一种用于提高动物免疫力的麦冬多糖脂质体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于提高动物免疫力的麦冬多糖脂质体的制备方法，称取大豆磷脂190mg和胆固醇23.75mg，加入三氯甲烷15mL，使其溶解；将含麦冬多糖20mg的磷酸盐缓冲溶液5mL缓慢注入三氯甲烷中，后置于冰水浴超声，至形成稳定的W/O型乳剂；然后将乳剂置于旋转蒸发仪上，50℃减压蒸发除去三氯甲烷，使其在瓶壁上形成一层均匀的胶质，后加入PBS 20mL，继续旋转洗脱至胶质完全溶解，经水浴超声20min，形成均匀的麦冬多糖脂质体；最后将其依次通过孔径为0.45μm和0.22μm的微孔滤膜，重复操作两次，最终制得麦冬多糖脂质体。本发明能显著提高麦冬多糖的增强免疫作用。
【专利说明】一种用于提高动物免疫力的麦冬多糖脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜禽生产【技术领域】，涉及一种用于提高动物免疫力的麦冬多糖脂质体 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 麦冬作为传统中药，始载于《神农本草经》，其味甘、微苦，性微寒，入心、肺、胃经， 具有养阴生津、清心润肺的功效，主治肺热燥咳、热病伤阴、肠燥便秘等病症。现代药理研究 表明，麦冬中的主要活性成分麦冬多糖具有较强的免疫促进作用，能够增强巨噬细胞的吞 噬能力，促进机体的体液免疫和细胞免疫，从而发挥良好的免疫增强活性。但由于其高度亲 水性和约2nm的分子尺寸，使得麦冬多糖口服或注射给药后在体内的消除期很短，快速以 原型经肾排泄，在相应的靶组织分布较少，且在体内不稳定。这些不理想的药动学性质限制 了它的临床应用。因此研究新型的麦冬多糖制剂或是选择一种高效的载体以改善麦冬多糖 的相关性质，使其更好的在体内进行代谢，发挥药效作用就显得特别重要。
[0003] 脂质体（liposomes)是一种具有类似生物膜结构的双分子小囊，直径在25? lOOOnm，主要由磷脂和胆固醇组成。磷脂是天然的两性离子表面活性剂，主要含有磷脂酰甘 油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸等成分。其结构分子中磷酸基团部 分具有强烈的极性，称为亲水头部，两个长碳氢链称疏水的尾部。在水中磷脂分子亲水头部 插入水中，脂质体非极性尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体。胆固醇是构 成脂质的另一类物质，具有调节膜流动性的作用，被称为脂质体"流动性缓冲剂"。
[0004] 脂质体，作为现代药物载体研究的内容之一，由于具有增强疗效、提高稳定性、延 长药效、降低毒性和靶向性等优点而日益受到重视。目前，中药脂质体的研究已经成为中药 领域的一大热点。在中药制剂中应用脂质体，可以防止药物快速降解，延缓药物释放而延长 药物在体内的作用时间，提高药物的溶出度和稳定性，增加药物对靶区的指向性，降低对正 常细胞的毒性，提高药物的生物利用度。脂质体用来包埋药物，不但能提高药物的靶向定位 作用，还能减少药物的使用量和降低毒副作用。研究发现药物经脂质体包封后，药代动力学 出现了很大的变化，在体内的分布也发生变化，在血循环中的半衰期延长，毒副作用得到了 明显的改善，而且可以改变药物的溶解性质等。因而，脂质体可以作为一种新型良好的载 体。将麦冬多糖包封于脂质体中，不仅可以避免麦冬多糖的迅速降解作用，而且可以有效维 持其在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度。因而脂质体可以作为麦冬多糖的一种优 良载体。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服麦冬多糖存在的缺陷，提供一种用于提高动物免疫力的麦 冬多糖脂质体的制备方法，首次将麦冬多糖制备成脂质体，建立了麦冬多糖脂质体的制备 方法，优化了制备条件，并将其应用于畜禽生产中。发现麦冬多糖脂质体能显著提高麦冬多 糖的增强免疫作用，提高其生物利用度。
[0006] 其具体技术方案为：
[0007] -种用于提1?动物免疫力的麦冬多糖脂质体的制备方法，称取大?憐脂190mg 和胆固醇23. 75mg，加入三氯甲烷15mL，使其溶解；将含麦冬多糖20mg的磷酸盐缓冲溶液 (PBS，pH = 7.4) 5mL缓慢注入到三氯甲烷中，后置于冰水浴超声，至形成稳定的W/0型乳 齐IJ;然后将乳剂置于旋转蒸发仪上，50°C减压蒸发除去三氯甲烷，使其在瓶壁上形成一层均 匀的胶质，后加入PBS 20mL，继续旋转洗脱至胶质完全溶解，经水浴超声20min，形成均匀 的麦冬多糖脂质体；最后将其依次通过孔径为〇. 45 μ m和0. 22 μ m的微孔滤膜，重复操作两 次，最终制得麦冬多糖脂质体。
[0008] 按照上述方法制备的麦冬多糖脂质体平均包封率为64. 95%、粒径为245nm。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0010] 本发明将麦冬多糖制备成脂质体，不仅可以使药物缓慢地的释放，而且延长了药 效，提高了其生物利用度，且没有副作用。通过本发明的实施，证明将麦冬多糖制成脂质体 后能显著增强动物的免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。主要表现为能够显著提高淋巴细 胞增殖、抗体效价、IFN-Y和IL-2含量以及减少死亡率和发病率，提高保护率。与麦冬多 糖相比，在免疫后期效果更好，具有较强的缓释作用，能够显著增强动物的细胞免疫和体液 免疫。因此麦冬多糖脂质体可以作为研制新型免疫增强药物的材料，为研制新型免疫增强 类药物提供了理论基础和依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是脂药比和膜材比对麦冬多糖脂质体包封率影响的响应面图；
[0012] 图2是脂药比和油水相比对麦冬多糖脂质体包封率影响的响应面图；
[0013] 图3是膜材比和油水相比对麦冬多糖脂质体包封率影响的响应面图；
[0014] 图4是麦冬多糖脂质体的粒径分布图；
[0015] 图5是麦冬多糖脂质体在透射电镜下的形态（30000 X);
[0016] 图6是麦冬多糖脂质体对巨噬细胞吞噬能力的影响（A49tl)注柱上没有相同字 母者差异显著（P< 0.05);下同；
[0017] 图7是麦冬多糖脂质体对巨噬细胞IL-2分泌的影响（pg · mr1);
[0018] 图8是麦冬多糖脂质体对巨噬细胞IL-6分泌的影响（pg · ml/1)。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0020] 1.麦冬多糖脂质体的制备
[0021] 采用逆向蒸发法制备麦冬多糖脂质体。称取大豆磷脂和胆固醇，加入三氯甲烷， 使其溶解；将含麦冬多糖的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH = 7. 4)缓慢注入到三氯甲烷中，后置 于冰水浴超声，至形成稳定的W/0型乳剂；然后将乳剂置于旋转蒸发仪上，50°C减压蒸发除 去三氯甲烷，使其在瓶壁上形成一层均匀的胶质，后加入PBS 20mL，继续旋转洗脱至胶质完 全溶解，经水浴超声20min，形成均匀的麦冬多糖脂质体；最后将其依次通过孔径为0. 45和 0. 22 μ m的微孔滤膜，重复操作两次。最终制得麦冬多糖脂质体。
[0022] 在单因素试验的基础上，选出对脂质体包封率有较显著影响的三个因素：脂药比 (大豆磷脂与麦冬多糖质量比，A)、膜材比（大豆磷脂与胆固醇质量比，B)和油水相比（三 氯甲烷与PBS体积比，C)。再根据脂药比、膜材比和油水相比3个单因素试验所确定的水平 范围，采用Design-Expert 8. O软件进行响应面试验设计，选用Box-Behnken模型，以脂质 体的包封率为响应值（Y)，做3因素3水平共17个试验点（5个中心点）二次回归正交组合 试验。试验设计及结果见表1。对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得出Y 与影响因素之间关系的拟合方程式如下：Y = -374. 78475+39. 46500XA+28. 64113XB+95. 9 0325XC+0. 14938XAXB+1. 86375XAXC+0. 29500XBXC-1. 86550ΧΑ2-1· 84863ΧΒ2-12· 89 950 X C2。
[0023] 表I Box-Behnken试验设计结果
[0024]
【权利要求】
1. 一种用于提高动物免疫力的麦冬多糖脂质体的制备方法，其特征在于，称取大豆磷 脂190 mg和胆固醇23. 75 mg，加入三氯甲烷15 mL，使其溶解；将含麦冬多糖20 mg的磷酸 盐缓冲溶液5 mL缓慢注入到三氯甲烷中，磷酸盐缓冲溶液的pH = 7. 4,后置于冰水浴超声， 至形成稳定的W/0型乳剂；然后将乳剂置于旋转蒸发仪上，50°C减压蒸发除去三氯甲烷，使 其在瓶壁上形成一层均匀的胶质，后加入PBS 20 mL，继续旋转洗脱至胶质完全溶解，经水 浴超声20 min，形成均匀的麦冬多糖脂质体；最后将其依次通过孔径为0. 45 y m和0. 22 y m 的微孔滤膜，重复操作两次，最终制得麦冬多糖脂质体。
【文档编号】A61K9/127GK104490783SQ201410706962
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】范云鹏, 童德文, 马琳, 宋晓平, 张为民 申请人:西北农林科技大学