kirin也已表明自小鼠中产生人类抗体，其中已通过微细胞融合引入大片染色体 或整个染色体。见欧洲专利申请案第773288号和第843961号。Xenerex Biosciences正 在研发一种用于潜在产生人类抗体的技术。在这种技术中，以人类淋巴细胞（例如，B和/ 或T细胞）重新构成SCID小鼠。小鼠随后经抗原免疫，且可产生对抗抗原的免疫反应。见 美国专利第5, 476, 996号、第5, 698, 767号和第5, 958, 765号。
[0199] 人类抗-小鼠抗体（HAMA)反应已将工业生产导向制备嵌合或其它人源化抗体。尽 管嵌合抗体具有人类恒定区和鼠科可变区，仍希望可观察到某些人类抗-嵌合抗体（HACA) 反应，尤其在抗体的慢性或多-剂量使用中。因此，为了使HAMA或HACA反应的考虑和/或 影响失效，仍希望提供对抗EGFRvIII的完整人类抗体。
[0200] 抗体治疗
[0201] 如本文所述，EGFRvIII抗体的功能似乎对其操作模式的至少一部分很重要。例如， 就功能而言，意思是EGFRvIII抗体在以EGFRvIII操作中的活性。因此，在某些方面，希望结 合作为对抗EGFRvIII的治疗候选物的抗体的产生，抗体可固定补充物并补充细胞毒性淋 巴细胞，由此参与到CDC和ADCC中。存在多种具有相同功能的抗体同位型，包括（但不限 于）以下：鼠科IgM、鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、人类IgM、人类IgGl、人类IgG3和人 类IgA。又，希望结合作为对抗EGFRvIII的治疗候选物的抗体的产生，抗体可通过Fc受体 接合于诸如自然杀手（NK)细胞的效应细胞来活化依赖抗体介导的细胞毒反应（ADCC)。存 在多种可ADCC的抗体同位型，包括（但不限于）以下：鼠科IgG2a、鼠科IgG2b、鼠科IgG3、 人类IgGl和人类IgG3。应了解，产生的抗体不必一开始就具有这种同位型，但是相反地，产 生的抗体可具有任何同位型且抗体可为随后使用此项技术中熟知的常规技术转换的同位 型。这些技术包括使用直接重组技术（例如，见美国专利第4, 816, 397号）和细胞-细胞 融合技术（例如，见美国专利第5, 916, 771号和第6, 207, 418号）。
[0202] 在细胞-细胞技术中，制备具有含有任何所需同位型的重链的骨髓瘤或其它细胞 株和另一种具有轻链的骨髓瘤或其它细胞株。随后这些细胞可经融合，且可分离表达细胞 株的完整抗体。
[0203] 例如，本文讨论的某些抗-EGFRvIII抗体为人类抗-EGFRvIII IgGl抗体。如果这 种抗体具有对EGFRvIII分子的所需结合，同位型应易于转换以产生人类IgM、人类IgG3或 人类IgGA，尽管仍具有相同的可变区（其界定了抗体的特异性及其某些亲和力）。这些分 子（包括IgGl)随后将可固定补充物并参与CDC，且如果包含IgGl或IgG3恒定区，这些分 子也将可通过补充细胞毒性淋巴细胞参与依赖抗体介导的细胞毒反应（ADCC)。
[0204] 因此，由于产生了达到上文所述所需"结构"属性的抗体候选物，因此，其通常通过 同位型转换可具有至少某些所需"功能"属性。其它治疗的设计和产生
[0205] 基于本文中关于EGFRvIII产生和表征的抗体活性，促进了除抗体部分之外的其 它治疗形态的设计。
[0206] 这些形态包括（但不限于）高级抗体疗法（诸如双特异性抗体、免疫毒素和放射 性同位素标记的疗法）、肽疗法的产生、基因疗法，尤其为内抗体、抗致敏疗法和小分子。
[0207] 例如，结合高级抗体疗法的产生，其中补充物固定和细胞毒性淋巴细胞的补充为 理想属性，可能通过使用双特异性、免疫毒素或放射性同位素标记来增强细胞杀死。
[0208] 例如，结合双特异性抗体，可产生包含以下的双特异性抗体：（i)两种抗体，一种 具有对EGFRvIII的特异性且另一种具有对结合在一起的第二种分子的特异性；（ii) 一 条链对EGFRvIII具有特异性且第二条链对第二种分子具有特异性的单抗体；或（iii)对 于EGFRvIII和另一种分子具有特异性的单链抗体。这些双特异性抗体可使用熟知技术产 生，例如，结合（i)和（ii)，例如见 Immunol Methods4 :72-81 (1994)和上述的 Wright and Harris，及结合（iii)，例如见 Traunecker 等人，Int.J. Cancer(Suppl. )7 :51-52(1992)。 在每一种情况下，第二种特异性可赋予Fc链活化受体，包括（但不限于）CD16或CD64 (例 如见，Deo 等人，18 :127 (1997) )、CD3 (Micromet ' s BiTE 技术）或 CD89 (例如见，Valerius 等人，Bl〇〇d90 :4485-4492(1997))。根据前述制备的双特异性抗体可能杀死表达EGFRVIII 的细胞，且尤其是其中本发明的EGFRvIII抗体有效的那些细胞。
[0209] 结合免疫毒素，抗体可使用此项技术中熟知的技术改质而作为免疫毒素。
[0210] 例如见 Vitetta Immunol Todayl4 :252(1993)。也例如见美国专利第 5,194, 594 号。结合制备放射性同位素标记的抗体，这些经改质抗体也可易于使用此项技术中熟知 的技术来制备。例如见 Junghans 等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy655_686 中 (第 2 版，Chafner and Longo 编，Lippincott Raven (1996))。也见美国专利第 4, 681，581 号、第 4, 735, 210 号、第 5,101,827 号、第 5,102, 990 号（RE35, 500)、第 5, 648, 471 号和第 5, 697, 902号。每一种免疫毒素和放射性同位素标记的分子都可能杀死表达EGFRvIII的细 胞，且尤其是其中本文所述抗体有效的那些细胞。
[0211] 可设计抗体更快速结合，或更慢自表位离解，且因此可将抗体本身设计为治疗剂。 例如，抗体的经改变特征可用于对患者投予治疗剂。治疗免疫偶联物
[0212] 如所了解的，与药物、毒素或其它分子（免疫偶联物或免疫毒素）结合的抗体在定 靶杀死表达可通过特异性结合分子（诸如抗体）特异性结合的分子的细胞中极为有用。如 上文所述，尚未已知在任何正常组织上表达过EGFRvIII。此外，EGFRvIII显示显著表达于 多种人类肿瘤中。因此，EGFRvIII是用于以免疫毒素定靶的最受瞩目的分子。
[0213] 已出现许多关于试图特异性定靶具有单克隆抗体-药物偶联物的肿瘤细胞的报 导（Sela 等人，Immunoconjugatesl89_216 中（C. Vogel，ed. 1987) ;Ghose 等人，Targeted Drugsl-22 中（E. Goldberg 编，1983 年）；Diener 等人，Antibody Mediated Delivery Systemsl-23 中（J. Rodwell 编，1988 年）；Pietersz 等人，Antibody Mediated Delivery Systems25_53 中（J.Rodwell 编，1988 年）；Bumol 等人，Antibody Mediated Delivery Systems55-79中（J. Rodwell编，1988年））。细胞毒素药物，诸如氨甲喋呤、柔红霉素、 阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑（melphalan)、丝裂霉素 C和苯丁酸氮芥已与多种鼠 科单克隆看体结合。在某些情况下，通过中间体载剂分子将药物分子连接至抗体分子， 这些中间体载剂分子诸如血白蛋白（Garnett等人，Cancer Res. 46:2407-2412(1986); Ohkawa 等人，Cancer Immumol. Tmmunother. 23 :81-86 (1986) ;Endo 等人，Cancer Res. 47 : 1076-1080 (1980))、右旋糖酐（Hurwitz 等人，Appl.Biochem. 2 :25-35(1980) ;Manabi 等人， Biochem. Pharmacol. 34 :289-291 (1985) ;Dillman等人，Cancer Res. 46 :4886-4891 (1986); Shoval 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :8276-8280 (1988))或多聚谷氨酸（Tsukada 等人， J. Natl. Cane. Inst. 73 :721-729 (1984) ;Kato 等人，J. Med. Chem. 27 :1602-1607 (1984); Tsukada 等人，Br. J. Cancer52 :111-116 (1985))。
[0214] 已采用多种连接子技术以用于制备这些免疫偶联物，且已研究了可离解和不可离 解连接子。然而，在大部分情况下，如果药物分子可从在定靶位点为非改质形式的偶联物释 放出来，就只能观察到药物的完全细胞毒性潜能。
[0215] 已用于制备抗体-药物偶联物的可离解连接子之一为基于顺-丙烯三羧酸的 酸-不稳定连接子，其利用不同细胞内间隔的酸性环境，诸如在受体调节的内吞作用中遇 到的内体和溶酶体。Shen和Ryser引入这种方法来制备柔红霉素与大分子载剂的偶联物 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102 :1048-1054 (1981))。Yang 和 Reisfeld 使用相同技 术将柔红霉素偶联至抗-黑素瘤抗体（J. Natl. Cane. Inst. 80:1154-1159(1988))。近来， Dillman等人也使用酸不稳定连接子以类似方式制备柔红霉素与抗-T细胞抗体的偶联物 (Cancer Res. 48 :6097-6102 (1988))。
[0216] 由Trouet等人研究的另一种方法涉及将柔红霉素经肽空间臂连接至抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. 79 :626-629 (1982))。这是在通过溶菌酶肽酶的作用无药物从这种偶联物 中释放出来的前提下进行的。
[0217] 然而，在活体外细胞毒性测试中已揭示，抗体-药物偶联物很少达到与自由非 偶联药物相同的细胞毒性效能。这表明，药物分子从抗体释放出来的机理效率很差。在 免疫毒素的范围内，经单克隆抗体与催化活性蛋白质毒素之间的双硫桥形成的偶联物 显示比含有其它连接子的偶联物更具细胞毒性。见，Lambert等人，J. Biol. Chem. 260 : 12〇35_12〇41 (l985) ;Lambert 等人，Immunotoxinsl75_2〇9 中（A. Frankel 编，I988); Ghetie等人，Cancer Res. 48 :2610-2617(1988)。这归因于对抗体分子与毒素之间的双硫 键的有效离解有利的谷胱甘肽的高细胞内浓度。尽管如此，仅有少量关于使用双硫桥制 备药物和大分子之间的偶联物的报导实例。Shen等人描述了氨甲喋呤转化为巯乙基酰胺 衍生物，继而经双硫键与聚-D-赖氨酸偶联（J. Biol. Chem. 260 :10905-10908 (1985))。此 夕卜，一报导描述了含三硫化物的毒素药物刺孢霉素与抗体的偶联物的制备（Menendez等 Α? Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract81 (1989))。另一报导描述了含三硫化物的毒素药物刺孢霉素 与抗体的偶联物的制备（Hinman 等人，53Cancer Res. 3336-3342(1993))。
[0218] 缺少二硫化物连接的抗体-药物偶联物的一个原因是带有含有可易于用于将药 物经二硫化物桥连接至抗体的部分的硫原子的细胞毒素药物的不可利用性。此外，现存药 物在其细胞毒性潜能不减少的情况下，其难于进行化学改质。
[0219] 现存抗体-药物偶联物的另一主要不足在于因为有限数目的定靶抗原及静止癌 药物（如氨甲喋呤、柔红霉素和长春新碱）的相对适度细胞毒性，其不能将足够浓度的药物 传递到定靶位点。为了达到显著的细胞毒性，有必要将大量的药物分子直接或通过聚合载 剂分子连接至抗体。然而，这些高度改质的抗体通常展示出对于定靶抗原削弱的结合且快 速从血流中活体内清除。
[0220] Maytansinoid为高度细胞毒素药物。美登素首先由Kupchan等人自东非灌木齿 叶美登木中分离，且其显示比常规癌症化学治疗剂（如氨甲喋呤、柔红霉素和长春新碱） 大100到1000倍的细胞毒性（美国专利第3, 896, 111号）。后来发现某些微生物也产生 maytansinoid，诸如异戊酸美登素酯和异戊酸美登素酯的C-3酯（美国专利第4,151，042 号）。也已报导异戊酸美登素酯的合成C-3酯和异戊酸美登素酯的类似物（Kupchan等人， J. Med. Chem. 21 :31-37(1978) ;Higashide 等人，Nature270 :721-722(1977) ;Kawai 等人， Chem. Pharm. Bull. 32 :3441-3451 (1984))。C-3酯由其制备的异戊酸美登素酯的类似物的 实例包括芳族环上（例如，脱氯）或在C-9、C-14(例如，羟基化甲基）、C-15、C-18、C-20和 C-4, 5处经改质的异戊酸美登素酯。
[0221] 天然发生和合成C-3酯可分为两个群组：
[0222] (a)具有简单羧酸的C-3酯（美国专利第4,248,870号、第4,265,814号、第 4,308,268 号、第 4,308,269 号、第 4,309,428 号、第 4,317,821 号、第 4,322,348 号和第 4, 331，598 号）和
[0223] (b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯（美国专利第4,137, 230号、第 4, 260, 608 号、第 5, 208, 020 号和 Chem. Pharm. Bull. 12 :3441 (1984))。
[0224] 发现群组（b)的酯的细胞毒性比群组（a)的酯的细胞毒性大得多。
[0225] 美登素为有丝分裂抑制剂。已报导以美登素活体内处理L1210细胞导致67%的细 胞聚集于有丝分裂中。已报导未经处理的比对细胞显示3. 2%至5. 8%之间的有丝分裂指 数（Sieber 等人，^Comparative Leukemia Researchl975, Bibl. Haemat. 495_5〇0(1976))。 海胆卵和蛤蜊卵的实验已表明，美登素通过抑制微管蛋白质（微管蛋白）的聚合干扰微管 形成来抑制有丝分裂（Remillard 等人，Sciencel89 :1002-1005(1975))。
[0226] 活体外，已发现以K^toKTyg/l·! 1剂量的美登素即可抑制P388、L1210和 LY5178鼠科白血病细胞悬浮液，其中P388细胞株最敏感。也已显示美登素是人类鼻 咽癌细胞活体外生长的活性抑制剂，且报导人类急性淋巴母细胞白血病细胞株CEM可 由低至 lCT7mg/ml 的浓度抑制（Wolpert-DeFillippes 等人，Biochem. Pharmacol. 24 : 1735-1738(1975))。
[0227] 活体内，美登素也显示具有活性。显示在50至100倍剂量范围内抑制P388淋 巴母细胞白血病系统的肿瘤生长，这表明具有高治疗指数；L1210小鼠白血病系统、人类 Lewis肺癌系统和人类B-16黑素癌系统也显示显著抑制活性（Kupchan，Ped. Proc. 33 : 2288-2295(1974))。
[0228] 目前偶联maytansinoids和细胞结合剂（诸如抗体）的方法包括两个反应步 骤。首先将细胞结合剂（例如抗体）以交联试剂（诸如N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫 代丙酸酯（SFOP))改质以将二硫代批陡基引入抗体（Carlsson等人，Biochem. J. 173 : 723-737(1978);美国专利第5,208, 020号）。在第二个步骤中，将具有硫醇基的反应性 maytansinoid(诸如DM1 (形式上称为N2/ -去乙醜基-N2 -(3-疏基氧代丙基））-美 登素）作为起始试剂添加至经改质抗体中，导致改质抗体中硫代吡啶基的置换，及由二硫 化物连接的细胞毒性maytansinoid/抗体偶联物的产生（美国专利第5, 208, 020号）。在 美国专利第6, 441，163号中描述用于偶联maytansinoids的一步骤工艺。
[0229] 由 ImmUnogen Corporation (Cambridge，MA)可获得基于 Maytansinoid 的免 疫毒素技术。另一种重要的毒素技术是基于auristatin毒素。Auristatins衍生自 由印度洋海的海兔获得的海兔毒素 DolastatinlO,作为有效的细胞生长抑制物质。见 美国专利第4, 816, 444号和第4, 978, 744号。关于其它的海兔毒素，也见美国专利第 4, 414, 205 号（Dolastatin-l、2 和 3)、第 5, 076, 973 号（Dolastatin-3)、第 4, 486, 414 号 (Dolastatin-A 和 B)、第 4, 986, 988 号（Dolastatin-13)、第 5,138, 036 号（Dolastatin-14) 和第4, 879, 278号（dolastatin-15)。由Dr. Pettit和亚利桑那州大学的同事分离和合 成的各种auristatine衍生物已经测试且显示出对细胞的高度毒性。见Pettit等人，抗 肿瘤剂 337。海兔毒素 10 结构改质的合成。Anticancer Drug Des. 10 (7) :529-44 (1995)， Woyke等人。有效海兔毒素10结构改质auristatin PHE的细胞外活性和后抗真菌作用。 Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 :3580-3584(2001)，Pettit 等人。海兔毒素 10 和肽衍生物对抗新生隐球菌的特异性活性。Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 : 2961-2965(1998)，Woyke。新生隐球菌细胞周期期间微管的三维显影和auristatin PHE对 微管整体性和核位置的影响。Submitted，Antimicrobial Agents and Chemotherapy。
[0230] 近来，已研发在作为有效负载在抗体上传递时似乎相当有效的其它auristatin 衍生物。例如，已显示单甲基auristatin E(MMAE)在与肿瘤特异性抗体偶联时作为对 于肿瘤细胞的有效毒素 。Doronina 等人，Development ofpotent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)(在线可 得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE, an anti-CD30_monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity.Blood. (2003)May8[E 印 刷 前公 开].Epub2003Apr24(在线可得）。除auristatin分子的毒性之外，研究已显示经肽连接 的偶联物更稳定，且因此在缓冲剂和血浆中比其它连接子技术对正常组织的特异性更大 且毒性更小° Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003)(在线可得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE, an anti-CD30_monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May8[E 印刷前公开]·' Epub2003Apr24(在 线可得）。
[0231] 这些连接子基于支链肽设计且包括例如mAb-缴氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb-苯 丙氨酸 _ 赖氨酸 _MMAE 偶联物。Doronina 等人，Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (在线可得）；Francisco 等人，cAClO-vcMMAE，an anti-CD3〇-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003)May8[E 印 刷前公开]EpUb2003Apr24(在线可得）。这些设计和偶联技术由以下所述，例如 King 等人的 Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers ：inhibition of aggregation by rnethoxytriethyleneglycol chains. J Med Chem. 45(19) :4336-43(2002)和 Dubowchik 等人的 CathepsinB-sensitive dipeptide prodrugs. 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol),mitomycin C and doxorubicin. Bioorg Med Chem Lett. 8 (23) :3347-52 (1998)。基于前述的 Auristatin E-基 免疫毒素技术由 Seattle Genetics Corporation (Seattle，WA)可得。
[0232] 存在大量由自然源萃取物及半合成和合成类似物获得的影响微管的新颖化合 物，其似乎具有作为用于产生免疫偶联物的毒素的潜能。（见newmedinc.com网站）。这 些分子及使用这些分子的药物实例包括以下：秋水仙碱-位点结合剂（Curacin)、风车子 素（AVE806,风车子素 A-4 前药（CA4P)，0xi-4503)、隐藻素（LY355703)、Discodermolide、 Dolastatin 和 Analogs(Auristatin PHE、 DolastatinlO、 ILX-651、 Symplostatinl、 TZT-1027)、埃博霉素（BMS-247550、BMS-310705、EP0906、K0S-862、ΖΚ-ΕΡ0)、榴塞洛素 (Eleutherobin)、FR182877、Halichondrin B(E7389)、月苄三甲氯铵（Halimide) (NPI-2352 和 NPI-2358)、Hemiasterlins (HTI-286)、Laulimalide、Maytansinoids ( " DM1 ") (Bivamzumab 美登素 、Cantuzumab 美登素、huN901-DMl/BB-10901TAP、MLN591DMl、 My9_6_DMl、曲妥珠单抗（Trastuzumab)-DMl)、PC-SPES、Peloruside A、白藜芦醇 (Resveratrol)、S-烯丙基巯基半胱氨酸（SAMC)、海绵素（Spongistatin)、维提岛酰胺 (Vitilevuamide)、分子发动机-驱动蛋白（Molecular Motor-Kinesins) (SB-715992)、设 计的秋水仙碱-位点结合剂（A-289099, A-293620/A-318315, ABT-751/E7010, D-24851/ D-64131，ZD6126)、其它新颖纺锤体毒素（2-甲氧雌二醇（2-ME2)，苯并咪唑氨基甲酸酯 (ANG600 系列，甲苯咪唑），CP248/CP461，HMN-214, R440, SDX-103, T67/T607)。此外，在 1998 年的 Mayer, A. M. S. Marine Pharmacology :Antitumor and Cytotoxic Compounds. The Pharmacologist. 41(4) :159-164(1999)中评论了其它的鼠科衍生毒素。
[0233] 治疗投予和配方
[0234] 延长的作用时间可以通过交替的非经肠途径（诸如，静脉内、皮下或肌肉内注射） 使得给料进程较不频繁且更为便利。
[0235] 当用于活体内投予时，本文所述的抗体配方应该是无菌的。例如，这可易于通过在 冻干和重组之前或之后经无菌过滤膜过滤来实现。抗体通常以冻干形式储存或储存在溶液 中。治疗抗体组合物通常放置在具有无菌存取入口的容器中，例如，具有可回收配方的接合 器（诸如皮下注射针可穿过的塞子）的静脉内溶液袋或小瓶。
[0236] 抗体投予的路径是根据已知方法，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、 动脉内、鞘内、吸入或病灶内途径，或通过如下文所述的缓释系统注射或灌输。抗体优选通 过灌输或通过大丸剂注射连续投予。
[0237] 治疗学上采用的抗体的有效量取决于（例如）治疗对象，投药途径和患者的病况。 因此，对于治疗学家而言，优选视需要滴定剂量并改良投药路径以获得最优的治疗效果。理 论上，临床医师将投予抗体，直到达到理想效果的剂量。这种疗法的进程易于通过常规的检 定或通过本文所述的检定来控制。
[0238] 如本文所述的抗体可在含有医药学上可接受的载剂的混合物中制备。治疗组合物 可优选以液体或粉末气溶胶（经冻干）的形式经静脉内或经鼻或肺投予。组合物也可以视 需要非经肠或经皮下投予。当进行全身性投予时，治疗组合物应该是无菌，无热源且在非经 肠可接受的具有应有pH值、等渗性和稳定性的溶液中。这些条件为所属领域的技术人员所 已知。简而言之，通过将具有所需纯度的化合物与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂 混合来制备化合物剂量配方以供储存和投予。这些材料在所采用的剂量和浓度时对于接 受者是无毒性的，且其包括缓冲剂，诸如TRIS HC1、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸 盐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量（小于约十个残基）肽，诸如聚精氨酸；蛋白质，诸 如血白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨 酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡 萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA ;糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子，诸如 钠和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENPLURONICS或聚乙二醇。
[0239] 用于注射的无菌组合物可根据Remingtor^ s Pharmaceutical Sciences (第18 版，Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)中所述的常规医药实践来调配。例如，可 能需要活性化合物在诸如水或天然发生的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油的媒介物，或 如油酸乙酯或其类似物的合成脂肪媒介物中的溶解液或悬浮液。可根据可接受的医药实践 并入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂及其类似物。
[0240] 缓释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质 为成形物件、膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶（例如，由Langer等人 的 J. Biomed Mater. Res.，（1981) 15 :167-277 和 Langer 的 Chem. Tech.，（1982) 12 :98-105 所述的聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美国专利第3, 773, 919 号、EP58, 481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物（Sidman等人的Biopolymers， (1983) 22 :547-556)、非降解伸乙基-乙酸乙烯酯（Langer等人，上述）、降解乳酸-乙醇酸 共聚物，诸如LUPR0N DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球 体）和聚-D-(-)-3-羟基丁酸（EP133, 988)。
[0241] 尽管诸如伸乙基-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得可释放分子100天， 但某些水凝胶仍持续较短时间释放蛋白质。当包胶蛋白质在体内长时间保留时，它们可能 因为暴露于37°C的湿气下而变性或聚集，导致生物活性的丧失且可能改变免疫原性。可根 据所涉及的机理设计合理的策略以供稳定蛋白质。例如，如果发现聚集机理为经二硫化物 互换形成分子间S-S键，就可以通过改质硫氢基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿气含量、 使用合适的添加剂和研发特异性聚合物基质组合物来达到稳定。
[0242] 缓释组合物也包括悬浮于可将晶体保持在悬浮液中的合适配方中抗体晶体的制 齐U。当通过皮下或腹膜内注射时，这些制剂可产生缓释效应。其它组合物也包括脂质体 截留的抗体。含有这些抗体的脂质体由本身已知的方法来制备：美国专利第DE3, 218,121 号、Epstein 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82 :3688_3692、Hwang 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（1980) 77 :4030-4034、EP52, 322、EP36, 676、EP88, 046、EP143, 949、 142, 641、日本专利申请案第83-118008号、美国专利第4, 485, 045号和第4, 544, 545号及 EP102, 324。
[0243] 用于给定患者的抗体配方的剂量可由主治医师结合考虑已知的各种因素来测定 以改质药物的作用，包括疾病的严重程度和类型、体重、性别、饮食、投药时间和路径、其它 药剂和其它相关临床因素。治疗有效剂量可通过活体外或活体外方法来测定。
[0244] 治疗学上采用的抗体的有效量取决于（例如）治疗对象，投药途径和患者的病况。 因此，治疗学家优选视需要滴定剂量并改良投药路径以获得最优的治疗效果。根据上文提 及的因素，一般的日剂量可在约〇.〇〇lmg/kg到多至100mg/kg或更多之间。理论上，临床医 师将投予治疗抗体，直到达到理想效果的剂量。这种疗法的进程易于通过常规的检定或如 本文所述来控制。
[0245] 应了解，根据本文的组合物和方法进行的治疗实体的投予应与并入配方中的合 适载剂、赋形剂及其它试剂一起投予，以提供经改良的转移、传递、耐受性及其类似性质。 在所有药剂化学师已知的配方中可发现多种合适配方：Remington' s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Publishing Company，Easton，PA (1990))，尤其为其文中的 Block, Lawrence的第87章。例如，这些配方包括粉末、楽料、软膏、胶质物、錯、油、脂质、 含脂质（阳离子或阴离子）气泡（诸如Lipofectin?)、DNA偶联物、无水吸收浆料、水中 油和油中水乳液、乳液聚乙二醇（各种分子量的聚乙二醇）、半固凝胶和含有聚乙二醇的 半固混合物。根据本发明，任何前述混合物可适于治疗和疗法中，只要配方中的活性成分 不会被配方钝化，且所述配方生理学上相容且可容忍所述投药路径。也见BaldrickP.的 "Pharmaceutical excipient development :the need for preclinical guidance.，',Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2) :210-8(2000) ;WangW.的 "Lyophilization and development of solid protein Pharmaceuticals. "，Int.J.Pharm. 203(1-2) :1-60(2000) ;CharmanWN 的"Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts. "J Pharm Sci. 89(8) :967-78(2000) ;Powell 等人的"Compendium of excipients for parenteral formulations"，PDAJ Pharm Sci Technol. 52 :238-311 (1998)且其中引用的与配方、赋形剂 和载剂相关的额外信息已为药剂化学师所熟知。
[0246] 抗体的制各
[0247] 如本文所述，抗体可通过使用如下文所述的XenoMouse?技术来制备。所述小鼠 随后即可产生人类免疫球蛋白分子和抗体，但不足以产生鼠科免疫球蛋白分子和抗体。用 于达到相同目的的技术揭示于本文所揭示的专利、申请案和参考案中。然而，尤其为关于转 基因生产小鼠及由其产生的抗体的一个实施例揭示于申请于1996年12月3日的美国专利 申请案第08/759, 620号和1998年6月11日公开的国际专利申请案W098/24893和2000年 12 月 21 日公开的 TO00/76310 中。也见 Mendez 等人的 Nature Geneticsl5 :146-156(1997)。
[0248] 通过使用这种技术，可生产针对多种抗体的完全人类单克隆抗体。在一个实施例 中，将小鼠的XenoMouse?细胞株以令人感兴趣的抗原（例如，EGFRvIII)免疫，自表达抗 体的小鼠中回收淋巴细胞（诸如B-细胞），且将所述细胞与骨髓型细胞株融合以制备永生 化杂交瘤细胞株，且筛选并选择这些杂交瘤细胞株以识别产生对于令人感兴趣的抗原具有 特异性的抗体的杂交瘤细胞株。本文提供用于产生可产生对EGFRvIII具有特异性的抗体 的多种杂交瘤细胞株的方法。此外，本发明提供由这些细胞株产生的抗体的表征，包括这些 抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。
[0249] 或者，代替与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，根据对初始抗原（优选为EGFRvIII 蛋白质）的反应活性进一步筛选由所回收的细胞产生、自经免疫小鼠 XenoMouse?细胞 株分离的抗体。所述筛选包括以EGFRvIII蛋白质进行ELISA，活体外结合至稳定表达 全长EGFRvIII的NR6M细胞且由NR6M细胞中的抗体内在化EGFRvIII受体。随后使用 EGFRvIII-特异性溶血性平板检定分离分泌令人感兴趣的抗体的单B细胞（Babcook等 人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，i93 :7843-7848 (1996))。定靶用于溶菌的细胞优选为以 EGFRvIII抗原涂敷的绵羊红细胞（SRBC)。在分泌令人感兴趣的免疫球蛋白的B细胞培养 基和补充物的存在下，平板的形成表明靶细胞的特异性EGFRvIII介导溶菌作用。可分离 平板中心处的单抗原-特异性血浆细胞，且编码抗体特异性的遗传信息可自单血浆细胞分 离。使用反转录酶PCR可克隆编码所分泌抗体的可变区的DNA。所述经克隆DNA随后可进 一步插入合适表达载体中，优选为载体盒，诸如pcDNA，更优为含有免疫球蛋白重链和轻链 的恒定结构域的pcDNA载体。随后，所产生的载体可转染为宿主细胞，优选为CH0细胞，且 培养于经合适改质的常规营养培养基中以供诱发启动子、选择转化体或放大编码基因的所 需序列。本文中描述产生对EGFRvIII具有特异性的抗体的多个单血浆细胞的分离。此外， 将编码抗-EGFRvIII抗体特异性的遗传物质分离、引入随后转染为宿主细胞的合适表达载 体中。
[0250] 来自XenoMouse小鼠的B细胞也可用作遗传物质的来源，自其可产生抗体展示文 库。所述文库可使用所述领域的一般技术经由核糖体展示在噬菌体、酵母或活体外制得。经 超免疫的XenoMouse小鼠可作为一种丰富来源，自其可分离具有高亲和力的抗原-反应性 抗体。因此，经对抗EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用于产生抗体展示文库，自其可 分离对抗EGFRvIII的高亲和力抗体。所述库可针对p印3寡肽进行筛选，且所得衍生抗体 针对表达EGFRvIII的细胞进行筛选以确定对于自然展示抗原的特异性。完全IgG抗体随 后可使用重组DNA技术来表达。例如见W099/53049。
[0251] -般而言，由上述细胞株产生的抗体具有完全人类IgGl或IgG2重链和人类κ轻 链。在一个实施例中，抗体具有高亲和力，当通过固相和溶液相测量时，其一般具有约i〇_ 9m 至约10_13M的Kd值。在其它实施例中，抗体具有较低的亲和力，自约10_6M至约10_ 8M。
[0252] 如所属领域的技术人员所了解的，根据本实施例的抗体可在除杂交瘤细胞株之外 的细胞株中表达。编码特定抗体的序列可用于合适哺乳动物宿主细胞的转型。可通过任何 已知方法进行转型以将多聚核苷酸引入宿主细胞，例如包括将多聚核苷酸封装于病毒（或 病毒载体）中且以病毒（或载体）或通过此项技术中已知的转染程序转换宿主细胞，如由 美国专利第4, 399, 216号、第4, 912, 040号、第4, 740, 461号和第4, 959, 455号中所例示。 所使用的转型程序取决于待转型的宿主。此项技术中已熟知将异种多聚核苷酸引入哺乳动 物细胞中的方法，且其包括右旋糖酐调节转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺调节转染、原生质体融 合、电击、多聚核苷酸封装于脂质体中和DNA直接微注射于胞核中。
[0253] 此项技术中已熟知可用作供表达宿主的哺乳动物细胞株，且其包括由多种由美国 菌种保藏中心（American Type Culture Collection(ATCC))获得的永生化细胞株，包括（但 不限于）中国仓鼠卵巢细胞（CH0)、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞（BHK)、猴肾脏细胞（C0S)、肝 细胞癌细胞（例如，Hep G2)和许多其它细胞株。通过测定哪些细胞株具有高表达水平且产 生具有组成型EGFRvIII结合特性的抗体来选择尤其较优的细胞株。
[0254] 实魁
[0255] 提供以下实例，包括进行的实验和得到的结果仅为了达到说明的目的而并不解释 为对本发明的限制。
[0256] 最初产生EGFRvIII-特异抗体的策略涉及用复合抗原（肽、多种可溶性蛋白质和 抗原表达细胞）免疫XenoMouse小鼠，随后通过融合产生杂种细胞或通过XenoMaWSLAM? 技术分离B细胞而分离抗体产生细胞。抗体产生细胞通过ELISA为特异性而呈递到一级筛 选，通过FMAT和/或FACS为细胞表面结合而呈递到二级筛选。随后进行内在化检定以识 别可能对药物输送有用的抗体。测量这些抗体的亲和力。选择特定抗体进行表位定位。此 夕卜，选择特定抗体进行体内及体外测试以分析这些抗体对治疗癌症的功效。
[0257] 实例1'抗原制备
[0258] A. EGFRvIII PEP3-KLH 抗原制各
[0259] 连同实例 2，14-mer 人 EGFRvIII PEP3(LEEKKGNYVVTDHC(SEQ IDN0 :56)) 肽通过R & D系统常规合成。随后TOP3肽与匙孔血蓝蛋白（KLH)结合，如下：EGFRvIII PEP3(200mcg) (R & D)与 50mcg 的匙孔血蓝蛋白（KLH ;Pierce，Rockford, IL)混合并用蒸 馏水定容到165mcl。加入250mcl结合缓冲液（0. 1M MES，0. 9M NaCl，pH4. 7)并通过加入 251^1的1〇11^/1111的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亚氨氢氯化物的储存液伍0(：， Pierce，Rockford，IL)使EGFRvIII PEP3和KLH交联。在室温下培养结合2小时，使用pH7. 4 的PBS通过lkDa滤膜（离心滤膜，Millipore，Bedford, ΜΑ)将未反应的EDC离心除去。
[0260] 连同实例 3，14-mer 人 EGFRvIII PEP3(LEEKKGNYVVTDHC(SEQ IDN0 :56)) 肽通过R & D系统常规合成。随后PEP3肽与KLH结合，如下：EGFRvIII PEP3 (200mcg)与 50mcg的匙孔血蓝蛋白（KLH;Pierce，Rockford，IL)混合并用蒸馈水定容到165mcl。加入 250mcl 结合缓冲液（0· 1M MES，0. 9M NaCl，ρΗ4· 7)并通过加入 25mcl 的 10mg/ml 的 1-乙 基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二酰亚氨氢氯化物的储存液（EDC，Pierce，Rockford，IL)使 EGFRvIII PEP3和KLH交联。在室温下培养结合2小时，使用pH7. 4的PBS通过lkDa滤膜 (离心滤膜，Millipore，Bedford, MA)将未反应的EDC离心除去。
[0261] B. B300. 19/EGFRvIII 转染子
[0262] 为了制备B300. 19/EGFRvIII转染子，从A431细胞初始克隆出野生型EGFR，且用于 编码EGFRvIII的EGFR基因被更改从而缺失编码残基6-273的密码子，而在缺失的连接处 产生编码甘氨酸残基的密码子。该缺失发生在缺失GTT (缬氨酸）和CGT (精氨酸）周围的 密码子内，而得到的缺失后密码子为GGT (甘氨酸）。（Wikstrand et al. J Neurovirol. 4 (2): 148-58(1998))
[0263] 1.野生型EGFR构建的克隆：
[0264] 使用 Micro-fast RNA 试剂盒（Invitrogen，Burlington，ON)从 A431 (ATCC)中提 取聚 A+mRNA。用随机 pdN6 引物和 M-MuLV 逆转录酶（NEB，New England Biolabs，Beverly， Mass.)从polyA+mRNA合成总cDNA。用下列引物由A431cDNA扩增2. 3kb的PCR产物：
[0265] 正义 5，-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3，；（SEQIDN0:62)
[0266] 反义 5，-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3，（SEQIDN0:63)
[0267] 使用PfuDNA聚合酶。
[0268] 将PCR产物用Xhol消化，凝胶纯化，并连接到被Xhol线型化的质粒pWBFNP (见国 际专利申请案第W099/45031号）中，以产生质粒Wt-EGFR/pWBFNP。
[0269] 2. EGFRvIII 构建的产生：
[0270] 用引物对 C13659/C29538 和 C29539/C14288 (BioSource International)由质粒 Wt-EGFR/pWBFNP扩增出PCR产物，其中C29538和C29539被T4多核苷酸激酶（NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)憐酸化：
[0271] C13659 :5，-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3，（正义）（SEQ ID NO : 64)
[0272] C29538 :5' -CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3,(反义）（SEQ ID NO :65);
[0273] C29539 :5' -GTAATTATGTGGTGACAGATC-3'(正义）（SEQ ID NO :66);
[0274] C14288 :5，-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3，（反义）（SEQ ID NO : 67)。
[0275] 被连接以在编码EGFR细胞外结构域的6至273氨基酸的序列中引入缺失，并亚克 隆到表达载体PWBDHFR2中（见国际专利申请案第W099/45031号）。
[0276] 用引物对 C13659/C29538 由 Wt-EGFR/pWBFNP 模板用 Pfu 聚合酶（NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)扩增产生代表缺失的Y端的232bp的片段。用EcoRl(NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化并凝胶纯化 PCR 产物。用引物对 C29539/C14288 从Wt-EGFR/pWBFNP产生代表缺失的3'端的1273bp的片段，且用Pfu聚合酶扩增模板。用 Xhol (NEB，New England Biolabs，Beverly，Mass.)消化 PCR 产物。用 T4DNA 连接酶（NEB， New England Biolabs，Beverly，Mass.)将片段连接到用 EcoRl/Xhol 消化的 pWBDHFR2 以产 生构建 EGFRvIII/pWBDHFR。
[0277] EGFR的细胞内结构域被引入下列获得的构建中：从质粒Wt-EGFR/pWBFNP中分离 出1566bp的片段并连接到用Dralll/Xhol消化的EGFRvIII/pWBDHFR以产生EGFRvIII-FL/ pffBDHFR〇
[0278] 3.用 EGFRvIII-FL/oTODHFR 转染 Β300. 19 细朐：
[0279] B300. 19细胞（8xl06)被用于每700μ 1 DMEM/III介质中的转染。加入 20 μ g EGFRvIII-FL/pWBDHFR 和 2 μ g CMV-Puro 质粒 DNA。用 Bio-Rad Gene Pulser 在 300volts/960uF下将细胞电击。电击后，在冰上冷却细胞10分钟，随后加入10非选择性介 质（DMEM/HI葡萄糖，10 % FBS，50 μ Μ BME，2mM L-谷氨酰胺，100单位青霉素-G/mi，100单 位MCG链霉素/ml)。在37°C、7. 5% C02下培养细胞48小时。
[0280] 培养后，将细胞分裂于选择性介质（DMEM/HI葡萄糖，10% FBS，2mM L-谷氨酰胺， 50 μ Μ BME，100单位青霉素-G/ml，100单位MCG链霉素/ml，2ug/ml嘌呤霉素）中，在96 孔板中以2xl0 4、0. 4xl04'和0. 08xl04细胞/孔的浓度，在选择性介质中被选择14天以 产生稳定的克隆。将Puro抗性克隆用E752mAb (抗-EGFR抗体，在Yang等人，Crit Rev Oncol Hematol·，38(1) :17-23(2001)中有所描述）和山羊抗人IgG PE染色，随后在FACS Vantage (Becton Dickinson)上分析。
[0281] C.构律 EGFRvIII-RbFc 表汰构律
[0282] 为产生EGFRvIII兔融合蛋白，我们首先构建含有编码兔Fc的DNA的载体。这与 编码EGFRvIII的DNA连接。下面将详细描述此方法：
[0283] 1. RbFc/pcDNA3. lHygro 的构建：
[0284] (下列）引物1322/867用于扩增编码兔IgG的Hinge-CH2-CH3结构域的721bp的 片段。
[0285] #1322(正义）：5，-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3，（SEQ ID NO :68)
[0286] #867(反义）：5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3，（SEQ ID NO : 69)
[0287] 将得到的PCR产物用ΚρηΙ和Notl消化，凝胶纯化并连接到用KpnI/Notl消化的 pcDNA3. 1 (+)/Hygro(Invitrogen，Burlington，0N)，以产生质粒 RbFc/pcDNA3. lHygro。
[0288] 2. EGFRvIII_RbFc/pCEP4 的构建：
[0289] (下列）引物1290/1293用于用Pfu聚合酶扩增自EGFRvIII-FL/pWBDHFR质粒模 板的1165bp的产物。
[0290] #1290(正义）：5，-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3，（SEQ ID NO :70)
[0291] #1293(反义）：5' -CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3' (SEQ ID NO :71)
[0292] 将PCR产物用Nhel和ΚρηΙ消化，凝胶纯化并连接到用Nhel/Kpnl消化的RbFc/ pcDNA3. 1 以产生质粒 EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro。
[0293] 2170bp 的 SnaBI/XhoI 片段被从 EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro 中分离出来 并亚克隆入SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen，Burlington, ON)中，以产生质粒 EGFRvIII-RbFc/pCEP4。
[0294] 3.产生 293F EGFRvIII-RbFc 稳定细胞系：
[0295] 用如下方法将质粒EGFRvIH-RbFc/pCEP4通过磷酸钙转染引入293F细胞（Gibco， Grand Island，NY):转染前一天，1x106293F细胞被平板接种到明胶覆盖的100mm组织培养 基培养皿中，并在5%C02、37°C下培养。转染前，用10ml新鲜非选择性介质（DMEM/F12，10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素 G，100U/ml MCG链霉素）培养细胞2-3小时。在微离 心管中制备转染试剂，如下：1〇μ g的DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)与62μ 1的2M磷酸钙混 合，并用去离子水定容到500 μ 1。用另一移液管吸取500ul的2XHBS用于转移所述转染试 剂。
[0296] 逐滴将移液管中的溶液加入细胞，同时为保持合适的pH值，将细胞置于5% 0)2培 养箱中直至进行转染。转染后15-20小时，用PBS洗涤细胞并用10ml新鲜293F非选择性 介质喂养细胞。用胰蛋白酶48-72后转染收获表达的细胞，并将细胞以0. 08xl04细胞/孔 平板接种到96孔板，置于293F选择性介质（DMEM/F12,10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素 G，100U/ml MCG链霉素，250ug/ml湿霉素）中14天。
[0297] 使用lug/ml的抗-EGFR抗体E763 (美国专利第6, 235, 883号）作捕捉抗体并用 1 :100稀释的山羊抗-兔IgGHRPO(CalTag)检测，通过ELISA筛选湿霉素抗性克隆，。
[0298] 用如下方法制作用于抗体滴定（实例3)的EGFRvIII肽-0VA :
[0299] 使用来自Pierce (#20291)的经预称量的DTT还原207 μ g EGFRvIII PEP3。使用 100 μ L去离子水溶解小瓶7. 7mg的经预称量的DTT。将DTT贮存液加入EGFRvIII PEP3。使 用pH7. 4的PBS将反应液定容到600 μ L。室温下旋转反应液30分钟。
[0300] 通过称量5克G10葡聚糖凝胶珠子并加入40mlPBS，混合并在室温下静置10分钟， 然后以lOOOrpm离心珠子10分钟制成G10管柱。除去上清液，并再加入20ml的PBS。将 珠子在lOOOrpm下离心10分钟。除去上清液，加入足够量的PBS以产生50% G10葡聚糖 凝胶珠子的悬浮液。在5ml旋转柱中加入5ml所述50%悬浮混合物，随后将该柱置于14ml 聚丙烯管中。将柱子在lOOOrpm下离心3分钟。另外再加入3ml的PBS，然后再将柱子在 lOOOrpm下离心3分钟。更换新的聚丙烯管，这样所述柱子就可以使用了。
[0301] 从还原肽中移除DTT。在将肽还原的30分钟反应之后，向每个柱子中加入300 μ L 的还原肽。将柱子在lOOOrpm下离心3分钟。另外再向每个柱子中加入250yL的PBS，然 后再在lOOOrpm下离心3分钟。将还原肽收集到14ml的聚丙烯管中。
[0302] 将所述还原肽与用马来酰亚胺激活的OVA连接，并收集到微量离心管中。将2mg 的马来酰亚胺激活的OVA用马来酰亚胺结合缓冲液溶解（Pierce :77126, Rockford IL)以 制成10mg/ml贮存液。将414 μ g的马来酰亚胺激活的0VA加入微量离心管中的还原肽中。 向反应中加入500 μ L马来酰亚胺结合缓冲液。将反应液在室温下培养2小时并随后加入 2mg的半胱氨酸以猝灭可能存在的任何活性马来酰亚胺基团。室温下允许所述半胱氨酸再 反应30分钟。将所述偶联物使用pH7. 4的lx PBS洗涤并用10K离心柱离心3次。这去除 了没有与0VA结合的所有自由肽和自由的半胱氨酸。使用凝胶加样吸头将所述结合物从离 心柱上取下并加入微量离心管中。最后，使用PH7. 4的IX PBS将结合物定容到期望浓度。 所述结合物的摩尔比为14. 5 :1 (肽：0VA)。
[0303] 实例 2
[0304] 通讨杂种细朐产牛制诰-EGFRvIII抗体
[0305] 将产生具有Y-1恒定区的抗体的八只小鼠（XenoMouseGl小鼠）在第0天免疫，然 后对于此方案要在第11、21、32、44和54天加强，然后在第58天进行融合。所有免疫均通过 在尾根部皮下给药和腹腔给药的方式注射。第〇天免疫是用1. 5xl07B300. 19/EGFRvIH转染 的细胞（实例1A)悬浮在与完全Freunds佐剂（CFA) (Sigma, St. Louis, M0) 1 :lv/v混合的 无致热原的DPBS中完成的。第11、21和32天加强是用1. 5xl07B300. 19/EGFRvIII转染的 细胞在与不完全Freunds佐剂（IFA) (Sigma, St. Louis, M0) 1 :lv/v混合的DPBS中完成的。 第44天加强是用与IFA1 :lv/v混合的5 μ g的PEP3 (EGFRvIII肽）-KLH结合（实例1)完 成的，且最后的加强是用没有佐剂的DPBS中5μ gPEP3(EGFRvIII肽）-KLH结合完成的。
[0306] 在第58天，对小鼠实施安乐死，随后回收其腹股沟和腰椎淋巴结。使用组织粉 碎机通过机械破坏从淋巴结中释放出淋巴细胞，随后通过CD90阴性选择除去T细胞。通 过将洗涤并富集的 B 细胞和购自 ATCC，cat#CRL1580 (Kearney et al，J. Immunol. 123 : 1548-1550(1979))的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8. 653细胞以1 :1的比例混合而进行融合。 此细胞混合物通过以800g离心被轻轻地沉淀。彻底去除上清液后，用2-4ml链霉蛋白酶溶 液（CalBiochem，cat. #53702,0. 5mg/ml 在 PBS 中）处理不超过 2 分钟。随后，加入 3-5ml FBS 终止酶活性，用电细胞融合溶液ECFS (0. 3M蔗糖，Sigma，Cat#S7903,0. ImM醋酸镁，Sigma， Cat#M2545, 0· ImM 醋酸钙，Sigma，Cat#C4705 (St. Louis，M0))定容至 40ml。
[0307] 离心后除去上清液，通过在40ml ECFS中再次悬浮洗涤细胞。重复洗涤步骤， 再次用ECFS悬浮细胞以达到2xl06细胞/ml的浓度。使用融合产生器（型号ECM2001， 661161：1'〇11；[(3，111(3.，5311〇168〇,04)进行电-细胞融合。所用的融合室大小为2.〇1111，并使用 下列仪器设置：比对条件：电压：50V，时间：50s，膜破裂条件：电压：3000V，时间：30 μ s，融 合后固定时间：3s。融合后，在 DMEM(JRHBiosciences)、15%FCS(Hyclone)并含有 HAT 的 溶液中悬浮细胞，并加入L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、0ΡΙ (草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素） (均购自 Sigma，St. Louis，M0)和 IL_6(Boehringer Mannheim)在 37°C及 10% C02 空气中 培养。
[0308] 将细胞以4xl04细胞/孔平板接种到平底96孔组织培养板上。在转移到HT(次 黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷）补料介质前，培养被保存在HAT (次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧 啶脱氧核苷）补料介质中2星期。通过在HAT介质的存活选择杂种细胞，并用ELISA筛选 上清液的抗原活性。ELISA格式需要在抗原涂覆平板（作为计数筛选的EGFRvIII肽-0VA 涂覆平板和野生型EGFr p印tide-OVA涂覆平板）上的培养上清液并使用辣根过氧化物酶 (HRP)标记的小鼠抗人类IgG检测EGFRvIII特异结合（见表2. 1)。
[0309] 表 2. 1
【权利要求】
1. 一种经分离的人类单克隆抗体，其结合至EGFRvIII，所述抗体包括： 重链多肽，其包含以下互补决定区（⑶Rs):重链⑶R1，其是SEQ ID NO :2中的⑶R1 ;重 链 CDR2,其是 SEQ ID NO :2 中的 CDR2 ;重链 CDR3,其是 SEQ ID NO :2 中的 CDR3 ; 轻链多肽，其包含以下互补决定区（⑶Rs):轻链⑶R1，其是SEQ IDN0 :19中的⑶R1 ;轻 链 CDR2,其是 SEQ ID NO : 19 中的 CDR2 ;轻链 CDR3,其是 SEQ ID NO : 19 中的 CDR3 ;和 偶联至所述抗体的毒素，其中所述毒素选自Maytansinoid和阜草素（saporin); 其中所述人类单克隆抗体特异性结合至包含序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :94)的肽
2. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述毒素包括皂草素 (saporin)〇
3. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述毒素包括Maytansinoid。
4. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述Maytansinoid包括DM-1。
5. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述重链多肽包含以下三种氨 基酸序列：SEQ ID NO :108, SEQ1D NO :110 和 SEQ ID NO :112。
6. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述轻链多肽包含以下三种氨 基酸序列：SEQ ID NO :101，SEQ1D NO :103 和 SEQ ID NO :105。
7. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中每个⑶R根据Kabat、Chothia 或Kabat和Chothia组合的⑶R定义而定义。
8. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中每个CDR根据Kabat的CDR定 义而定义。
9. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中每个⑶R根据Chothia的⑶R 定义而定义。
10. 如权利要求1所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述重链多肽包含以下三种 氨基酸序列：SEQ ID NO :108, SEQ1D NO :110和SEQ ID NO :112 ;其中所述轻链多肽包含以下 三种氨基酸序列：SEQ ID NO :101，SEQ1D NO :103 和 SEQ ID NO :105。
11. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 特异结合至EGFRvIII的表位，其中所述表位的序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所 /_J、1 ο
12. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 特异结合SEQ ID NO :56。
13. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 对野生型的EGFR肽（SEQ ID NO : 134)的非特异性结合低于所述抗体对EGFRVIII (SEQ ID NO : 135)的特异性结合的10%。
14. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 抑制表皮生长因子（EGF)与表皮生长因子受体vIII (EGFRvIII)的结合。
15. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 特异性识别序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示表位的位置6处的甘氨酸残基。
16. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 进一步结合至序列EEKKGNYVVT (SEQ ID NO :57)所示的表位。
17. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 具有小于1.3X10_9M的KD。
18. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中抗体具有 小于500pM的KD。
19. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 可被内在化。
20. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中氨基酸序 列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)中的参与结合所述抗体的残基选自由如下构成的群组： EEK，KKNYV，LEK，EKNY 和 EEKGN。
21. 如权利要求1-10中任一权利要求所述的经分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体 通过不可裂解连接子偶联至阜草素（saporin)或者Maytansinoid。
22. -种经分离的人类单克隆抗体的抗体变体，其通过在权利要求1-21中任一权利要 求所述的经分离的人类单克隆抗体的氨基酸序列中进行5个或更少的氨基酸的替换、缺失 或增加而形成的变体蛋白；其中变体蛋白结合至序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所 示的肽，且其中所述抗体变体偶联至Maytansinoid或者阜草素（saporin)。
23. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体特异结合至EGFRvIII的表位， 其中所述表位的序列如LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示。
24. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体特异结合SEQ ID NO :56。
25. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体对野生型的EGFR肽（SEQ ID NO :134)的非特异性结合低于所述抗体变体对EGFRVIII (SEQ ID NO :135)的特异性结合的 10%。
26. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体抑制表皮生长因子（EGF)与表 皮生长因子受体vIII (EGFRvIII)的结合。
27. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体特异性识别序列 LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO :56)所示表位的位置6处的甘氨酸残基。
28. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体进一步结合至序列 EEKKGNYVVT(SEQ ID NO :57)所示的表位。
29. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体具有小于1. 3X 10_9M的KD。
30. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体具有小于500pM的KD。
31. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体可被内在化。
32. 如权利要求22所述的抗体变体，其中氨基酸序列LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO : 56)中的参与结合所述抗体变体的残基选自由如下构成的群组：EEK，KKNYV，LEK，EKNY和 EEKGN〇
33. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述抗体变体通过不可裂解连接子偶联至皂 草素（saporin)或者 MaytansinoicL
34. 如权利要求22所述的抗体变体，其中所述Maytansinoid包括DM-1。
35. -种试剂盒，包含：容器，含于其中的组合物和表明所述组合物可用于治疗以 EGFRvIII的表达为特征的癌症的包装说明书或标签，其中所述组合物包含如权利要求 1-21中任一权利要求所述的抗体或权利要求22-34中任一权利要求所述的抗体变体。
36. 如权利要求35所述的试剂盒，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌或 胶质母细胞瘤。
37. 如权利要求36所述的试剂盒，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
38. -种组合物，其包含：权利要求1-21中任一权利要求所述的抗体或权利要求22-34 中任一权利要求所述的抗体变体，以及医药学上可接受的载剂或稀释剂。
39. 权利要求1-21中任一权利要求所述的抗体或权利要求22-34中任一权利要求所述 的抗体变体在制备用于治疗表达表皮生长因子受体νΙΙΙ (EGFRvIII)的癌细胞的药物中的 用途。
40. 如权利要求39所述的用途，其中所述癌细胞是上皮细胞。
41. 如权利要求39所述的用途，其中所述癌细胞包含肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺 癌、乳腺癌、脑肿瘤、胶质母细胞瘤或卵巢癌细胞。
42. 一种制备权利要求1-21中任一权利要求所述的抗体或权利要求22-34中任一权利 要求所述的抗体变体的方法，包括： 提供在权利要求1-21中任一权利要求中识别的所述抗体或权利要求22-34中任一权 利要求所述的抗体变体；以及 将Maytansinoid或阜草素（saporin)偶联至所述抗体或所述抗体变体。
43. 如权利要求42所述的方法，其中提供所述抗体或所述抗体变体是通过提供产所述 抗体或所述抗体变体的杂交瘤细胞进行。
44. 如权利要求43所述的方法，其中所述杂交瘤细胞包含编码所述抗体或所述抗体变 体的核酸。
45. 如权利要求42所述的方法，其中不可裂解连接子用于将Maytansinoid或阜草素 (saporin)偶联至所述抗体或所述抗体变体。
46. -种治疗表达表皮生长因子受体vIII (EGFRvIII)的癌细胞的药物，其活性成分为 权利要求1-21中任一权利要求所述的抗体或权利要求22-34中任一权利要求所述的抗体 变体。
47. 如权利要求46所述的药物，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌或胶 质母细胞瘤。
48. 如权利要求46所述的药物，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
【文档编号】A61P35/00GK104059147SQ201410050583
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2004年6月25日 优先权日:2003年6月27日
【发明者】理查德·韦伯, 冯晓, 奥里特·福德, 拉里·格林, 琼·古达斯, 布鲁斯·基特, 刘颖, 帕拉尼·拉塔纳斯瓦米, 罗伯特·拉亚, 杨晓东, 乔斯·克尔瓦兰, 伊恩·福尔茨, 贾小池, 贾斯帕·康, 查德威克·T·金, 斯科特·L·克拉坎普, 巧娟·简·苏 申请人:艾默根佛蒙特有限公司