具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株制备得到的疫苗，本发明的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名HRV-LZ-2013，基因分型为G10P8，所述疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9452。实验证明本发明中的轮状病毒减毒株保持了对动物的低致病性。在动物上，特别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本发明制备的减毒活疫苗或灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护实验更说明本发明的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮状病毒所引起的腹泻。
CGMCC No.9452
2014.07.08
【专利说明】具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株以及由该减毒株 制备得到的疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种轮状病毒减毒株及由该减毒株制备得到的疫苗，特别涉及一种安 全且具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株、由该减毒株制备得到的疫苗及其制备方 法，本发明属于轮状病毒感染的防治【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒（RV)引起腹泻在发展中国家是一种严重的传染性疾病，每年引起约5万 5岁以下儿童死亡。轮状病毒属于呼肠孤病毒科，分A、B、C 3个群，在人和动物中都有感染。 轮状病毒三层外壳蛋白内有11个不分节的双链RNA，外壳蛋白VP7、VP4是病毒诱导中和抗 体产生的主要免疫原，内膜蛋白VP6是亚群的分类依据。目前根据VP7和VP4基因分型发 现有27G和35P血清型轮状病毒。人的轮状病毒的流行病学研究中发现，普遍流行以G1、 G2、G3、G4和P[4]、P[6]、P[8]单独或混合感染为主，也流行G9P[8]，中国主要流行G1P[8]、 G3P [8]、G2P [8]、G4 [8]，少有 P2、P4 流行。
[0003] 采用单价人、动物和人-动物重配减毒疫苗口服免疫是预防轮状病毒引起的腹 泻、引起死亡和减少住院、腹泻症状的主要手段。
[0004] 轮状病毒感染在人和动物中非常普遍，是发展中国家的严重经济负担，也是威胁 人类健康的公共卫生问题。为预防轮状病毒感染，全球已经开发了口服多价或单价的轮状 病毒疫苗，临床效果显示安全和有效，但动物和人轮状病毒的多样性以及轮状病毒的流行 性和自身特点，使得减毒活疫苗的使用仍存在安全隐患，如动物和人轮状病毒的变异、重 组，人和动物病毒的跨种属传播等，因此开发一种安全广谱的疫苗显得更加迫切。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种用于预防轮状病毒感染所引起的疾病的减毒活 疫苗或灭活疫苗及其制备方法。
[0007] 为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：
[0008] 本发明发明人于2011年在国内某医院收集儿童急性轮状腹泻病粪便样本10例， 用20% PBS (pH = 7. 3)重悬无菌过滤，3000g离心20分钟，吸取0. Iml上清液加入胰酶 (20ug/ml)混合30分钟，接种经PBS洗涤3次单层MA-104细胞（T-25细胞培养液含MEM、 双抗（100U庆大霉素和IOOug链霉素）和8-10%胎牛血清），37°C孵育1小时，加入病毒 维持液（含MEN和0· 5ug/ml胰酶）在37°C培养10-15天，冻融3次再以2000g离心20分 钟，取上清液和胰酶（20ug/ml)混合30分钟后用MEM稀释20倍接种MA104细胞在37°C培 养8-9天，重复传代8-10代至病毒潜伏期至2-3天。分离得到的病毒经Vero细胞分离传 代15代，分离的病毒能够在猴肾细胞上稳定增值且具有细胞病变效应。
[0009] 经基因分型鉴定，由本发明分离得到的轮状病毒（命名为HRV-LZ-2013)的基因型 为G10P8。与其它报道的人轮状病毒GlO型核苷酸序列不一致，与动物轮状病毒LLR株G核 苷酸同源性<90%。该株P型核苷酸序列与轮状病毒同源性> 90%。RNA-SDS PAGE试验 表明其11节RNA属于长型。
[0010] 本发明的一种具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名为HRV-LZ-2013， 基因分型为G10P8,分类命名为人轮状病毒，其菌种保藏编号为：CGMCC No. 9452,保藏时间 是：2014年7月8日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0011] 经本发明分离得到一种轮状病毒减毒株HRV-LZ-2013,其在细胞上病毒滴度高，传 代稳定，用该毒株制备减毒活疫苗，对动物低致病性或无致病性，安全、广谱。制备灭活疫 苗，经灭活和纯化，病毒结构仍能够保持完整并可诱导多种动物产生中和抗体，从而对异型 病毒的攻击产生保护。
[0012] 因此，进一步的，本发明还提出了一种轮状病毒疫苗，其特征在于其有效成分为本 发明所述的具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株或其传代株，抑或是所述具有广谱免 疫原性的人源轮状病毒减毒株的灭活抗原。
[0013] 其中，优选的，所述的传代株是HRV-LZ-2013减毒株在Vero细胞上连续传代 20-100代所获得的减毒株。
[0014] 更进一步的，本发明还提供了一种制备轮状病毒减毒活疫苗以及灭活疫苗的方 法。
[0015] 其中，一种制备轮状病毒减毒活疫苗的方法，其特征包括以下步骤：
[0016] (1)病毒的增殖培养
[0017] Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37 °C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 或其传代株按MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所 述病毒维持液为含〇. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2, 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除 去细胞碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度> 5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原 液；
[0018] (2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化
[0019] 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60%蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10 小时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10% 山梨糖的Hanks平衡液中；
[0020] (3)加入适宜抗动物胃酸的轮状病毒保护剂，制成液体或冻干口服剂型。
[0021] 其中，一种制备轮状病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0022] (1)病毒的增殖培养
[0023] Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37 °C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013 按MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病毒维持液 为含0. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2. 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除去细胞碎片，采 用MA104细胞测定病毒滴度，滴度彡5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原液；
[0024] (2)轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化
[0025] 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60%蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10 小时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10% 山梨糖的Hanks平衡液中；
[0026] (3)病毒的灭活
[0027] 轮状病毒HRV-LZ-2013分别经1/4000甲醛在室温灭活7天，1/4000 β -丙内脂室 温灭活16小时，37°C水解1小时，55°C水浴灭活2小时，取样进行电镜观察和残余活病毒培 养检测；
[0028] (4)合格灭活的轮状病毒抗原经0.45 μ M的膜除菌过滤并检测热原后加入贮存 于-80°C备用；
[0029] (5)制备灭活疫苗
[0030] 纯化灭活后的病毒抗原采用水包油或油包水佐剂乳化制成含50-100 μ g/ml病毒 抗原的疫苗。
[0031] 其中，优选的，步骤（4)中所述的合格灭活的轮状病毒抗原是指三层外壳蛋白完 整的轮状病毒> 90%且无残余病毒活性的抗原，轮状病毒残余毒力试验采用Vero细胞连 续培养3个代次无任何细胞病变，经热灭活的轮状病毒结构完整，在SDSPAGE电泳上有5种 蛋白 VP1、VP2、VP4、VP6、VP7 显示。
[0032] 其中，优选的，所述的佐剂包括1^594304、41^(0!1)3佐剂。
[0033] 相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
[0034] 1、本发明中的轮状病毒减毒株保持了轮状病毒对动物的低致病性。在动物上，特 别是在轮状病毒腹泻模型兔子和猪上的免疫保护实验表明，由本发明制备的减毒活疫苗或 灭活疫苗在动物试验中均显示了良好的免疫保护性，对牛、羊的免疫保护实验更说明本发 明的疫苗免疫保护范围广，可用于预防牛、猪、马、羊、犬等由轮状病毒所引起的腹泻。
[0035] 2、在发明中纯化、灭活后轮状病毒3层外壳结构的完整是疫苗保持免疫作用的前 提，热灭活与化学灭活结合的方法相比单纯化学灭活方法来说最大限度的保持了轮状病毒 结构的完整性。安全有效的佐剂可以增强免疫作用，减少疫苗成本，人用疫苗的佐剂和兽用 疫苗佐剂均可使用以便制成人或动物疫苗。
[0036] 3、由于本发明疫苗为单价疫苗，因此利用本发明的轮状病毒减毒株制备减毒活疫 苗或灭活疫苗，其制备方法简单，且生产成本低、因而成品价格低廉。
[0037] 4、本发明的减毒活疫苗或灭活疫苗虽是单价疫苗，但具有广谱免疫原性，可通过 口服免疫，效果好，且使用方便。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039] 实施例1、人源轮状病毒的分离、传代和筛选
[0040] 2011年在国内某医院收集儿童急性轮状腹泻病粪便样本10例，用20% PBS (pH = 7. 3)重悬无菌过滤，3000g离心20分钟，吸取0. Iml上清液加入胰酶（20ug/ml)混合30分 钟，接种经PBS洗涤3次单层MA-104细胞（T-25细胞培养液含MEM、双抗（100U庆大霉素和 100即链霉素）和8-10%胎牛血清），371：孵育1小时，加入病毒维持液（含1^和0.5即/ ml胰酶）在37°C培养10-15天，冻融3次再以2000g离心20分钟，取上清和胰酶（20ug/ ml)混合30分钟后用MEM稀释20倍接种MA104细胞在37°C培养8-9天，重复传代8-10代 至病毒潜伏期为2-3天。分离的病毒经Vero细胞分离传代15代，毒株在不同细胞中分离 适应的结果如表1。从表1结果可以看出分离病毒的能够在猴肾细胞（Vero)上稳定增殖且 具有细胞病变效应。
[0041] 表1轮状病毒的分离和细胞适应
[0042]
【权利要求】
1. 具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株，命名为HRV-LZ-2013,基因分型为 G10P8,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No.9452。
2. 权利要求1所述的具有广谱免疫原性的人源轮状病毒减毒株在制备轮状病毒疫苗 中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的轮状病毒疫苗为轮状病毒减毒活疫苗 或灭活疫苗。
4. 一种轮状病毒疫苗，其特征在于其有效成分为权利要求1所述的具有广谱免疫原性 的人源轮状病毒减毒株或其传代株，抑或是权利要求1所述的具有广谱免疫原性的人源轮 状病毒减毒株的灭活抗原。
5. 如权利要求4所述的轮状病毒疫苗，其特征在于所述的传代株是HRV-LZ-2013减毒 株在Vero细胞上连续传代20-100代所获得的减毒株。
6. -种制备轮状病毒减毒活疫苗的方法，其特征包括以下步骤： (1) 病毒的增殖培养 Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37°C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013或其 传代株按MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病毒 维持液为含〇. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2, 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除去细胞 碎片，采用MA104细胞测定病毒滴度，滴度> 5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原液； (2) 轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60 %蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10小 时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10%山 梨糖的Hanks平衡液中； (3) 加入适宜抗动物胃酸的轮状病毒保护剂，制成液体或冻干口服剂型。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的传代株是HRV-LZ-2013减毒株在 Vero细胞上连续传代20-100代所获得的减毒株。
8. -种制备轮状病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 病毒的增殖培养 Vero细胞按20-30万个/ml接种转瓶，37°C培养3天后，将轮状病毒HRV-LZ-2013按 MOI 0. 01-0. 1接种，37°C培养1小时后，生理盐水洗后加入病毒维持液，所述病毒维持液为 含0. 1 %的牛血清的MEM，pH 7. 2, 32°C培养3-5天，反复冻融3次，离心除去细胞碎片，采用 MA104细胞测定病毒滴度，滴度> 5. 51ogCCID5(l/ml且无菌为合格疫苗原液； (2) 轮状病毒HRV-LZ-2013的纯化 采用连续蔗糖密度梯度离心法，在含有60 %蔗糖的TNE缓冲液中120000g离心10小 时，取出浮力密度为I. 36g/ml的纯化原液，电镜观察合格后重悬稀释到PH = 7. 0含10%山 梨糖的Hanks平衡液中； (3) 病毒的灭活 轮状病毒HRV-LZ-2013分别经1/4000甲醛在室温灭活7天，1/4000 P -丙内脂室温灭 活16小时，37°C水解1小时，55°C水浴灭活2小时，取样进行电镜观察和残余活病毒培养检 测； (4) 合格灭活的轮状病毒抗原经0.45 yM的膜除菌过滤并检测热原后加入贮存 于-80°C备用； (5) 制备灭活疫苗 纯化灭活后的病毒抗原采用水包油或油包水佐剂乳化制成含50-100 ii g/ml病毒抗原 的疫苗。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于步骤（4)中所述的合格灭活的轮状病毒抗原 是指三层外壳蛋白完整的轮状病毒> 90 %且无残余病毒活性的抗原，轮状病毒残余毒力试 验采用Vero细胞连续培养3个代次无任何细胞病变，经热灭活的轮状病毒结构完整，在SDS PAGE电泳上有5种蛋白VP1、VP2、VP4、VP6、VP7显示。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的佐剂包括MF59、AS04、Al (OH) 3佐 剂。
【文档编号】A61P31/14GK104312985SQ201410498365
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】吕宏亮, 张澍 申请人:吕宏亮, 张澍