一种基于透明质酸-难溶性药物前药的自聚纳米系统的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米系统的制备方法，属于有机合成领域或药物制剂领域。包括药物与连接臂的偶联、透明质酸及其铵盐与连接臂偶联、透明质酸-难溶性药物前药合成。基于该前药的自聚纳米系统能在体内达到长循环作用，并具有肿瘤主动靶向性，降低了药物的毒副作用。
【专利说明】一种基于透明质酸-难溶性药物前药的自聚纳米系统的制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及有机合成领域或药物制剂领域。具体涉及透明质酸-难溶性药物前药 自聚纳米系统的制备方法。包括抗肿瘤药物与连接臂的偶联、透明质酸及其铵盐与连接臂 偶联、透明质酸-难溶性药物前药合成。
【背景技术】
[0002] 透明质酸作为一种天然多糖，可以正常的被人体吸收、代谢，具有良好的生物相容 性，己作为多种药物载体使用。透明质酸良好的水溶性可以克服某些药物载体溶解性差的 缺点，同时具有羟基、羧基等可修饰基团便于进行化学修饰且制备条件简便温和。在肿瘤表 面透明质酸受体CD44和RHAMM有过量表达，透明质酸与受体之间的特异性结合使透明质酸 在作为药物载体时具有靶向功能，有望提高药物定向输送能力。由CD44所介导的细胞内吞 作用可以使前药进入肿瘤细胞，以增加难溶性药物的生物利用度。所以，采用透明质酸作为 难溶性药物的载体有望提高药效。
[0003] 透明质酸经过二酰肼改性后形成HA-ADH衍生物，可以将药物分子接到HA-ADH上， 生成HA键合药物，透明质酸可以提供新型药物靶向和控制释放的作用。这个过程一般是： 二酰肼和HA连接后，酰肼剩余NH 2可与HA分子中的其他羧基再连接，会发生分子内或分子 间交联，同时还有剩余册12可以与药物活性部位连接将药物键合到透明质酸上，或药物也可 先与多酰肼连接，再与HA分子接枝，也可得到透明质酸键合药物体系。
[0004] 紫杉醇（Taxol)是由Wall等人于1963年从红豆杉的树皮中提取分离的，它是一 种具有促进微管聚合的抗癌药物，是目前应用最为广泛的抗肿瘤药物之一。然而，紫杉醇虽 然有显著的抗肿瘤作用，但存在难溶于水及半衰期短等特点。现行临床制剂中应用聚氧乙 稀蓖麻油与无水乙醇（50 : 50, v/v)的混合液来稳定紫杉醇，制备成注射剂给药。然而采 用表面活性剂增溶的方法会产生严重的过敏反应，给紫杉醇的广泛应用带来许多障碍。
[0005] 对紫杉醇进行改进制备前药的研宄主要有两类：一种是在原药的基础上对其分 子结构进行改进，引入小分子基团，目的是提高水溶性、降低药物毒副作用；另一种改进方 式是运用载体制备前药，药物为可逆性药物衍生物，在稳定性、选择性、生物利用度以及降 低药物毒副作用等一方面或多方面优于原药，形成药物输送系统（drug deliver system DDs)。与开发全新药物相比，制备药物输送系统更为经济，目标明确，成功率高，已成为新药 研发的有效途径之一。
[0006] 由于纳米型载体在肿瘤治疗过程中利用了肿瘤组织微环境的一些特殊性质，能够 将药物运送到特定的位置同时产生较小的副作用。两亲聚合物分子由于具有亲水端和疏水 端，在水中能够自组装形成疏水端在内亲水端在外的纳米颗粒。以紫杉醇为模版药物的自 组装型透明质酸-抗肿瘤药物给药系统，能够选择性的靶向肿瘤部位，改善化疗药物的体 内药动学特征，降低毒副作用，延长体内滞留时间，提高抗肿瘤疗效。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚纳 米系统的制备方法。目的在于提高紫杉醇的溶解度和生物利用度，并且实现其肿瘤靶向性。
[0008] 为达到上述目的，本发明通过以下技术方案加以实现：
[0009] 本发明提供了一种以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药，其结构 如图1所示。
[0010] 本发明还提供了上述以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚 纳米系统的制备方法，包括如下步骤：
[0011] (1)透明质酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)的合成
[0012] 按摩尔的量计，将一定量透明质酸溶于去离子水中，加入5当量的己二酸二酰肼， 室温搅拌均匀，用0. IM的盐酸调节pH至4. 75,加入1当量的碳二亚胺盐酸盐（EDC .HCl)，每 隔5?IOmin用0. IM的盐酸调节pH使其保持在4. 75左右，反应2?4h，加0. lmol/L氢氧 化钠溶液调节pH至7. 0终止反应。将上述反应液加入Mw3500的透析袋中，依次用0. Imol/ L的氯化钠溶液、25%乙醇水溶液、纯水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜过滤后冻 干即得透明质酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)。
[0013] ⑵透明质酸-紫杉醇（HA-PTX)的合成
[0014] 称取一定量的HA-ADH，溶于pH6. 5的PBS溶液中，加入溶于DMF :水=2 : 1混合 溶剂的紫杉醇-N-羟基丁二酰亚胺酯（Taxol-NHS)，室温搅拌1?2天。将上述反应液加入 Mw3500的透析袋中分别用50%乙醇水溶液和纯水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜 过滤后冻干即得透明质酸-紫杉醇（HA-PTX)。
[0015] (3)透明质酸-紫杉醇自聚纳米粒子的制备
[0016] 称取一定量HA-PTX，用去离子水溶解，探头超声5?10分钟后，用0. 22 μ m的醋酸 纤维素膜过滤即得透明质酸-紫杉醇自聚纳米粒子。
[0017] 其中步骤1所述透明质酸分子量为2000?40000 ;所述透明质酸与紫杉醇的摩尔 比为I : 1?1 : 50。
[0018] 其中步骤1、2所述透析袋截留分子量为1000?4000 ;所述透析时间为1?3天。 其中步骤3所述溶剂为pHl. 0?9. 0的水性环境，探头超声功率为500?1000W，探头超声 时间为5?15分钟。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1以紫杉醇为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米系统结构示意图
[0020] 图 2Taxol-NHS 酯、HA-ADH 和 HA-PTX 的红外谱图
[0021] 图3Taxo I-NHS酯核磁共振氢谱1H NMR
[0022] 图4HA-ADH和HA-PTX的紫外吸收谱图
[0023] 图5自组装型透明质酸-紫杉醇胶束透射电子显微镜（TEM)成像图
[0024] 图6药效学实验肿瘤体积相对变化率经时曲线
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] N-羟基丁二酰亚胺二苯基磷酸盐（SDPP)的合成
[0027] 称取230mgN-羟基丁二酰亚胺溶于二氯甲烷，加入434 μ 1氯代磷酸二苯酯搅拌均 匀，再加入280 μ 1三乙胺，室温搅拌12小时；将反应液加入研钵，加乙醚研磨后用乙酸乙酯 溶解沉淀，分别用去离子水和饱和食盐水洗涤反应液，有机层置于无水硫酸钠中干燥，减压 除去有机相得SDPP。
[0028] 实施例2
[0029] 紫杉醇半琥珀酰盐（PTX-semi)的合成
[0030] 称取540mg紫杉醇和76mg 丁二酸酐溶于二氯甲烷中，加入513 μ 1无水吡啶，室温 搅拌3天；反应液真空浓缩后，采用柱层析法纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和正己烷（体积比为 I : 1 ?I : 3) 〇
[0031] 实施例3
[0032] 紫杉醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Taxol-NHS)的合成
[0033] 称取300mg紫杉醇半琥珀酰盐和164mg N-羟基丁二酰亚胺二苯基磷酸盐溶于乙 腈中，加入176 μ 1三乙胺，室温搅拌24小时；反应液真空浓缩后，采用柱层析法纯化，洗脱 剂为乙酸乙酯和正己烷（体积比为I : 1?1 : 3)。
[0034] 经核磁共振氢谱IH NMR和红外FT-IR对其结构进行鉴定：
[0035] 对氢谱结果进行分析，丁二酰亚胺的两个特征亚甲基峰在2. 33ppm处有一个dd 峰，丁二酸的两个特征亚甲基峰在2. 12ppm处有一个dd峰；对红外结果进行分析，丁二酰亚 胺的两个活泼羰基峰在1818. lcm'1786. 2CHT1处有吸收。以上结果证明了紫杉醇-N-羟基 琥珀酰亚胺酯的结构。
[0036] 实施例4
[0037] 透明质酸-己二酸二酰肼（HA-ADH)的合成
[0038] 称取45mg透明质酸，用去离子水配制成3mg/ml的溶液，加入52mg己二酸二酰肼， 用〇· IM的盐酸调节pH至4. 75,再加入12mg碳二亚胺盐酸盐，保持ρΗ4· 75反应24小时，加 入0. IM氢氧化钠溶液调节pH至7. 0终止反应；将反应液加入Mw3500的透析袋中，依次用 0. lmol/L的氯化钠溶液、25%乙醇水溶液、纯水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜过 滤后冻干即得。
[0039] 经紫外UV和红外FT-IR对其结构进行鉴定。
[0040] 实施例5
[0041] 透明质酸-紫杉醇（HA-PTX)的合成
[0042] 称取30mg透明质酸-己二酸二酰肼，溶于pH6. 5的PBS溶液中，得到浓度为Img/ ml的溶液，加入8mg溶于DMF :水=2 : 1混合溶剂中的紫杉醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯，室 温搅拌24小时；将上述反应液加入Mw3500的透析袋中分别用50%乙醇水溶液和纯水透析 完全，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜过滤后冻干即得。
[0043] 经紫外UV和红外FT-IR对其结构进行鉴定。
[0044] 实施例6
[0045] 自聚型透明质酸-紫杉醇纳米系统的制备
[0046] 称取5mg透明质酸-紫杉醇，用去离子水配制成lmg/ml的溶液，探头超声 IOmin (功率100W，超3s停3s)，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜过滤即得。
[0047] 经透射电子显微镜（TEM)成像对其形态进行验证。
[0048] 实施例7
[0049] 自聚型透明质酸-多西紫杉醇纳米系统的制备
[0050] 称取45mg透明质酸，用去离子水配制成3mg/ml的溶液，加入52mg己二酸二酰肼， 用〇· IM的盐酸调节pH至4. 75,再加入12mg碳二亚胺盐酸盐，保持ρΗ4· 75反应24小时，加 入0. IM氢氧化钠溶液调节pH至7. 0终止反应；将反应液加入Mw3500的透析袋中，依次用 0. lmol/L的氯化钠溶液、25%乙醇水溶液、纯水透析完全，再用0. 22 μ m的醋酸纤维素膜过 滤后冻干。称取30mg透明质酸-己二酸二酰肼，溶于pH6. 5的PBS溶液中，得到浓度为Img/ ml的溶液，加入8mg溶于DMF :水=2 : 1混合溶剂中的多西紫杉醇-N-羟基琥珀酰亚胺 酯，室温搅拌24小时；将上述反应液加入Mw3500的透析袋中分别用50 %乙醇水溶液和纯 水透析完全，再用〇. 22 μ m的醋酸纤维素膜过滤后冻干。称取5mg透明质酸-多西紫杉醇， 用去离子水配制成lmg/ml的溶液，探头超声IOmin (功率100W，超3s停3s)，再用0. 22 μπι 的醋酸纤维素膜过滤即得。
[0051] 实施例8
[0052] 药动学实验
[0053] 雄性SD大鼠6只，随机分为两组，分别尾静脉注射透明质酸-紫杉醇和紫杉醇注 射液，注射剂量5mg/kg，尾静脉给药后分别于0. 083、0. 25、0. 5、l、2、4、8、12h于眼眶静脉丛 取血0. 5ml，置于荡有肝素的离心管内，5000r/min离心IOmin分离血浆。按血浆样品处理 方法，HPLC测定并记录色谱图，根据标准曲线计算血药浓度。
[0054] 计算得药动学参数：
[0055]
【权利要求】
1. 一种基于透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米系统，其特征在于，该前药是在透明 质酸骨架上合成连接臂，通过该连接臂与难溶性药物偶联，使其能在水中自组装形成纳米 粒子，并能靶向药物至肿瘤组织的具有两亲性的透明质酸衍生物。
2. 根据权利要求1所述，难溶性药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、二胺环己烷铂、甲氨蝶 呤、长春花碱、阿托伐他汀钙、硝苯地平、奥美拉唑等。
3. 根据权利要求1所述，具有肿瘤靶向性的以紫杉醇为模版药物的透明质酸-难溶性 药物前药，其特征在于，结构如下所示：
n = 5_30〇
4. 权利要求3所述以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米系统 的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a、 按摩尔的量计，将一定量透明质酸溶于去离子水中，加入5当量的己二酸二酰肼，室 温搅拌均匀，用0. IM的盐酸调节pH至4. 75,加入1当量的碳二亚胺盐酸盐（EDC .HC1)，每 隔5-10min用0. IM的盐酸调节pH使其保持在4. 75左右，反应2-4h，加0. lmol/L氢氧化钠 溶液调节pH至7. 0终止反应。将上述反应液加入Mw3500的透析袋中，依次用0. lmol/L的 氯化钠溶液、25%乙醇水溶液、纯水透析完全，再用0. 22 ym的醋酸纤维素膜过滤后冻干即 得透明质酸-己二酸二酰肼（HA-ADH); b、 称取一定量的HA-ADH，溶于pH6. 5的PBS溶液中，加入溶于DMF :水=2 : 1混合 溶剂的紫杉醇-N-羟基丁二酰亚胺酯（Taxol-NHS)，室温搅拌1-2天，将上述反应液加入 Mw3500的透析袋中分别用50%乙醇水溶液和纯水透析完全，再用0. 22 y m的醋酸纤维素膜 过滤后冻干即得透明质酸-紫杉醇（HA-PTX); c、 称取一定量HA-PTX，用去离子水溶解，探头超声5-10分钟后，用0. 22 y m的醋酸纤维 素膜过滤即得透明质酸-紫杉醇自聚纳米粒子。
5. 根据权利要求4所述以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米 系统的合成方法，其特征在于，所述透明质酸分子量为2000-40000 ;所述透明质酸与紫杉 醇的摩尔比为1 : 1-1 : 50。
6. 根据权利要求4所述以紫杉醇作为模版药物的透明质酸-难溶性药物前药自聚纳米 系统的制备方法，其特征在于，所述透析袋截留分子量为1000-4000 ;所述透析时间为1-3 天。
7.根据权利要求4所述以紫杉醇作为模版药物透明质酸-难溶性药物前药自聚纳 米系统的制备方法，其特征在于，所用溶剂为PHI. 0-9. O的水性环境，探头超声功率为 500-1000W，探头超声时间为5-15分钟。
【文档编号】A61K47/48GK104491875SQ201410809037
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】尹莉芳, 徐超然, 何伟, 秦超, 王柏 申请人:中国药科大学