一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，包括以下步骤：提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因开放阅读框片段，并铆定定向插入T4噬菌体；利用免疫筛选的方法获取具有ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1(CCTCC M 2014397)宿主细胞；发酵培养获得的X-BlueST1宿主细胞，诱导表达灭活后培养物作为抗原；ELISA标定抗原效价，并用生理盐水倍比稀释抗原终浓度为107U/ml；1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即为疫苗。本发明利用噬菌体表达猪圆环病毒Ⅱ型抗原并制备疫苗，避免了弱毒疫苗毒力返强风险，且采用发酵培养利于大规模工业化生产，成本远低于通过细胞培养的方式生产疫苗。CCTCC M 201439720140901
【专利说明】一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒感染是由圆环病毒引起的猪的一种急性传染病。主要特征为消瘦、体 质下降、贫血、黄疸、腹泻、发育不良、呼吸困难、母猪繁殖障碍的。伴有广泛的病理化。根据 其血清型的不同可分为PCVl及PCV2。其中我国报道较多感染比较严重的为PCV2。目前治 疗PCV2的方法多方法复杂，成本较高，从技术上取得的效果收益甚微。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原 疫苗的制备方法，用以控制猪圆环病毒II型病的感染，减少危害。
[0004] 本发明提供了一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，为了对披露的 实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。
[0005] 本发明的一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法包括以下步骤：
[0006] 提取猪圆环病毒II型（PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应（PCR)扩增 获取猪II型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述 猪圆环病毒II型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗，利用 制备的猪圆环病毒II型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性 克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经 纯化后重新侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主细胞；
[0007] 噬菌体再次侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0. 6 时，加入终浓度为100 y g/ml异丙基-e -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达2h，诱导表达后 培养物加入终浓度为1%的甲醛并在4°C，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的 培养物作为免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用 间接酶联免疫吸附剂测定（ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效 价，把抗体效价稀释成为1:300 ;用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍 比稀释，稀释抗原终浓度为l〇7U/ml ;以1:2. 5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫 苗。
[0008] 其中，以下菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：
[0009] 大肠杆菌EscherichiacoliX-BlueSTl;
[0010] 保藏编号：CCTCC M 2014397 ;
[0011] 保藏日期：2014年9月1日；
[0012] 简称为X-BlueSTl;
[0013] 保藏于中国，武汉，武汉大学。
[0014] 本发明的有益效果如下：
[0015] 通过制备带有PCV2病毒的噬菌体展示表达抗原，并把其制备成疫苗，取得较好的 保护效果。且可以大量生产只需细菌发酵培养，生产成本低于现行的细胞培养。由于噬菌 体展示表达圆环病毒抗原疫苗是重组单蛋白抗原，并且T4噬菌体感染具有细胞嗜性，避免 了现行活疫苗返毒及引入外援病原体感染的风险。该疫苗易于制备且利于大规模生产及使 用。
[0016] 为了上述以及相关的目的，一个或多个实施例包括后面将详细说明并在权利要求 中特别指出的特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图10RF2基因PCR扩增产物电泳图；
[0018] 图20RF2抗原蛋白的抗原表位分析。
【具体实施方式】
[0019] 以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。
[0020] 下面对本发明做详细描述。
[0021] 实施例1猪圆环病毒II型ORF2基因的获取及免疫筛选多抗的制备
[0022] 1猪圆环病毒II型ORF2基因的获取。
[0023] GENBANK上查找PCV2的ORF2序列，根据所获得的序列查找开放阅读框，并根据开 放阅读框的序列设计以下引物：
[0024] 上游引物 5 ' -CGGGTACCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGGC-3 '
[0025] 下游引物 5 ' -GCGGATCCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGG-3 '
[0026] 提取猪圆环病毒II型病毒培养液的mRNA，反转录为cDNA，并以此为模板PCR扩增 ORF2片段，目的基因扩增结果如图1所示，704bp中为目的条带，连接PMD-18T载体，测序获 得的基因片段的特征如下：
[0027] ORF的长度为704bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。基因序列如下：
【权利要求】
1. 一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 提取猪圆环病毒II型（PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应（PCR)扩增获 取猪II型圆环病毒0RF2开放阅读框基因片段，制成改造后的0RF2基因片段，然后将所述 猪圆环病毒II型0RF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue ST1CCTCC M2014397宿主细胞，原核表达0FR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗，利用制 备的猪圆环病毒II型多抗对插入0RF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克 隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入0RF2基因的T4噬菌体；经纯 化后重新侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞； 噬菌体再次侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0. 6时，加 入终浓度为100 U g/ml异丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养 物加入终浓度为1%的甲醛并在4°C，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养 物作为免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接 酶联免疫吸附剂测定（ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价， 把抗体效价稀释成为1:300 ;用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比 稀释，稀释抗原终浓度为l〇7U/ml ;以1:2. 5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒II型ORF2基因片段 铆定定向插入T4噬菌体方法为：将所述改造后的ORF2基因片段连接插入pMD-18T载体，制 成PMD-18T-ORF2 ;利用EcoR I和hindlll双酶切，回收酶切片段，并用EcoR I和hindlll 酶切T4噬菌体表达质粒；回收酶切片段，T4连接酶连接基因片段到T4噬菌体的S0C位点。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒II型多抗的制备方 法为： 用EcoR I和hindlll分别双酶切重组克隆质粒pMD-18T-0RF2和表达载体 pET-28a(+);以 4yl 0RF2 基因片段、lyl pET-28a(+)载体片段、lyl T4DNA 酶、lyl 连 接酶缓冲液、3. 5 y 1 ddH20的体系，4°C连接过夜，将连接产物转化到ToplO感受态细胞中， 冰浴30min，42°C热应激90s，冰浴2-3min，加 lml LB液体培养基37°C摇40min，均匀涂在含 氨苄西林（100 y g/ml)的LB平板上37°C培养过夜；挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒，进行聚 合酶链式反应（PCR)和双酶切鉴定，得到pET-28a-0RF2 ; 将所述pET-28a-0RF2转化入感受态E. coli BL21(DE3)中，在含50yg/ml卡那霉素的 LB固体培养基上培养过夜；挑取单菌落，加入含卡那霉素（50 y g/ml)的LB液体培养基中， 37°C振荡培养至菌液A600达0. 4-0. 6时，加入终浓度为ImM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG) 诱导表达，37°C振荡诱导4h，离心，收集菌体；取lml菌液，4°C，8000g/min离心5min，保 留沉淀物，菌体用PBS反复冲洗两次，再进行超声，超声仪设置为130W、开5s、停5s，超声 30min，12000r/min离心15min，收集沉淀；向沉淀物中加入70 y 1 1XTE缓冲液，重悬沉淀， 加入4. 5 y 1二硫苏糖醇（DIT)，2 y 1 5 X上样缓冲液，煮沸lOmin，4°C，10000g离心10min， 取15 y 1上清进行SDS-PAGE分析；条带正确后，用含有8M尿素的缓冲液重悬沉淀；4°C条件 下溶解lh ;过镍柱，分离纯化表达的重组蛋白，对纯化复性的原核表达蛋白进行梯度复性， 并透析浓缩；用纯化复性的原核表达蛋白免疫猪（每头20mg)，三免后采血，重组蛋白抗原 包被ELISA检测抗体效价，抗体效价大于1:16时，采血，静置析出，离心后获得血清作为多 抗。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达，表达并纯化所述猪圆 环病毒II型0RF2重组蛋白，用重组蛋白制备多克隆血清，并利用获取的阳性多克隆血清， 把插入0RF-2基因的T4噬菌体从T4噬菌体文库中筛选出来，免疫筛选获取阳性克隆斑，纯 化测序鉴定，并把其作为侵染新的X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞的种毒。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疫苗佐剂为化妆品级白油。
【文档编号】A61K39/12GK104474540SQ201410515139
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】李明义, 高江明, 刘阳, 李晓林, 单学强, 张伦, 冯晶晶, 李佳棋, 孙化露, 葛栋, 郭春丽 申请人:山东信得科技股份有限公司