新型主被动双靶向金纳米棒制备方法及其肿瘤诊断治疗一体化的新途径的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型主被动双靶向金纳米棒，所述的新型双靶向金纳米棒由两亲性温敏复合物包裹金纳米棒和阿霉素，并在其表面修饰靶向分子。本发明还提供该双靶向金纳米棒的制备方法及其在肿瘤诊断治疗一体化中的应用。其优点表现在：本发明获得的双靶向金纳米棒具有优良的光热转换特性，赋予其可视化特性，通过MRI或荧光实现病灶显像，然后在光刺激下，实现光热转换，释放负载药物在体治疗病灶，不仅无创实时追踪纳米载体分布吸收，而且增强了体外肿瘤细胞的致死率和实现了小鼠的体内肿瘤的诊断治疗一体化，应用前景广阔。
【专利说明】新型主被动双靶向金纳米棒制备方法及其肿瘤诊断治疗一体化的新途径
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物【技术领域】，具体地说，是新型主被动双靶向金纳米棒制备方法及其诊断治疗肿瘤一体化的新途径。
【背景技术】
[0002]纳米颗粒(nanoparticle)由于其尺寸等特性因此能够渗透到膜细胞中，并沿神经细胞突触、血管和淋巴血管等进行传播，与此同时，某些特殊的纳米颗粒可以选择性地积累在不同的细胞和一定的细胞结构中[Gu G, Gao X, Hu Q, et al.The influence of thepenetrating peptide iRGD on the effect of paclitaxel—loaded MTl_AF7p-conjugatednanoparticles on gl1ma cells.B1materials.2013 Jul; 34 (21): 5138-48]。纳米颗粒的强渗透性不仅为药物的使用提供了有效性，某些金属纳米颗粒还在医学造影成像中有着良好的作用[Lin J, Alexander-Katz A et al.Cell membranes open "doors"for cat1nic nanoparticles/b1molecules:1nsights into uptake kinetics.ACSNan0.2013 Dec 23; 7 (12): 10799-808.]。纳米颗粒(nanoparticle)的结构组成和粒径尺寸与其在生物体内的作用性能有着重要的联系。纳米金由于其出色的生物相容性和生物亲和性在因此生物医学领域有着广泛的应用[Ludwig, C.; Wagner, R.Virus-likeparticles-universal molecular toolboxes.Curr.0pin.B1technol.2007, 18 (6)，537-545.]，由于金属纳米颗粒优秀的磁力学和光学特性，现在已经越来越多地应用于医学诊断成像和治疗中[SunY G, Mayers B, Xia Y N.et al.Metal nanostructures withhollow inter1rs[J].AdvMater,2003,15(7-8):641 ;Arnida, Malugin A.Ghandehari Het al.Cellular uptake and toxicity of gold nanoparticles in prostate cancercells:A comparativestudy of rods and spheres[J].J Appl Toxico，2010，30 (3).212]。虽然有如此多的优点，但是诸多实验结果表明金纳米棒的靶向性还是存在不足。
[0003]基于金纳米粒子超顺磁性，赋予了该纳米载体可视化特性，通过MRI显像，不仅无创实时追踪纳米载体分布吸收，而且实现乳腺癌病灶预警。
[0004]基于纳米金棒针对肿瘤细胞的选择性杀伤和自身良好的光热转换效应，在此我们设想如果把纳米金棒作为药物联接的复合载体应用于药物运输(drug delivery system)中，既可以增强其靶向作用又可结合光热治疗。
[0005]现如今的化疗药物，如D0X、长春新碱等能够杀死肿瘤细胞，并抑制恶性肿瘤的生长和发育，但他们在对肿瘤细胞进行杀伤的同时，对机体正常的组织细胞同样也具有严重的杀伤，因此患者会比较痛苦。但是近年来，随着生物技术和纳米技术的兴起，使得靶向性强、无毒副作用的治疗方式成为可能，给肿瘤患者带来新的福音。现如今的纳米医药成为了肿瘤新型治疗领域里的一支强力军。在治疗肿瘤的纳米载药运输体系中，可运用医疗高分子作为一种载体来进行药物运输，我们合成的高分子由于其热力学稳定性好以及动力学上的优势，本发明中我们应用我们已合成的温敏高分子与卵磷脂对纳米金棒进行修饰并对化疗药物进行包裹连接[Chithrani BD, Ohazani AA et al.ChanWC W.Determining thesheand Shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells[J].Nano Lett，2006，6 (4):662 ;Tanner M，Hollen M，Junttila TT，Kapanen Al, TommolaS，Soini Y，et al.Amplificat1n of Her_2 in gastric carcinoma: associat1nwith topoisomerase II a gene amplificat1n, intestinal type, poor prognosis andsensitivity to trastuzumab.Ann Oncol, 2005, 16, 273-8.] 0 因为纳米金棒在特定光照剌激下会产生热能，这样使我们的温敏高分子发生形变从而使得在温敏脂质体包裹下的药物进行释放，这种方式可应用于某些特定肿瘤的光热治疗。
[0006]Her2是人类的癌基因，定位于人染色体的7q21处，是编码分子量为185kD跨膜蛋白。Herf抗原是表达于细胞表面的丝氨酸蛋白激酶家族成员之一，该家族是由4个EGF受体组成的，分别是EGFR (ErbBl)、ErbB2 (Her2)、ErbB3和ErbB4。通常该家族成员包括一个胞内丝氨酸激酶区，一个单次跨膜区和一个胞外配体结合区[Park HY，Schadt M J，WangLY，et al.Fabricat1n of magnetic core @ Ishell Fe oxide @ Aunanopartic1es forinterfacial b1activity and b1separat1n[J].Langmuir，2007，23(17):9050 ;ishraYK， Mohapatra S， AvasthiD K， et al.Gold—silica nanocomposites for the detect1nof humanovarian cancer cells:A preliminary study[J].Nanotechnology,2007,18
(34):345606]。人乳腺癌SKBR3细胞表面过表达Herf蛋白，这将会导致肿瘤细胞的异常增生，血管增生，肿瘤细胞发生转移以及抗凋亡作用[Zhang⑶，YiZ，Wei L，et al.1nfluence of anchoring ligand sandparticle size on the colloidal stability andin vivo b1distribut1n of polyethylene glycol ;coated gold nanoparticles intumor-xenografted mice[J].B1materials,2009,30(10):1928]。
[0007]但是关于本发明的双靶向金纳米棒(新型靶向金纳米棒)、制备方法及其诊断治疗肿瘤一体化的新途径目前还未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种双靶向金纳米棒。
[0009]本发明的再一的目的是，提供一种双靶向金纳米棒的制备方法。
[0010]本发明的另一的目的是，提供一种双靶向金纳米棒的应用。
[0011]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种双靶向金纳米棒，所述的双靶向金纳米棒由两亲性温敏复合物包裹金纳米棒和阿霉素，并在其表面修饰靶向分子。
[0012]所述的两亲性温敏复合物为温敏高分子K3、温敏高分子09JA、Mal-PEG_DSPE和卵磷脂材料制备的复合物。
[0013]所述的靶向分子为ant1-Her2_Fab抗体、天冬氨酸或叶酸。
[0014]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:一种双靶向金纳米棒的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤:
A、利用CTAB金种子生长法制备金纳米棒；
B、通过温敏高分子K3、温敏两亲性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制备温敏复合材料；
C、利用温敏复合材料的亲水、疏水作用，把金纳米棒和阿霉素包裹起来； D、通过巯基化的ant1-Her2_Fab抗体对其祀向修饰，即得到双祀向金纳米棒。
[0015]所述的步骤A为:向5mL 5 X 10_4mol/L氯金酸中依次逐滴加入5mL 0.2mol/L CTAB溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，剧烈搅拌2h后备用;向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL 0.004 mol/L的AgN03溶液、5mL 0.001mol/L氯金酸溶液、75 μ L的0.0788mol/L的抗坏血酸及12 μ L的金种子液，缓慢搅拌10_20h后即得到金纳米棒；以上制备温度为28 °C。
[0016]所述的步骤B为:称取温敏高分子K3与温敏两亲性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1: 1的溶液中，使其总体积为2ml ;称取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其体积为0.5ml ;称取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;将以上三种配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2进行旋蒸，转速为50r/min，旋转蒸发待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
[0017]所述的步骤C为:配制2mg/ml溶剂为PBS溶液的D0X溶液与lmg/ml的纳米金棒溶液进行共混，取3ml对旋蒸成膜后的旋蒸瓶进行洗脱，旋蒸过程中注意避光；洗脱后的溶液避光透析，透析膜为3500KDa，透析液为18.2 Ω的MilliQ-water。
[0018]所述的步骤D为:取透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her2_Fab抗体进行连接，其中ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE摩尔比为1:10，室温下孵育2h，摇床轻微摇晃；将联接好的溶液进行透析，透析膜为100KD，在PBS溶液中于4°C。
[0019]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:双靶向金纳米棒在制备诊断或治疗肿瘤的药物中的应用。
[0020]本发明优点在于:
1、本发明的双靶向金纳米棒主动靶向病灶部位，利用金纳米棒的超顺磁性，通过MR I显像对体内实时追踪纳米载体分布吸收；通过光热转化特性，使温敏复合物在肿瘤部位释放阿霉素，以达到诊断治疗一体化的作用。
[0021]2、本发明的双靶向金纳米棒的制备方法合成工艺简单，而且可以实现规模化生产，制备过程为常温常压、易于操作，具有很好的实用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]附图1是本发明制备的双靶向金纳米棒构建及结构示意图。
[0023]附图2a、2b、2c是本发明制备的金纳米棒的光吸收曲线，粒径大小，电镜图片。
[0024]附图3是本发明制备的金纳米棒的光热转换特性结果。
[0025]附图4是本发明制备的温敏复合材料的透射电镜图片。
[0026]附图5是本发明制备的双靶向金纳米棒的尺寸分布。
[0027]附图6a、6b是本发明制备的双靶向金纳米棒对体外肿瘤细胞株的光至杀伤作用。
[0028]附图7是本发明制备的双靶向金纳米棒对体内肿瘤组织的影像诊断。
[0029]附图8a、8b是本发明制备的双靶向金纳米棒对体内肿瘤组织的治疗功能，附图8b自左至右:阴性对照，化疗药物，抗体，金棒-药物，光热刺激。
【具体实施方式】
[0030]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0031]本发明的一种双靶向金纳米棒由两亲性温敏复合物包裹金纳米棒和阿霉素，并在其表面修饰祀向分子。
[0032]所述的两亲性温敏复合物可以是温敏高分子K3及温敏高分子09JA (Li W，ZhaoΗ., Qian ff, et al.Chemotherapy for gastric cancer by finely tailoring ant1-Her 2anchored dual targeting immunomicel 1es B1materials, 2012, 33:5349.)、侨联剂-马来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE，购买)和卵磷脂材料的复合物。本发明所涉及的Mal-PEG-DSPE和卵磷脂材料可以参照[Chithrani BD，Ohazani AA et al.ChanWC ff.Determining the sheand Shape dependence of goldnanoparticle uptake into mammalian cells [J].Nano Lett,2006,6(4):662 ;TannerM, Hollen M, Junttila TT, Kapanen Al, Tommola S, Soini Y, et al.Amplificat1nof Her-2 in gastric carcinoma: associat1n with topoisomerase II a geneamplificat1n, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab.Ann Oncol, 2005, 16, 273-8.]。所述的祀向分子可以是ant1-Her2_Fab抗体,也可以不是抗体，例如cRGD，叶酸等祀向分子。
[0033]其中优选的一种双靶向金纳米棒为:
利用亲水、疏水特性使温敏复合物包裹金纳米棒和阿霉素，通过巯基化的抗体连接在其表面。所述的温敏高分子载体是K3、09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂材料如PC的复合体。所述的巯基化的抗体，即通过2-1T和Ant1-Her2-Fab表面氨基反应形成稳定的酰胺键，此时2-1T暴露出-SH基团，从而与温敏复合体连接，实现共价负载。
[0034]本发明的一种双靶向金纳米棒的制备方法，包括以下步骤:
A、利用CTAB金种子生长法制备金纳米棒；
B、通过温敏高分子K3、温敏两亲性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制备温敏复合材料；
C、利用温敏复合材料的亲水、疏水作用，把金纳米棒和阿霉素包裹起来；
D、通过巯基化的ant1-Her2_Fab抗体对其祀向修饰，即得到双祀向金纳米棒。
[0035]其中，各步骤可以具体为:
所述的步骤A具体为:向5mL 5X10_4mol/L氯金酸中依次逐滴加入5mL 0.2mol/L CTAB溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，剧烈搅拌2h后备用;向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL 0.004 mol/L的AgN03溶液、5mL 0.001mol/L氯金酸溶液、75 μ L的0.0788mol/L的抗坏血酸及12 μ L的金种子液，缓慢搅拌10_20h后即得到金纳米棒；以上制备温度为28 °C。
[0036]所述的步骤B具体为:称取温敏高分子K3与温敏两亲性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;称取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其体积为0.5ml ;称取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;将以上三种配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2进行旋蒸，转速为50r/min,旋转蒸发待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
[0037]所述的步骤C具体为:配制2mg/ml溶剂为PBS溶液的D0X溶液与lmg/ml的纳米金棒溶液进行共混，取3ml对旋蒸成膜后的旋蒸瓶进行洗脱，旋蒸过程中注意避光；洗脱后的溶液避光透析，透析膜为3500KDa，透析液为18.2 Ω的MilliQ-water。
[0038]所述的步骤D具体为:取透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her2_Fab抗体进行连接，其中ant1-Her2- Fab:Mal_PEG_DSPE摩尔比为1:10，室温下孵育2h，摇床轻微摇晃；将联接好的溶液进行透析，透析膜为100KD，在PBS溶液中于4°C。
[0039]所述步骤A中透析的具体工艺为:在特定温度28°C下，通过控制搅拌器的转速和硝酸银的量合成特定长径比的金纳米棒。
[0040]所述步骤B中合成的具体工艺为:通氮气的优点在于，氮气性质稳定，可赶走旋蒸瓶中的氧气及有机溶剂-氯仿，确保温敏复合材料的合成是在无氧条件下进行。
[0041]所述步骤C中透析的具体工艺为:采用透析袋在蒸馏水中透析。
[0042]所述步骤D中透析具体工艺为采用透析袋先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析。
[0043]实施例1金纳米棒的制备
a.种子液的制备，具体步骤如下:
配制0.2M的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)溶液5ml，用MilliQ-wate配制；配制0.0005M的HAuC14溶液5ml，用MilliQ-water配制；将上述的CTAB溶液加入HAuC14溶液中，并缓慢搅拌；
配制 0.01M 冰的 NaBH4 溶液 0.6ml, MilliQ-water 配制；
将配置好的NaBH4溶液缓慢加入HAuC14溶液中，发现HAuC14溶液逐渐变色；在室温的条件下放置于磁力搅拌器剧烈搅拌2小时，搅拌完成后于25°C保存，种子液的颜色变为茶色；
b.生长液的制备，具体步骤如下:
配制25ml的0.2M的CTAB并分装成5份，每份为5ml，统一用MilliQ-water进行配制；配制0.004M的AgN03溶液，用MilliQ-water配制。将配制好的CTAB溶液分别加入(0.050.1 0.15 0.2 0.25ml)的 AgN03 溶液中(25°C条件之下)。
[0044]c.纳米金棒的制备，具体步骤如下:
配制0.001M的HAuC14溶液25 ml，均分成5份，每份5ml ;在配制好的b生长液中加入上述配制好的HAuC14溶液；缓慢搅拌后加入75 μ L的0.0788Μ的抗坏血酸(MilliQ-water配制);再向上述溶液中加入12111^的金种子液(在27-30°0并缓慢搅拌。溶液颜色逐渐改变，无色变为紫红色为正常，在室温下缓慢搅拌10_20h后对其进行测定。附图2:金纳米棒的光吸收曲线(附图2a)，粒径大小(附图2b)，电镜图片(附图2c)很好的表征了金纳米棒的物理特征。
[0045]实施例2金纳米棒的光热转换特性的检测
对于不同组别的纳米金棒进行离心称重，对纳米金棒浓度进行标定浓度为lmg/ml ;分别取6种标定好样品标记为MilliQ-water、50、100、150、200、250，每个样品池装入溶液3ml ;统一调节激光光斑为1cm2，激光光源与样品池间的距离为10cm，并进行固定；在样品池内放入热敏电耦温度计并开始进行读数并计时，平均5s进行读数并记录。附图3表明了金纳米棒的良好的光热转换特性。
[0046]实施例3制备新型靶向金纳米棒
称取高分子K3与高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;称取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其体积为0.5ml ;称取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;将以上三种配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2进行旋蒸(转速为50r/min),旋转蒸发待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出，附图4为温敏复合材料的透射电镜图片，表征了其良好的形态；配制2mg/ml DOX溶液(溶剂为PBS溶液)与lmg/ml的纳米金棒溶液进行共混，取3ml对旋蒸成膜后的旋蒸瓶进行洗脱(注意避光)；洗脱后的溶液避光透析，透析膜为3500KDa，透析液为18.2 Ω的MilliQ-water ;透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her2_Fab进行连接，此组作为靶向组；另取透析后的溶液与巯基化的BSA进行连接，设置为非靶向组。室温下孵育2h(摇床轻微摇晃);将联接好的溶液进行透析，透析膜为100KD，在PBS溶液中于4°C。靶向组即为新型靶向金纳米棒。
[0047]实施例4新型靶向金纳米棒的肿瘤细胞治疗性
用SKBR3细胞来研究新型靶向金纳米棒的肿瘤细胞治疗性。将五种不同不同的药物:温敏高分子包裹阿霉素、阿霉素、金纳米棒、新型靶向金纳米棒及PBS，分别作用SKBR3细胞株，经激光照射后，用CCK-8试剂检测细胞的存活率，结果如附图6a、6b，展示出新型靶向金纳米棒对肿瘤细胞杀伤作用是最强的。
[0048]实施例5利用新型靶向金纳米棒对体内肿瘤组织进行诊断
首先建立了 U87小鼠脑内肿瘤模型，通过尾静脉注射，每次注射剂量为2mg/kg(以金纳米棒的质量计算)，注射5次,平均每3天注射一次，新型祀向金纳米棒通过血液循环，在脑部进行聚集，再通过MRI成像可检测肿瘤组织的生长情况。附图7a是治疗前，通过MRI成像，检测不到脑内肿瘤的分布和生长情况。附图7b是使用新型靶向金纳米棒(用RJD替换靶分子ant1-Her2-Fab，它是一种亲和素)后，通过MRI成像，检测到了肿瘤在脑内的分布和生长情况。
[0049]实施例6利用新型靶向金纳米棒对体内肿瘤组织进行治疗
首先建立了 SKBR3小鼠肿瘤模型，然后将接种了 SKBR3人乳腺癌细胞的Balb/c裸鼠进行随机分组，分组为4组，包括阿霉素对照组、PBS溶液注射对照组、包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组、包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组、纳米金棒注射组。每组Balb/c裸鼠为5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠米次注射按照阿霉素的剂量为5mg/kg (包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组为乙腈打破后标定的量)，纳米金棒注射组浓度与包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组两组中所含纳米金棒浓度为统一标准，每次纳米金棒的注射剂量为2mg/kg。注射5次，平均每3天注射一次(防止单纯阿霉素注射组荷瘤裸鼠副作用导致裸鼠在未完成实验前死亡)。在第一天药物注射时开始记录并随时观察并记录每组接种了 SKBR3人乳腺癌细胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情况，每2天测量器肿瘤大小并对其进行体重称量。肿瘤体积计算方法如下:肿瘤体积计算公式:长X宽X宽/2
在对荷瘤Balb/c裸鼠进行药物注射后第30天对全部荷瘤的Balb/c裸鼠进行解剖，取出其肿瘤组织，并测量每组荷瘤Balb/c裸鼠的肿瘤组织的质量与体积，并对其进行数据处理。这些结果附图8表明所制备的新型靶向金纳米棒能实现对肿瘤组织的良好治疗，其中，附图8b自左至右:阴性对照，化疗药物，抗体，金棒-药物，光热刺激。
[0050]本发明的新型靶向金纳米棒不仅可以实现对肿瘤组织的诊断，还可以实现对肿瘤组织的有效治疗。因此本发明的制备方法将拓展基于医学肿瘤学上的应用范围。
[0051]本发明中采用侨联剂-马来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE)提高金纳米棒的生物相容性并延长其血液循环时间有效；采用温敏高分子K3和09JA实现对金纳米棒和阿霉素在肿瘤组织释放的可控性；另外利用巯基化的ant1-Her2-Fab抗体提高了新型金纳米棒的祀向性。
[0052]新型靶向金纳米棒超顺磁性和光热转换特性，实现了诊断治疗肿瘤一体化:
(1)金纳米棒的表征结果
通过紫外-可见分光光度计对合成的金纳米棒的光吸收测试，结果为附图2a，揭示了金纳米棒的长轴和短轴的存在；动态光散射仪(ALV/CGS-3)对我们制备好后的纳米金棒复合载体的粒径进行检测，结果附图2b表明金纳米棒的粒径小于lOOnm ;通过透射电镜表征金纳米棒的形态，其结果附图2c进一步确认了金纳米棒的棒状结构。
[0053](2)金纳米棒光热特性的测试
在规格为500mW 808nm的激光光源的照射下，于固定时间内于室温下对不同组别相同体积相同浓度的纳米金棒溶液进行温度测量。平均每5s对放入纳米金棒溶液的热电耦温度计进行读数并记录，初始温度统一控制为29°C。实验结果发现纳米金棒在激光光源激发下温度逐渐升高，然而MilliQ-water对照组并没有出现任何温度变化，此现象表明进行光热转化主要是依靠纳米金棒。
[0054]( 3 )新型靶向金纳米棒表征
动态光散射仪(ALV/CGS-3)对我们制备好后的纳米金棒复合载体的粒径进行检测，结果图2b表明金纳米棒的粒径小于lOOnm ;通过透射电镜表征金纳米棒的形态，其结果图2c表明新型靶向金纳米棒的结构。与示意图1是一致的。
[0055](4)新型靶向金纳米棒体外肿瘤细胞治疗性分析
用SKBR3细胞来研究新型靶向金纳米棒的肿瘤细胞治疗性。将五种不同不同的药物:温敏高分子包裹阿霉素、阿霉素、金纳米棒、新型靶向金纳米棒及PBS，分别作用SKBR3细胞株，经激光照射后，用CCK-8试剂检测细胞的存活率，结果如图6a、6b，展示出新型靶向金纳米棒较强的细胞毒性。
[0056](5)新型靶向金纳米棒体内肿瘤的诊断研究
将新型靶向金纳米棒尾部静脉注射进体重为24 g的小鼠体内，分别在注射前和注射后0.5，1.5，3，12小时通过MRI扫描检测得到的图片(图7)，从图中能够清楚地看到新型靶向金纳米棒在病灶部位富集。
[0057](6)新型靶向金纳米棒治疗肿瘤组织研究
为了研究新型靶向金纳米棒肿瘤组织的治疗作用，首先建立了 SKBR3小鼠肿瘤模型，然后将接种了 SKBR3人乳腺癌细胞的Balb/c裸鼠进行随机分组，分组为4组，包括阿霉素对照组、pbs溶液注射对照组、包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组、包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组、纳米金棒注射组。每组Balb/c裸鼠为5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠每次注射按照阿霉素的剂量为5mg/kg (包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组为乙腈打破后标定的量)，纳米金棒注射组浓度与包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组两组中所含纳米金棒浓度为统一标准，每次纳米金棒的注射剂量为2mg/kg。注射5次，平均每3天注射一次(防止单纯阿霉素注射组荷瘤裸鼠副作用导致裸鼠在未完成实验前死亡)。在第一天药物注射时开始记录并随时观察并记录每组接种了 SKBR3人乳腺癌细胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情况，每2天测量器肿瘤大小并对其进行体重称量。肿瘤体积计算方法如下:
肿瘤体积计算公式:长X宽X宽/2
在对荷瘤Balb/c裸鼠进行药物注射后第30天对全部荷瘤的Balb/c裸鼠进行解剖，取出其肿瘤组织，并测量每组荷瘤Balb/c裸鼠的肿瘤组织的质量与体积，并对其进行数据处理。这些结果表明所制备的新型靶向金纳米棒能实现对肿瘤组织的良好治疗。
[0058]本发明充分利用新型靶向金纳米棒的超顺磁性和光热转换特性，通过温敏高分子包裹及靶向修饰，提高其生物相容性和靶向性，赋予其诊断治疗一体化的功能。通过MRI成像实时追踪纳米载体分布吸收，确定肿瘤病灶部位，通过光热转换特性释放出阿霉素，增强了对肿瘤组织的治疗功效。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种双靶向金纳米棒，其特征在于，所述的双靶向金纳米棒由两亲性温敏复合物包裹金纳米棒和阿霉素，并在其表面修饰靶向分子。
2.根据权利要求1所述的双靶向金纳米棒，其特征在于，所述的两亲性温敏复合物为温敏高分子K3、温敏高分子09JA、Mal-PEG-DSPE和卵磷脂材料制备的复合物。
3.根据权利要求1所述的双靶向金纳米棒，其特征在于，所述的靶向分子为ant1-Her2-Fab抗体、天冬氨酸或叶酸。
4.根据权利要求1所述的双靶向金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤: A、利用CTAB金种子生长法制备金纳米棒； B、通过温敏高分子K3、温敏两亲性高分子09JA、Mal-PEG-DSPE及卵磷脂PC制备温敏复合材料； C、利用温敏复合材料的亲水、疏水作用，把金纳米棒和阿霉素包裹起来； D、通过巯基化的ant1-Her2_Fab抗体对其祀向修饰，即得到双祀向金纳米棒。
5.根据权利要求4所述的双靶向金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述的步骤A为:向 5mL 5X10_4mol/L 氯金酸中依次逐滴加入 5mL 0.2mol/L CTAB 溶液、0.6 mL 0.0lmol/L冷的NaBH4溶液，剧烈搅拌2h后备用；向5mL 0.2mol/L CTAB溶液依次逐滴加入0.15mL0.004 mol/L 的 AgNO3 溶液、5mL 0.001mol/L 氯金酸溶液、75 μ L 的 0.0788mol/L 的抗坏血酸及12 μ L的金种子液，缓慢搅拌10-20h后即得到金纳米棒；以上制备温度为28°C。
6.根据权利要求4所述的双靶向金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述的步骤B为:称取温敏高分子K3与温敏两亲性高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;称取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其体积为0.5ml ;称取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml ;将以上三种配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2进行旋蒸,转速为50r/min,旋转蒸发待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。
7.根据权利要求4所述的双靶向金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述的步骤C为:配制2mg/ml溶剂为PBS溶液的DOX溶液与lmg/ml的纳米金棒溶液进行共混，取3ml对旋蒸成膜后的旋蒸瓶进行洗脱，旋蒸过程中注意避光；洗脱后的溶液避光透析，透析膜为3500KDa，透析液为 18.2 Ω 的 MiIliQ-water。
8.根据权利要求7所述的双靶向金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述的步骤D为:取透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her2-Fab抗体进行连接，其中ant1-Her2-Fab = Mal-PEG-DSPE摩尔比为1:10，室温下孵育2h，摇床轻微摇晃；将联接好的溶液进行透析，透析膜为100KD，在PBS溶液中于4°C。
9.根据权利要求4-8任一所述的制备方法制备的双靶向金纳米棒。
10.根据权利要求1、2、3、9任一所述的双靶向金纳米棒在制备诊断或治疗肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61K47/18GK104338151SQ201410608716
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】李威, 顾申, 张付雷, 蒋成 申请人:中国人民解放军第二军医大学