相关申请本申请要求2013年10月24日提交的标题为“METHODSANDCOMPOSITIONSFORTREATINGCANCER”的美国临时申请No.61/895,308的权益，其内容通过引用方式整体并入本文。有关联邦资助的研发的申明本发明是在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)颁发的NIH拨款/合同第R01CA138212、R01CA133662、RC4CA156509号下借助政府资助进行的。政府享有本发明的某些权利。技术领域本文提供的方法和组合物涉及癌症治疗。在一些实施方案中，所述组合物具有治疗包括多形性成胶质细胞瘤和肺癌的癌症的用途。
背景技术：
美国脑肿瘤登记中心(TheCentralBrainTumorRegistryoftheUnitedStates，CBTRUS)列出了2012年所有50个州和哥伦比亚地区的原发性恶性脑肿瘤死亡总数，估计为13,700例。成胶质细胞瘤(GBM)是最常见的脑恶性肿瘤，尽管进行了由手术切除、术后放射疗法和替莫唑胺化疗组成的标准三联治疗，其在人类中的中位存活期仅为14.6个月。由于这些肿瘤的浸润性及其对放射和化疗的固有耐受性，疗法几乎从不可治愈。甚至用最优治疗，中位存活期也小于15个月，仅10％的患者存活2年而无疾病复发。显然需要新型治疗靶标以提高成胶质细胞瘤和其它癌症患者的存活期和生活品质。此外，尤文氏肉瘤(Ewing’sSarcoma)肿瘤家族(ESFT)是儿童、青少年和青壮年的骨和软组织中发生的高侵袭性肿瘤。它们对化疗有反应，然而尽管进行高剂量的化疗，仍有75％至80％出现转移性ESFT的患者将在五年内死亡(Grier,H.E等，N.Engl.J.Med.348,694-701(2003))。ESFT含有充分表征的染色体易位。这将位于染色体22上的尤文氏肉瘤基因(EWS)与位于染色体11上的常见弗兰德白血病(friendleukemia)插入序列(FLI)1的ets家族基因结合，t(11:22)导致各种融合蛋白表达(AykutUren,JeffreyATorestskyEwing’ssarcomaoncoproteinsEWS-FLI1:theperfecttargetwithoutatherapeuticagent,FutureOncol.1(4)，521-528(2005))。体外和体内研究已证明消除致癌蛋白EWS-FLI1导致ESTF细胞系增殖减少和肿瘤体积减小。EWS-FLI1缺乏酶活性，然而RHA螺旋酶A(RHA)增加了EWS-FLI1-调控的瘤形成，因此两种蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用为维持肿瘤生长所需(HyariyeNErkizan等。AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FlI1interactingwithRHAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing’ssarcoma.NatureMedicine15(7)750-756(2009))。破坏关键蛋白质相互作用的范式可具有治疗包括具有类似易位的肉瘤和具有MLL易位的白血病的疾病的用途((HelmanLJ,MeltzerP.Mechanismsofsarcomadevelopment.NatRevCancer2003；3(9):685-94)；和PuiCH,RellingMV,DowningJR.Acutelymphoblasticleukemia.NEnglJMed2004；350(15):1535-48)。此外，无序蛋白质基于其固有的生化性质可为优良的治疗靶标(ChengY,LeGallT,OldfieldCJ,等。Rationaldrugdesignviaintrinsicallydisorderedprotein.TrendsBiotechnol2006；24(10):435-42)。尽管使用针对EWS-FLI1的反义和siRNA进行了多年体外和异种移植研究，然而基于不充分的递送和稳定性，这些研究中没有一个此前可用作人类疗法。因此，需要治疗病症诸如ESFT的改善疗法。
技术实现要素：
在普遍适用的第一方面(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)，提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，：其中R1选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸,R3、R4、R5、R9、R14、R17和R18各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6是C1-6二烷基胺；R7选自由氢和C1-6烷基组成的组；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；每个R16独立地为氢、-OH或C1-6烷氧基；n为0至4的整数；p是1或3；且虚线代表任选的双键，其中所述的双键具有选自由顺式和反式组成的组的构型，条件是R3、R4、R5、R9和R14中的至少一者选自由-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15组成的组。在普遍适用的第一方面的一个实施方案中(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R1选自由以下组成的组：Leu、Leu-Asp、Leu-Asp-Ala、–CH2–C(＝O)–NHCH2COOH、–CH2–C(＝O)–(CH2)C(CH3)2、在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3是-N(CH3)2。在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3是-SCH3。在普遍适用的第一方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第二方面(即与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)，提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的式I的化合物。在普遍适用的第二方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述受试者是哺乳动物。在普遍适用的第二方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述受试者是人。在普遍适用的第二方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案的任一个独立组合)中，所述癌症选自由肺腺癌和多形性成胶质细胞瘤组成的组。在普遍适用的第二方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述癌症包含易位，所述易位包含选自由FLI1、ETV1、ETV4、ERG、ETS1和ETS2组成的组的ETS基因。在普遍适用的第二方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述化合物肠胃外(parentally)施用。在普遍适用的第三方面(即与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)，提供杀死瘤细胞或抑制瘤细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐接触：其中R1选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、R3、R4、R5、R9和R14各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6是C1-6二烷基胺；R7选自由氢和C1-6烷基组成的组；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；每个R16独立地为氢、-OH或C1-6烷氧基；R17和R18独立地为H或F；n是0至4的整数；p是1或3；且虚线代表任选的双键，其中所述双键具有选自由顺式和反式组成的组的构型，条件是R3、R4、R5、R9和R14中的至少一者选自由-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15组成的组。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案的任一个独立组合)中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R1选自由以下组成的组：Leu、Leu-Asp、Leu-Asp-Ala、-CH2-C(＝O)-NHCH2COOH、-CH2-C(＝O)-(CH2)C(CH3)2、在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3是-N(CH3)2。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3是-SCH3。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述细胞是哺乳动物。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述细胞是人类。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述选自由肺腺癌和多形性成胶质细胞瘤组成的组。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述细胞包含易位，所述易位包含选自由FLI1、ETV1、ETV4、ERG、ETS1和ETS2组成的组的ETS基因。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述细胞在体内。在普遍适用的第三方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，所述细胞是离体的。在普遍适用的第四方面(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，提供了式I的化合物：或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、R3、R4、R5、R9和R14各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–C(＝O)NH2、–NO2、–NH2、–OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–C(＝O)NH2、–NO2、–NH2、–OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6是C1-6二烷基胺；R7选自由氢和C1-6烷基组成的组；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；每个R16独立地为氢、–OH或C1-6烷氧基；R17和R18独立地为H或F；n是0至4的整数；p为1或3；且虚线代表任选的双键，其中所述双键具有选自由顺式和反式组成的组的构型，条件是R3、R4、R5、R9和R14中的至少一者选自由-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15组成的组。在普遍适用的第四方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R1选自由以下组成的组：Leu、Leu-Asp、Leu-Asp-Ala、–CH2–C(＝O)–NHCH2COOH、–CH2–C(＝O)–(CH2)C(CH3)2、在普遍适用的第四方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。在普遍适用的第四方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3为-N(CH3)2。在普遍适用的第四方面的一个实施方案(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)中，R3为-SCH3。在普遍适用的第五方面(即可与本文确定的方面或实施方案中的任一个独立组合)，提供包含式I的化合物的药物组合物。第一至第五方面的一个实施方案的特征中的任一个适用于本文确定的所有方面和实施方案。此外，第一至第五方面的一个实施方案的特征中的任一个可独立地部分或全部与本文所述的其它实施方案以任何方式组合，如一个、两个或三个或更多个实施方案可全部或部分组合。此外，可使第一至第五方面的一个实施方案的特征中的任一个对于其它方面或实施方案是任选的。方法的任何方面或实施方案可使用另一方面或实施方案的化合物进行，并且化合物的任何方面或实施方面可被配置成用于另一方面或实施方案的方法中。附图说明图1显示了NSC635437的结构和某些类似物的遗传结构。图2显示了增加YK-4-279效能的示例性策略。图3A是各种浓度的YK-4-279和PT-1-33对TC71细胞和TC32细胞的生长抑制的图。图3B是各种浓度的YK-4-279、PT-1-33和PT-1-55对TC71细胞的生长抑制的图。图3C是各种浓度的YK-4-279和PT-1-123对TC71细胞的生长抑制的图。图4是用YK-4-279处理且用RHA、EWS-FLI1或总蛋白共沉淀的TC32细胞的蛋白质裂解物的免疫印迹的显微照片。图5A至图5G是测量各种候选剂对EWS-FLI1与RHA结合抑制的ELISA测定中的相对光密度的图。图6A和图6B是显示荧光素酶测定中各种浓度的候选剂的相对荧光素酶活性总体趋势的图，所述荧光素酶测定测量对EWS-FLI1结合至NROB1启动子的抑制。图7A至图7I说明了测量对EWS-FLI1结合至NROB1启动子的抑制的荧光素酶测定中各种浓度的候选剂的荧光素酶活性。图8描绘了癌症基因组学网站界面的cBioPortal。图9描绘了YK-4-279结合至ERG和ETV1，其KD分别为11.7μM和17.9μM，稳态动力学在BiacoreT100仪器上测量。图10描绘了GBM细胞系过表达FLI1，其与YK-4-279敏感性相关。上图：用抗-FLI1探测的免疫印迹。尤文氏肉瘤TC32纳入作为阳性对照。FLI1的预期尺寸，50，EWS-FLI168kDa。下图：IC50和密度测定法的图。图11描绘了与正常脑相比FLI1的GEMM过表达。RNA从对照和遗传修饰小鼠的正常组织和肿瘤组织提取。杂交然后标准化显示了肿瘤但非正常脑组织中的FLI1探针显著升高。图12描绘了FLI1的GBM表达。针对人成胶质细胞瘤中的FLI1的免疫染色显示了许多肿瘤细胞以及血管内皮和炎性细胞中的阳性核染色(40x物镜)。图13A和图13B说明用(S)-YK-4-279或外消旋物治疗三天显示了显著的肿瘤退化。图13A：将具有ES异种移植的小鼠用400mg/kg如指定的化合物或对照处理。从广泛接受的肿瘤(300mm3)开始，将小鼠用6个总剂量的腹腔内化合物处理三天。图13B：来自相同实验的H和E染色的肿瘤。图14说明了ERG诱导了ZEB1和ZEB2的表达，其激活了EMT，从而导致肺癌转移和药物耐受性。图15说明了YK-4-279与ERG蛋白质直接相互作用。将经纯化的重组ERG固定在BiacoreCM5微芯片上，且直接结合至八种不同浓度的YK-4-279(0.1μM-50μM)由SPR测定。稳态KD使用Biaevaluation软件计算。图16A和图16B说明了YK-4-279抑制ERG的转录活性。图16A.用ERG和Id-2报道子荧光素酶构建体共转染的Cos-7细胞的荧光素酶测定。YK-4-279处理降低了Id-2启动子活性而不影响ERG水平(*；p<0.001)。图16B.将VCaP细胞用siERG或YK-4-279处理48小时且测定ERG靶标mRNA和蛋白质水平。YK-4-279处理导致PLAU、ADAM19和PLATmRNA表达减少。还降低了PLAU水平。图17说明了NSCLC细胞系表达ERG蛋白质。指定的NSCLC细胞系的总蛋白质裂解物通过PAGE分离。人ERG蛋白的表达通过蛋白质印迹使用抗-ERG抗体确认(上图)。分子量标志物在左边给出。相等的蛋白质上样通过剥离和用抗-β-肌动蛋白抗体重新印迹相同的膜确认(下图)。图18A和图18B说明了ERG表达诱导了EMT标志物。H358NSCLC细胞用编码人ERG蛋白质的cDNA转染。增加的ERG表达通过蛋白质印迹检测(图18A)。实时PCR分析揭示了在ERG表达细胞中更高的ZEB1和FOXC2表达(图18B)。将数据首先针对18SRNA标准化，然后表达为相对于空载体转染的细胞的倍数诱导。图19说明了YK-4-279抑制NSCLC中的EMT。A549细胞表达了更高水平的ZEB1和FOXC2(在增加的TGF-β表达的情况下)和降低的水平(在YK-4-279对ERG抑制的情况下)。将数据首先针对18SRNA标准化，然后倍数表达通过除以每个组的对照来计算。具体实施方式以下描述和实施例详细说明了本文公开的发明的一些示例性实施方案。本领域的技术人员将认识到本发明存在由本发明范围涵盖的多种变型和改变。因此，某个示例性实施方案的描述不应被视为限制本发明的范围。使用表面等离子体共振，针对EWS-FLI1结合筛选三千个小分子的NCI/DTP文库。化合物NSC635437被选为用于进一步优化和进一步研究的适合候选物(图1)。在第一系列的经设计的类似物中，YK-4-279是最有活性的(图2)。YK-4-279已显示可功能性抑制EWS-FLI1细胞和ESFT细胞，且导致半胱天冬酶-3活性增加(HyariyeNErkizan等，AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FlI1interactingwithRHAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing’ssarcoma.NatureMedicine15(7)750-756(2009))。本申请涉及改善的化合物和使用此类化合物治疗病症诸如肺腺癌、多形性成胶质细胞瘤和包含易位的癌症的方法，所述易位包含选自由FLI1、ETV1、ETV4、ERG、ETS1和ETS2组成的组的ETS基因。与本文提供的那些方法和组合物一起使用的其它方法和组合物公开于国际公布号WO2008/083326；美国公布No.2010/0167994；美国临时申请No.61/623349；和国际公布号WO2013/155341中，其公开内容通过引用方式整体明确并入本文。定义如本文所用，任何“R”基团诸如不限于R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、Ra、Rb，代表可连接至指定原子的取代基。R基团可为取代的或未取代的。如果两个“R”基团被描述为“连接在一起”，则所述R基团和它们连接的原子可形成环烷基、芳基、杂芳基或杂环。例如不限于，如果NR1aR1b基团的R1a和R1b被指定为“连接在一起”，则其意指它们彼此共价键合以形成环：每当基团被描述为“任选取代的”时，基团可为未取代的或被一个或多个指定的取代基取代。同样地，当基团被描述为“未取代的或取代的”时，如果取代，则所述取代基可选自一个或多个指定的取代基。如果没有指定取代基，则其意为指定的“任选取代的”或“取代的”基团可被一个或多个个别地且独立选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、经保护的羟基、烷氧基、芳基氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、经保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸根、硫代氰酸根、异硫代氰酸根、硝基、甲硅烷基、氧硫基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、氨基、单取代的氨基和二取代的氨基基团及其经保护的衍生物。如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”是指烷基、烯基或炔基基团中碳原子的数目，或者环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基基团的环中碳原子的数目。即烷基、烯基、炔基、环烷基环、环烯基环、环炔基环、芳基环、杂芳基环或杂脂环基环可含有“a”至“b”个(端值包括在内)碳原子。因此，例如“C1至C4烷基”基团是指所有具有1至4个碳原子的烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。如果没有就烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基基团指定“a”和“b”，则假定这些定义中描述的最宽范围。如本文所用，“烷基”是指包含完全饱和(无双键或三键)烃基团的直链或支链烃链。所述烷基基团可具有1至20个碳原子(每当其在本文出现时，数值范围诸如“1至20”是指给定范围内的每个整数；如“1至20个碳原子”意指所述烷基基团可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等(多达且包括20个碳原子)组成，尽管当没有指定数值范围时，本定义还覆盖了术语“烷基”的出现)。所述烷基基团还可为具有1至10个碳原子的中等尺寸的烷基。所述烷基基团还可为具有1至6个碳原子的低级烷基。所述化合物的烷基基团可被命名为“C1-C4烷基”或类似名称。仅举例来说，“C1-C4烷基”表明烷基链中存在一至四个碳原子，即所述烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。所述烷基基团可为取代的或未取代的。如本文所用，“烯基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个双键的烷基基团。烯基基团可为未取代的或取代的。如本文所用，“炔基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个三键的烷基基团。炔基基团可为未取代的或取代的。如本文所用，“环烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环系统。当由两个或多个环组成时，所述环可以稠合形式连接在一起。环烷基基团可在环中含有3至10个原子或在环中含有3至8个原子。环烷基基团可为未取代的或取代的。典型的环烷基基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。如本文所用，“环烯基”是指在至少一个环中含有一个或多个双键的单环或多环烃环系统；尽管如果存在大于一个的双键，则所述双键不能在所有环内形成完全离域的派电子系统(否则所述基团将为如本文所定义的“芳基”)。当由两个或更多个环组成时，所述环可以稠合形式连接在一起。环烯基基团可为未取代的或取代的。如本文所用，“环炔基”是指在至少一个环中含有一个或多个三键的单环或多环烃系统。如果存在大于一个的三键，则所述三键不能在所有环内形成完全离域的派电子系统。当由两个或更多个环组成时，所述环可以稠合形式连接在一起。环炔基基团可为未取代的或取代的。如本文所用，“芳基”是指在所有环内具有完全离域的派电子系统的碳环(全碳)单环或多环的芳族环系统(包括其中两个碳环共享一个化学键的稠环系统)。芳基基团内的碳原子数目可变化。例如，所述芳基基团可为C6-C14芳基基团、C6-C10芳基基团或C6芳基基团。芳基基团的实例包括但不限于苯、萘和薁。芳基基团可为取代的或未取代的。如本文所用，“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子的单环或多环芳族环系统(具有完全离域的派电子系统的环系统)，所述杂原子即除了碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫。杂芳基基团环中原子的数目可变化。例如，杂芳基基团可在环中含有4至14个原子、在环中含有5至10个原子或者在环中含有5至6个原子。此外，术语“杂芳基”包括稠环系统，其中两个环诸如至少一个芳基环和至少一个杂芳基环或者至少两个杂芳基环共享至少一个化学键。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、恶唑、苯并恶唑、1,2,3-恶二唑、1,2,4-恶二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异恶唑、苯并异恶唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉和三嗪。杂芳基基团可为取代的或未取代的。如本文所用，“杂环基”或“杂脂环基”是指三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、多达18元的单环、双环和三环环系统，其中碳原子连同1至5个杂原子一起构成所述环系统。杂环可任选地含有一个或多个以此类方式排位的未饱和的键，然而完全离域的派电子系统不在所有环内存在。杂原子是除了碳以外的元素，包括但不限于氧、硫和氮。杂环可另外含有一个或多个羰基或硫代羰基官能团，以使得所述定义包括氧代-系统和硫代-系统，诸如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺和环状氨基甲酸酯。当由两个或更多个环组成时，所述环可以稠合形式连接在一起。另外地，杂脂环族中任何氮可被季铵化。杂环基或杂脂环族基团可为未取代的或取代的。此类“杂环基”或“杂脂环基”基团的实例包括但不限于1,3-二恶英、1,3-二恶烷、1,4-二恶烷、1,2-二恶茂烷、1,3-二恶茂烷、1,4-二恶茂烷、1,3-氧硫杂环已烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,4-氧硫杂环已烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-恶嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三氧杂环己烷、六氢-1,3,5-三嗪、咪唑啉、咪唑啉啶、异恶唑啉、异恶唑烷、恶唑啉、恶唑烷、恶唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷酮(pyrrolidione)、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢硫代吡喃、硫杂吗啉、硫杂吗啉亚砜、硫杂吗啉砜及其苯并稠合的类似物(如苯并咪唑烷酮、四氢喹啉、3,4-亚甲基二氧基苯基)。如本文所用，“芳烷基”和“芳基(烷基)”是指经由低级亚烷基基团连接的作为取代基的芳基基团。芳烷基的低级亚烷基和芳基基团可为取代的或未取代的。实例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。如本文所用，“杂芳烷基”和“杂芳基(烷基)”是经由低级亚烷基基团连接的作为取代基的杂芳基基团。杂芳烷基的低级亚烷基和杂芳基基团可为取代的或未取代的。实例包括但不限于2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异恶唑基烷基和咪唑基烷基及其苯并稠合的类似物。“(杂脂环基)烷基”和“(杂环基)烷基”是指经由低级亚烷基基团连接的作为取代基的杂环基团或杂脂环基基团。(杂脂环基)烷基的低级亚烷基和杂环基可为取代的或未取代的。实例包括但不限于(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氢-2H-硫代吡喃-4-基)甲基和(1,3-噻嗪烷-4-基)甲基。“低级亚烷基基团”是直链-CH2-栓系基团，形成键以经由其末端碳原子连接分子片段。实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)和亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)。低级亚烷基基团可通过用在“取代的”定义下列出的取代基替代低级亚烷基基团的一个或多个氢而取代。如本文所用，“烷氧基”是指式–OR，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基，如上所定义。烷氧基的非限制性列表是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。烷氧基可为取代的或未取代的。如本文所用，“酰基”是指经由羰基基团连接的作为取代基的氢、烷基、烯基、炔基或芳基。实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。酰基可为取代的或未取代的。如本文所用，“羟烷基”是指其中一个或多个氢原子被羟基基团替代的烷基基团。示例性羟烷基基团包括但不限于2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基和2,2-二羟乙基。羟烷基可为取代的或未取代的。如本文所用，“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤素替代的烷基基团(如单-卤代烷基、二-卤代烷基和三-卤代烷基)。此类基团包括但不限于氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟甲基、2-氟异丁基。卤代烷基可为取代的或未取代的。如本文所用，“卤代烷氧基”是指其中一个或多个氢原子被卤素替代的烷氧基基团(如单-卤代烷氧基、二-卤代烷氧基和三-卤代烷氧基)。此类基团包括但不限于氯甲氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-氯-2-氟甲氧基和2-氟异丁氧基。卤代烷氧基可为取代的或未取代的。如本文所用，“芳基氧基”和“芳硫基”是指RO-和RS-，其中R是芳基，诸如但不限于苯基。芳基氧基和芳硫基两者可为取代的或未取代的。“氧硫基”或“硫代”基团是指“-SR”基团，其中R可为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。氧硫基可为取代的或未取代的。术语““氧硫基”或“硫代”包括但不限于–SH基团(也被称为“硫醇”基团)以及–SRA基团(当RA不是氢时，也被称为“硫代醚”)。“亚硫酰基”基团是指“-S(＝O)-R”基团，其中R可与就氧硫基所定义的一样。亚硫酰基可为取代的或未取代的。“磺酰基”基团是指“SO2R”基团，其中R可与就氧硫基所定义的一样。磺酰基可为取代的或未取代的。“O-羧基”基团是指“RC(＝O)O-”基团，其中R可为如本文所定义的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-羧基可为取代的或未取代的。术语“酯”和“C-羧基”是指“-C(＝O)OR”基团，其中R可与就O-羧基所定义的一样。酯和C-羧基可为取代的或未取代的。“硫代羰基”基团是指“-C(＝S)R”基团，其中R可与就O-羧基所定义的一样。硫代羰基可为取代的或未取代的。“三卤代甲烷磺酰基”基团是指“X3CSO2-”基团，其中X是卤素。“三卤代甲烷亚磺酰氨基”基团是指“X3CS(O)2N(RA)-”基团，其中X是卤素且RA是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。如本文所用的术语“氨基”是指–N(R)2基团，其中R独立地为选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。氨基可为取代的或未取代的。术语“氨基”包括但不限于–NH2基团(也被称为“铵”基团)、–NHR基团(当R不是氢时，也被称为“仲胺”)或–NR2基团(当R不是氢时，也被称为“叔胺”)。如本文所用，术语“羟基”是指–OH基团。“氰基”基团是指“-CN”基团。如本文所用的术语“叠氮”是指–N3基团。“异氰酸根”基团是指“-NCO”基团。“硫代氰酸根”基团是指“-CNS”基团。“异硫代氰酸根”基团是指“-NCS”基团。“巯基”基团是指“-SH”基团。“羰基”基团是指C＝O基团。“S-亚磺酰氨基”基团是指“-SO2N(RARB)”基团，其中RA和RB可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。S-亚磺酰氨基可为取代的或未取代的。“N-亚磺酰氨基”基团是指“RSO2N(RA)-”基团，其中R和RA可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-亚磺酰氨基可为取代的或未取代的。“O-氨甲酰基”基团是指“-OC(＝O)N(RARB)”基团，其中RA和RB可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-氨甲酰基可为取代的或未取代的。“N-氨甲酰基”基团是指“ROC(＝O)N(RA)-”基团，其中R和RA可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-氨甲酰基可为取代的或未取代的。“O-硫代氨甲酰基”基团是指“-OC(＝S)-N(RARB)”基团，其中RA和RB可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-硫代氨甲酰基可为取代的或未取代的。“N-硫代氨甲酰基”基团是指“ROC(＝S)N(RA)-”基团，其中R和RA可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-硫代氨甲酰基可为取代的或未取代的。“C-酰氨基”基团是指“-C(＝O)N(RARB)”基团，其中RA和RB可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。C-酰氨基可为取代的或未取代的。“N-酰氨基”基团是指“RC(＝O)N(RA)-”基团，其中R和RA可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-酰氨基可为取代的或未取代的。如本文所用的术语“卤素原子”或“卤素”意指元素周期表第7列的放射稳定性原子的任一种，诸如氟、氯、溴和碘。当取代基的数目不指定时(如卤代烷基)，可能存在一个或多个取代基。例如“卤代烷基”可包含一个或多个相同或不同的卤素。作为另一个实例，“C1-C3烷氧基苯基”可包含一个或多个相同或不同的含有一个、两个或三个原子的烷氧基基团。如本文所用，除非另外说明，否则任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写符合其常见用法、公认缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(CommissiononBiochemicalNomenclature)(参见Biochem.11:942-944(1972))。应理解本文所述的化合物可经同位素标记。用同位素诸如氘取代可得到由于更佳的代谢稳定性导致的某些治疗优势，诸如例如增加的体内半寿期或减少的剂量需求。如在化合物结构中表示的每个化学元素可包含所述元素的同位素。例如，在化合物结构中，氢原子可明确地公开或理解为存在于所述化合物中。在化合物的氢原子可存在的任何位置处，所述氢原子可为氢的任何同位素，包括但不限于氢-1(氕)和氢-2(氘)。因此，除非上下文另有明确说明，否则本发明引用的化合物涵盖所有潜在的同位素形式。应理解本文所述的方法和组合包括晶型(也被称为多晶型物，其包括化合物的相同元素组合物的不同晶体堆积排列)、无定形相、盐、溶剂化物和水合物。在一些实施方案中，本文所述的化合物以具有药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇等的溶剂化形式存在。在其它实施方案中，本文所述的化合物以非溶剂化形式存在。溶剂化物含有化学计量或非-化学计量量的溶剂，并且可在与药学上可接受的诸如水、乙醇等溶剂结晶过程期间形成。当在所述溶剂为水时形成水合物，或者当在所述溶解为醇时形成醇化物。此外，本文提供的化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在。通常，出于本文提供的化合物和方法的目的，所述溶剂化形式被认为与非溶剂化形式等效。在提供值的范围的情况下，应理解上限和下限及所述范围的上限和下限之间的每个插入值涵盖在实施方案内。某些合成方法在一些实施方案中，将适当的苯乙酮(4.0当量)和催化量的二乙胺(10滴)添加至4,7-二氯靛红(1.0当量)于甲醇(5mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌直至起始材料(4,7-二氯靛红)完全消失。将所得的溶液浓缩并施加至用己烷/乙酸乙酯洗脱的快速色谱，以得到定量产率的纯产物。通过用己烷/乙酸乙酯重结晶进行进一步纯化。NMR光谱使用针对1H(400MHz)的Varian-400光谱仪记录，化学位移(δ)以ppm低磁场(downfield)给出(四甲基硅烷作为内标)，且耦合常数(J-值)按赫兹(Hz)计。元素分析由AtlanticMicrolabs进行。本文提供的某些化合物可根据以下合成方案制备。在这些方案中，将酮(4.0当量)和催化量的二乙胺(10滴)添加至经取代的靛红(1.0当量)于甲醇(5mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌直至起始材料(经取代的靛红)完全消失。将所得的溶液浓缩并施加至用己烷/乙酸乙酯洗脱的快速色谱，以得到定量产率的纯产物。通过用己烷/乙酸乙酯重结晶进行进一步纯化。在连接两个环系统的基团中掺入碳-碳双键的抑制剂可从相应的饱和抑制剂或通过还原所述化合物使用本领域已知的合成技术制备。某些化合物本文提供的某些化合物包括具有式I的化合物：或其药学上可接受的盐，其中，R1选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、R3、R4、R5、R9、R14、R17和R18各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–C(＝O)NH2、–NO2、–NH2、–OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、–C(＝O)NH2、–NO2、–NH2、–OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6是C1-6二烷基胺；R7选自由氢和C1-6烷基组成的组；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；每个R16独立地为氢、–OH或C1-6烷氧基；n是0至4的整数；p是1或3；且虚线代表任选的双键，其中所述双键具有选自由顺式和反式组成的组的构型，条件是R3、R4、R5、R9和R14中的至少一者选自由-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15组成的组。在一些实施方案中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：Leu、Leu-Asp、Leu-Asp-Ala、–CH2–C(＝O)–NHCH2COOH、–CH2–C(＝O)–(CH2)C(CH3)2、在一些实施方案中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。在一些实施方案中，R3是-N(CH3)2。在一些实施方案中，R3是-SCH3。在一些实施方案中，式I的化合物是：或其药学上可接受的盐。根据存在的取代基，小分子抑制剂可呈药学上可接受的盐的形式。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是广义术语，并且用于向本领域普通技术人员(并且不限于特定或定制含义)给出其普通和习惯含义，并且是指但不限于由药学上可接受的无毒酸或碱制备的盐。适合的药学上可接受的盐包括金属盐，如铝盐、锌盐、碱金属盐诸如锂盐、钠盐和钾盐、碱土金属盐诸如钙盐和镁盐；有机盐，如赖氨酸、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因和tris的盐；游离酸和碱的盐；无机盐，如硫酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐；及当前药学广泛使用且列于本领域技术人员熟知的来源(诸如例如TheMerckIndex)中的其它盐。可选择任何合适的成分以制备本文讨论的治疗剂的盐，条件是其是无毒性的并且基本上不干扰所需活性。优选的实施方案的化合物可包括异构体、外消旋物、光学异构体、对映异构体、非对映异构体、互变异构体和顺式/反式构象异构体。所有此类异构体形式包含在优选的实施方案中，包括其混合物。如上文所讨论，优选的实施方案的化合物可具有手性中心，例如它们可含有不对称碳原子并可因此以对映异构体或非对映异构体及其混合物的形式存在，如外消旋物。不对称碳原子可以(R)-、(S)-或(R,S)-构型存在，优选以(R)-或(S)-构型存在，或者可以混合物形式存在。如所需，可根据常规方法分离异构体混合物以获得纯异构体。所述化合物可呈无定形形式或呈结晶型。优选的实施方案的化合物的晶型可以多晶型物存在，其被包含在优选的实施方案内。此外，优选的实施方案的一些化合物还可与水或其它有机溶剂形成溶剂化物。此类溶剂化物类似地包含在优选的实施方案的范围内。某些药物组合物通常优选的是施加静脉内或皮下单位剂型的优选的实施方案的抑制剂；然而，还考虑了其它施用途径。考虑的施用途径包括但不限于经口、肠胃外、静脉内和皮下。优选的实施方案的抑制剂可被配制为用于如经口施用的液体制剂。适合的形式包括混悬剂、糖浆剂、酏剂等。特别优选的用于经口施用的单位剂型包括片剂和胶囊。经配置用于每天施用一次的单位剂型是特别优选的；然而，在某些实施方案中，可能需要配置单位剂型以用于每天施用两次或更多次。优选的实施方案的药物组合物优选与接受者的血液或其它体液等渗。所述组合物的等渗性可使用酒石酸钠、丙二醇或者其它无机或有机溶质获得。氯化钠是特别优选的。可采用缓冲剂，诸如乙酸和盐、柠檬酸和盐、硼酸和盐及磷酸和盐。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer’sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或非挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些补充剂)等。药物组合物的粘度可使用药学上可接受的增稠剂维持在所选的水平。甲基纤维素是优选的，因为其容易获得且经济可行及容易起作用。其它适合的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。优选的增稠剂浓度将取决于所选的增稠剂。优选使用将获得所选粘度的量。粘性组合物通常通过添加此类增稠剂从溶液制备。药学上可接受的防腐剂可用于提高药物组合物的保质期。苄基醇可为适合的，尽管还可采用多种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇或苯扎氯铵。防腐剂的适合浓度典型地为基于所述组合物总重量的约0.02％至约2％，尽管根据所选的试剂更大或更小的量可为所需的。如前文所述的还原剂可有利地用于维持所述制剂的良好保质期。优选的实施方案的抑制剂可与适合的载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等掺混，并可含有辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加物、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于施用途径和所需制剂。参见如“Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy”，LippincottWilliams&Wilkins，第20版(2003年6月1日)和“Remington’sPharmaceuticalSciences”MackPub.Co.，第18和19版(分别为1985年12月和1990年6月)。此类制剂可包括络合剂、金属离子、聚合物化合物诸如聚乙酸、聚羟基乙酸、水凝胶、葡聚糖等、脂质体、微乳、胶束、单层囊泡或多层囊泡、红细胞血影或球芽。适用于脂质体制剂的脂类包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、胆酸等。此类另外组分的存在可影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率及体内清除率，并因此根据预期应用选择，使得载体的特征根据所选施用途径定制。对于经口施用，所述药物组合物可被提供为片剂、水性混悬剂或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂或酏剂。预期用于经口使用的组合物可根据药物组合物制造领域已知的任何方法制备，并可包含一种或多种以下试剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。水性混悬剂可含有与适用于制造水性混悬剂的赋形剂掺混的活性成分。用于经口使用的制剂还可被提供为硬明胶胶囊，其中将活性成分与惰性固体稀释剂诸如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者提供为软明胶胶囊。在软胶囊中，所述抑制剂可溶于或混悬于适合的液体、诸如水或油介质中，油介质诸如花生油、橄榄油、脂肪酸、液体石蜡或液体聚乙二醇。还可使用经配制用于经口施用的稳定剂和微球。胶囊可包括由明胶制备的推入适配胶囊以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制备的软密封的胶囊。所述推入适配胶囊可含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)及任选的稳定剂掺混的活性成分。片剂可为未包衣的或通过已知方法包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并从而提供历经较长时间的持续作用。例如，可使用延时材料，诸如甘油单硬脂酸酯。当以诸如片剂形式的固体形式施用时，所述固体形式典型地包含约0.001重量％或更小至约50重量％或更大的活性成分，优选约0.005重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％或1重量％至约2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％或45重量％。片剂可含有与无毒性的药学上可接受的赋形剂(包括惰性材料)掺混的活性成分。例如，片剂可通过压制或模制，任选用一种或多种另外成分制备。压制的片剂可通过在适合的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式(诸如粉剂或颗粒剂)的活性成分来制备。经模制的片剂可通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化抑制剂的混合物制备。优选地，每个片剂或胶囊含有约1mg或更小至约1,000mg或更大的优选的实施方案的抑制剂、更优选约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg至约150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg或900mg。最优选地，片剂或胶囊以一定范围的剂量提供以允许施用分割的剂量。适于患者的剂量和待每日施用的剂量的数目可因此方便地选择。在某些实施方案中，可优选的是将两种或更多种待施用的治疗剂合并成单一片剂或其它剂型(如在组合疗法中)；然而，在其它实施方案中，可优选地以单独的剂型提供治疗剂。适合的惰性材料包括稀释剂，诸如碳水合物、甘露醇、乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖、淀粉等，或者无机盐，诸如三磷酸钙、磷酸钙、磷酸钠、碳酸钙、碳酸钠、碳酸镁和氯化钠。崩解剂或粒化剂可包含在制剂中，例如淀粉，诸如玉米淀粉、藻酸、羟基乙酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧基甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土、不可溶阳离子交换树脂、粉末化树胶，诸如琼脂、刺梧桐树胶或黄蓍胶，或藻酸或其盐。粘合剂可用于形成硬片剂。粘合剂包括来自天然产物的材料，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。润滑剂，诸如硬脂酸或其镁盐或钙盐、聚四氟乙烯、液体石蜡、植物油和蜡、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、聚乙二醇、淀粉、滑石、热解硅石、水合硅铝酸盐等可包含在片剂制剂中。还可采用表面活性剂，例如阴离子去污剂，诸如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠、阳离子表面活性剂，诸如苯扎氯铵或苄索氯铵，或非离子去污剂，诸如聚氧乙烯氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素或羧甲基纤维素。可采用控释制剂，其中将氨磷汀或其类似物掺入至惰性基质中，这允许通过扩散或浸出机制释放。还可将缓慢变性基质掺入至制剂中。其它递送系统可包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。可使用包衣，例如非肠溶材料，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇，或肠溶材料，诸如邻苯二甲酸酯。可添加着色剂或颜料以便鉴定或表征抑制剂剂量的不同组合。当以液体形式经口施用时，可添加液体载体至活性成分，液体载体诸如水、石油、动物来源油或植物来源油(诸如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油或合成油)。生理盐水溶液、右旋糖或者其它糖溶液或者二醇(诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)也为适合的液体载体。所述药物组合物还可呈水包油乳剂的形式。油相可为植物油(诸如橄榄油或花生油)、矿物油(诸如液体石蜡)或其混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，诸如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，诸如去水山梨糖醇单油酸酯，及这些偏酯与氧化乙烯的缩合产物，诸如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂还可含有甜味剂和调味剂。还可采用经肺递送。将所述化合物在吸入的同时递送至肺部和横穿穿过肺上皮内衬至血流。可采用经设计用于经肺递送治疗产物的各种机械装置，所述机械装置包括但不限于雾化器、定量吸入器和粉末吸入器，所有所述装置是本领域技术人员所熟悉的。这些装置采用适用于分散化合物的制剂。典型地，每种制剂对于采用的装置类型是特异性的，并可涉及除了用于疗法中的稀释剂、佐剂和/或载体之外使用适当的推进剂材料。所述化合物和/或其它任选的活性成分有利地被制备用于以具有以下平均粒径的微粒形式经肺递送：0.1μm或更小至10μm或更大、更优选约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm或0.9μm至约1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm或9.5μm。用于经肺递送抑制剂的药学上可接受的载体包括碳水化合物，诸如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂中的其它成分可包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可使用天然的或合成的表面活性剂，包括聚乙二醇和葡聚糖，诸如环葡聚糖。还可使用胆汁盐和其它相关的增强剂以及纤维素和纤维素衍生物及氨基酸。还可使用脂质体、微胶囊、微球、包合配合物和其它类型的载体。适合与喷射或超声雾化器一起使用的药物制剂典型地包含溶解或混悬于水中的约0.01mg或更小至100mg或更大的抑制剂/mL溶液、优选约0.1mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg至约15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL或90mg/mL溶液的浓度的抑制剂。所述制剂还可包含缓冲液和简单糖(如用于蛋白质稳定化和调控渗透压)。雾化器制剂还可含有表面活性剂以减少或预防在形成气雾剂期间由雾化溶液导致的表面诱导的抑制剂聚集。与定量吸入器装置一起使用的制剂通常包含细分粉末，所述细分粉末含有在表面活性剂的帮助下混悬于推进剂中的活性成分。所述推进剂可包括常见的推进剂，诸如氯氟碳化合物、氢氯氟碳化合物、氢氟碳化合物和烃。优选的推进剂包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、1,1,1,2-四氟乙烷及其组合。适合的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂和油酸。用于从粉末吸入器装置分散的制剂包含细分的干粉，所述干粉以促进从所述装置分散粉末的量含有抑制剂，任选地包括膨胀剂，诸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，所述量典型地约1重量％或更小至99重量％或更大的制剂、优选约5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％或50重量％至约55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％或90重量％的制剂。当优选的实施方案的化合物通过静脉内、肠胃外或其它注射施用时，其优选地呈无热原的、肠胃外可接受的水溶液或油性混悬剂的形式。混悬剂可根据本领域熟知的方法使用适合的分散剂或润湿剂和助悬剂配制。具有适合的pH、等渗性、稳定性等的可接受的水溶液的制剂在本领域技术范围内。优选的用于注射的药物组合物优选地含有等渗媒介物，诸如1,3-丁二醇、水、等渗氯化钠溶液、林格氏溶液、右旋糖溶液、右旋糖和氯化钠溶液、乳酸林格氏溶液或者本领域已知的其它媒介物。此外，无菌非挥发性油通常可用作溶剂或助悬介质。为了该目的，可采用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(诸如油酸)可同样地用于可注射制剂的制备中。所述药物组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。注射的持续时间可根据各种因素调整，并可包括在数秒或更短时间期间施用的单次注射至0.5小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或更久的连续静脉内施用。优选的实施方案的化合物可另外地采用药物组合物通常以其领域确定的形式且以其领域确定的水平存在的辅助组分。因此，例如，所述组合物可含有组合疗法所用的另外的可相容的药学上活性的材料(诸如补充抗微生物剂、止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、抗炎性剂、还原剂、化疗剂等)，或者可含有可用于物理配制优选的实施方案中的各种剂型的材料，诸如赋形剂、染料、增稠剂、稳定剂、防腐剂或抗氧化剂。可与优选的实施方案的化合物组合使用的抗癌剂包括但不限于长春花生物碱，诸如长春碱和长春新碱；蒽环类，诸如多柔比星、柔红霉素、表柔比星；蒽类，诸如比生群(bisantrene)和米托蒽醌；鬼臼毒素，诸如依托泊苷和替尼泊苷；及其它抗癌药物，诸如放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、甲氨蝶呤、多西他赛、依托泊苷(VP-16)、紫杉醇、多西他赛和阿霉素)；及免疫抑制剂(如环孢霉素A、他克莫司)。在一些实施方案中，本文提供的化合物、组合物和方法可与以下组合：组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC)、极光激酶抑制剂、去甲基化剂(诸如5-AZA胞苷)、用天然杀伤细胞进行的免疫疗法、IGF-IR抗体、尤文氏抗原抗体、免疫抑制药物和羟基脲。组蛋白脱乙酰酶抑制剂的实例包括伏林司他(vorinostat)、罗咪酯肽(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、丙戊酸、贝林司他(belinostat)、莫替司他(mocetinostat)、吉维司他(givinostat)和曲古抑菌素A。极光激酶抑制剂的实例包括ZM447439、橘皮苷(hesperadin)和VX-680。去甲基化剂的实例包括5-氮杂胞苷、5-氮杂脱氧胞苷和普鲁卡因。免疫抑制药物的实例包括6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤。某些试剂盒优选的实施方案的化合物可以试剂盒的形式提供给施用医师或其它健康护理专业人员。所述试剂盒是容纳了含有在适合的药物组合物中的化合物的容器和用于将所述药物组合施用至受试者的说明书的成套组件(package)。所述试剂盒还可任选地含有一种或多种另外的治疗剂，如当前用于治疗本文所述的肉瘤的化疗剂。例如，可提供含有一种或多种包含与一种或多种另外的化疗剂组合的优选实施方案的化合物的组合物的试剂盒，或者可提供含有优选的实施方案的抑制剂和另外的治疗剂的单独药物组合物。所述试剂盒还可含有用于连续或顺序施用的单独剂量的优选的实施方案的化合物。所述试剂盒可任选地含有一种或多种诊断工具和使用说明书。所述试剂盒可含有适合的递送装置(如注射器等)连同用于施用所述抑制剂和任何其它治疗剂的说明书。所述试剂盒可任选地含有用于保存、复溶(如果适用)和施用包含的任一种或全部治疗剂的说明书。所述试剂盒可包括多个反映待向受试者施用的数目的容器。某些治疗方法本文提供的一些实施方案涉及治疗尤文氏肉瘤家族肿瘤(ESFT)的方法。ESFT含有独特的融合蛋白质EWS-FLI1。ESFT感染3岁至40岁的患者，其中大部分病例发生在第二个十年。尽管ESFT所来源的胚胎学细胞类型未知，但肿瘤通常极为贴近骨骼生长，但可以软组织团块存在。超过40％的呈现出具有局灶性肿瘤的患者将形成复发性疾病并且这些患者的大部分将死于ESFT，同时75％-80％的呈现出具有转移性ESFT的患者将在5年内死亡，尽管进行了高剂量化疗(GrierHE,KrailoMD,TarbellNJ等AdditionofifosfamideandetoposidetostandardchemotherapyforEwing'ssarcomaandprimitiveneuroectodermaltumorofbone.NEnglJMed2003；348(8):694-701)。这些存活率在过去的20年甚至在剂量增强化疗后都未改善。为了提高存活和降低疗法-相关的发病率，可采用如在优选的实施方案中提供的用于治疗ESFT患者的新型靶向策略。ESFT的特征在于在95％的肿瘤中在位于染色体22上的EWS基因(尤文氏肉瘤)的中心外显子与ets家族基因的外显子之间发生易位；与位于染色体11上的FLI1(Friend白血病插入序列)发生的易位(t(11；22))或与位于染色体21上的ERG发生的易位(t(21；22))。EWS-FLI1融合转录物编码具有两个一级结构域的55kDa蛋白质(电泳迁移率约68kD)。EWS结构域是有效的转录激活因子，同时FLI1结构域含有高度保守的etsDNA结合结构域(MayWA,LessnickSL,BraunBS,等TheEwing'ssarcomaEWS/FLI-1fusiongeneencodesamorepotenttranscriptionalactivatorandisamorepowerfultransforminggenethanFLI-1.MolCellBiol1993；13(12):7393-8)；所得的EWS-FLI1融合蛋白质用作异常转录因子。小鼠成纤维细胞的EWS-FLI1转化需要待相互作用的EWS和FLI1功能结构域两者(MayWA,GishizkyML,LessnickSL,等.Ewingsarcoma11；22translocationproducesachimerictranscriptionfactorthatrequirestheDNA-bindingdomainencodedbyFLI1fortransformation.ProcNatlAcadSciUSA1993；90(12):5752-6)。EWS-FLI1是优良的治疗靶标，其中其仅在肿瘤细胞中表达并且为维持ESFT细胞系生长所需。使用反义寡脱氧核苷酸(ODN)(ToretskyJA,ConnellY,NeckersL,BhatNK.InhibitionofEWS-FLI-1fusionproteinwithantisenseoligodeoxynucleotides.JNeurooncol1997；31(1-2):9-16；TanakaK,IwakumaT,HarimayaK,SatoH,IwamotoY.EWS-Fli1antisenseoligodeoxynucleotideinhibitsproliferationofhumanEwing'ssarcomaandprimitiveneuroectodermaltumorcells.JClinInvest1997；99(2):239-47)或小干扰RNA(siRNA)(OuchidaM,OhnoT,FujimuraY,RaoVN,ReddyES.LossoftumorigenicityofEwing'ssarcomacellsexpressingantisenseRNAtoEWS-fusiontranscripts.Oncogene1995；11(6):1049-54；MaksimenkoA,MalvyC,LambertG,等Oligonucleotidestargetedagainstajunctiononcogenearemadeefficientbynanotechnologies.PharmRes2003；20(10):1565-7；KovarH,AryeeDN,JugG,等EWS/FLI-1antagonistsinducegrowthinhibitionofEwingtumorcellinvitro.CellGrowthDiffer1996；7(4):429-37)导致的EWS-FLI1表达水平降低导致在裸小鼠中ESFT细胞系增殖减小和肿瘤退化。最近纳米技术进展已经改善了siRNA的递送和控制释放，然而使用当前技术，在人类中无论是反义ODN还是siRNA减少EWS-FLI1都是不可能的(MaksimenkoA,MalvyC,LambertG,等Oligonucleotidestargetedagainstajunctiononcogenearemadeefficientbynanotechnologies.PharmRes2003；20(10):1565-7；LambertG,BertrandJR,FattalE,等EWSfli-1antisensenanocapsulesinhibitsEwingsarcoma-relatedtumorinmice.BiochemBiophysResCommun2000；279(2):401-6)。一种有趣的EWS-FLI1靶向方法使用siRNA减少的EWS-FLI1与小分子文库之间的对比表达，这导致用Ara-C进行当前临床试验(StegmaierK,WongJS,RossKN,等Signature-basedsmallmoleculescreeningidentifiescytosinearabinosideasanEWS/FLImodulatorinEwingsarcoma.PLoSmedicine2007；4(4):e122)。该鉴定Ara-C的方法还表明了多柔比星和嘌呤霉素将降低EWS-FLI1水平。多柔比星当前用作ESFT患者的标准疗法，然而存活期还远不可以接受(GrierHE,KrailoMD,TarbellNJ,等AdditionofifosfamideandetoposidetostandardchemotherapyforEwing'ssarcomaandprimitiveneuroectodermaltumorofbone.NEnglJMed2003；348(8):694-701)。在ESFT患者中使用Ara-C当前在二期试验中评估。尽管希望这能代表所需的临床突破，但其必定证明EWS-FLI1的小分子靶向的重要性。优选的实施方案提供了使EWS-FLI1与关键蛋白质伴侣破坏的小分子蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂(SMPPII)，从而获得肿瘤特异性和EWS-FLI1的更精确靶向。存在足够的证据以得出以下结论：EWS-FLI1融合蛋白质与未易位的EWS或FLI1的作用不同(MayWA,GishizkyML,LessnickSL,等Ewingsarcoma11；22translocationproducesachimerictranscriptionfactorthatrequirestheDNA-bindingdomainencodedbyFLI1fortransformation.ProcNatlAcadSciUSA1993；90(12):5752-6)。与缺乏EWS-FLI1表达的肿瘤相比，EWS-FLI1-表达细胞系(BraunBS,FriedenR,LessnickSL,MayWA,DennyCT.IdentificationoftargetgenesfortheEwing'ssarcomaEWS/FLIfusionproteinbyrepresentationaldifferenceanalysis.MolCellBiol1995；15(8):4623-30)或从ESFT患者取得的肿瘤细胞的基因表达特性的变化表明EWS-FLI1可在转录调控中起作用(KhanJ,WeiJS,RingnerM,等Classificationanddiagnosticpredictionofcancersusinggeneexpressionprofilingandartificialneuralnetworks.NatMed2001；7(6):673-9；BaerC,NeesM,BreitS,等ProfilingandfunctionalannotationofmRNAgeneexpressioninpediatricrhabdomyosarcomaandEwing'ssarcoma.IntJCancer2004；110(5):687-94)。尽管EWS-FLI1-调控的基因表达机制的清楚图像尚未出现，但其活性可能是EWS-FLI1与RNA合成和剪接的调控子之间的直接或二级相互作用的结果(UrenA,ToretskyJA.Ewing'sSarcomaOncoproteinEWS-FLI1:thePerfectTargetwithoutaTherapeuticAgent.FutureOnc2005；1(4):521-8)。EWS-FLI1是良好的治疗靶标，因为其仅在肿瘤细胞中表达；然而，靶向该肿瘤-特异性致癌基因的能力之前尚未成功。针对小分子发展的挑战之一是EWS-FLI1缺乏任何已知的酶促结构域，并且酶结构域未被认为对靶向疗法是关键的。此外，EWS-FLI1是无序蛋白质，从而表明其没有展现出可用于基于结构的药物设计的刚性结构(UrenA,TcherkasskayaO,ToretskyJA.RecombinantEWS-FLI1oncoproteinactivatestranscription.Biochemistry2004；43(42):13579-89)。事实上，EWS-FLI1的无序性质对其转录调控是关键的(NgKP,PotikyanG,SaveneRO,DennyCT,UverskyVN,LeeKA.MultiplearomaticsidechainswithinadisorderedstructurearecriticalfortranscriptionandtransformingactivityofEWSfamilyoncoproteins.ProcNatlAcadSciUSA2007；104(2):479-84)。无序蛋白质特别由于其生化无序性质而被认为是小分子蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的更有吸引力的靶标(ChengY,LeGallT,OldfieldCJ,等.Rationaldrugdesignviaintrinsicallydisorderedprotein.TrendsBiotechnol2006；24(10):435-42)。EWS-FLI1体外和体内结合RNA螺旋酶A。据信EWS-FLI1的蛋白质-蛋白质相互作用可有助于其致癌潜力；因此，已寻找到直接与EWS-FLI1相互作用并功能性调控EWS-FLI1的新型蛋白质。具有转录活性的重组EWS-FLI1(UrenA,TcherkasskayaO,ToretskyJA.RecombinantEWS-FLI1oncoproteinactivatestranscription.Biochemistry2004；43(42):13579-89)用作筛选商购肽噬菌体展示文库的靶标。通过噬菌体测序鉴定差异性结合至EWS-FLI1的二十八种新型肽。美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库搜索与这些肽同源的人蛋白质鉴定出了与人RNA螺旋酶A(RHA，基因银行登录号A47363)的aa823-832同源的肽(ToretskyJA,ErkizanV,LevensonA,等OncoproteinEWS-FLI1activityisenhancedbyRNAhelicaseA.CancerRes2006；66(11):5574-81)。RHA，一个高度保守的DEXD/H盒螺旋酶蛋白质家族成员，是人转录组的标准多功能成员(ZhangS,GrosseF.MultiplefunctionsofnuclearDNAhelicaseII(RNAhelicaseA)innucleicacidmetabolism.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2004；36(3):177-83；vonHippelPH,DelagoutteE.Ageneralmodelfornucleicacidhelicasesandtheir\coupling\withinmacromolecularmachines.Cell2001；104(2):177-90)。这些蛋白质参与多种生物体中的多种功能，所述生物体为古生菌、真细菌、低级和高级真核生物及多种病毒，包括黄病毒家族的正义RNA病毒。RHA是NF-κB的转录辅激活因子，并且已显示出可与以下物质形成复合物：Creb-结合蛋白(CBP)(NakajimaT,UchidaC,AndersonSF,等.RNAhelicaseAmediatesassociationofCBPwithRNApolymeraseII.Cell1997；90(6):1107-12)、RNA聚合酶II(NakajimaT,UchidaC,AndersonSF,等.RNAhelicaseAmediatesassociationofCBPwithRNApolymeraseII.Cell1997；90(6):1107-12)、乳腺癌肿瘤抑制因子BRCA1(AndersonSF,SchlegelBP,NakajimaT,WolpinES,ParvinJD.BRCA1proteinislinkedtotheRNApolymeraseIIholoenzymecomplexviaRNAhelicaseA.NatGenet1998；19(3):254-6)，以及最近的EWS-FLI1(ToretskyJA,ErkizanV,LevensonA,等OncoproteinEWS-FLI1activityisenhancedbyRNAhelicaseA.CancerRes2006；66(11):5574-81)。EWS-FLI1结合至独特且未被认为是任何其它RHA结合伴侣的结合位点的RHA区域(ToretskyJA,ErkizanV,LevensonA,等OncoproteinEWS-FLI1activityisenhancedbyRNAhelicaseA.CancerRes2006；66(11):5574-81)。RHA表达增强了EWS-FLI1介导的锚依赖性菌落形成，同时RHA的失活突变防止了菌落形成(ToretskyJA,ErkizanV,LevensonA,等OncoproteinEWS-FLI1activityisenhancedbyRNAhelicaseA.CancerRes2006；66(11):5574-81)。该结构和功能相互作用是优选的实施方案的治疗剂的基础。尽管转录在肿瘤发生中具有重要性，但螺旋酶在该过程中的作用尚未得到充分研究。RHA是具有多种功能的人转录组的标准成员(ZhangS,GrosseF.MultiplefunctionsofnuclearDNAhelicaseII(RNAhelicaseA)innucleicacidmetabolism.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2004；36(3):177-83；vonHippelPH,DelagoutteE.Ageneralmodelfornucleicacidhelicasesandtheir\coupling\withinmacromolecularmachines.Cell2001；104(2):177-90)。我们最近公开的数据显示RHA与多功能EWS-FLI1致癌蛋白相互作用(ToretskyJA,ErkizanV,LevensonA,等OncoproteinEWS-FLI1activityisenhancedbyRNAhelicaseA.CancerRes2006；66(11):5574-81)。该相互作用可导致观察到的EWS-FLI1在转录起始和转录后修饰中的起作用的能力。RNA螺旋酶也已知可结合一些相同的因子并用作所述因子的桥，所述因子已被鉴定为EWS-FLI1的结合伴侣，包括剪接因子U1C(ChenJY,StandsL,StaleyJP,JackupsRR,Jr.,LatusLJ,ChangTH.SpecificalterationsofU1-CproteinorU1smallnuclearRNAcaneliminatetherequirementofPrp28p,anessentialDEADboxsplicingfactor.MolCell2001；7(1):227-32；KnoopLL,BakerSJ.ThesplicingfactorU1CrepressesEWS/FLI-mediatedtransactivation.JBiolChem2000；275(32):24865-71)、Creb-结合蛋白质(CBP)(NakajimaT,UchidaC,AndersonSF,等RNAhelicaseAmediatesassociationofCBPwithRNApolymeraseII.Cell1997；90(6):1107-12)和RNA聚合酶II(NakajimaT,UchidaC,AndersonSF,等RNAhelicaseAmediatesassociationofCBPwithRNApolymeraseII.Cell1997；90(6):1107-12)。RHA可执行与EWS-FLI1和RNAPolII类似的功能，在募集关键加工蛋白中起作用。RHA还可通过维持EWS-FLI1作为大转录复合物一部分而促进ESFT瘤形成，其功能依赖于RHA作为能量来源的ATP酶活性。最终，螺旋酶如RHA可稳定mRNA种类(IostI,DreyfusM.mRNAscanbestabilizedbyDEAD-boxproteins.Nature1994；372(6502):193-6)。RHA稳定和代谢EWS-FLI1转录的mRNA可增强EWS-FLI1的致癌性质。尽管EWS-FLI1对ESFT细胞具有相当的特异性，但EWS和RHA泛表达。EWS-FLI1与RHA之间的区域由可具有特异性的分子治疗剂靶向；因为EWS-FLI1仅在肿瘤中表达，并且与RHA的相互作用位点可能是独特的。本文提供了治疗剂，即小分子蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂以抑制EWS-FLI1功能。大部分易位-融合蛋白质肉瘤预示了不良预后，包括ESFT。产生独特和关键融合蛋白质EWS-FLI1的染色体易位t(11；22)是完美的癌症靶标。许多其它肉瘤共享类似的易位变体(来自HelmanLJ,MeltzerP.Mechanismsofsarcomadevelopment.NatRevCancer2003；3(9):685-94的表2)。已在胰腺实性假乳头状肿瘤中报道了EWS-FLI1易位(MaitraA.,等,Detectionoft(11；22)(q24；q12)translocationandEWS-FLI-1fusiontranscriptinacaseofsolidpseudopapillarytumorofpancreas.PediatrDevPathol2000；3:603-605)，然而EWS-FLI1在所有实性假乳头状肿瘤中的作用仍然尚未确定(KatharinaTiemann等,SolidpseudopapillaryneoplasmsofthepancreasareassociatedwithFLI-1expression,butnotwithEWS/FLI-1translocation)。EWS或FLI1类似物在多种肉瘤和白血病中发生的易位中是伴侣。EWS或其类似物TLS或FUS参与透明细胞肉瘤、黏液样脂肪肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、软骨肉瘤和急性骨髓样白血病的染色体易位。FLI1属于ets基因家族。FLI1类似物ERG在大约10％的尤文氏肉瘤和20％的急性骨髓样白血病中易位。这表明EWS-FLI1可用作可影响感染大量患者的疾病家族(与易位伴侣相关)的模式系统(UrenA.,TcherkasskayaO.andToretskyJ.A.RecombinantEWS-FLI1oncoproteinactivatestranscription.Biochemistry43(42)13579-89(2004))。ERG还在前列腺癌中易位，其中TMPRSS2:ERG融合表明了可定义疾病进展风险的不同的分子亚型(F.Demichelis等,TMPRSS2:ERGgenefusionassociatedwithlethalcancerinawatchfulwaitingcohort.Oncogene(2007)26,4596-4599)。已观察到EWS或FLI1家族成员易位的其它疾病包括先天性纤维肉瘤和细胞中胚叶肾瘤，其中ets家族成员ETV6与NTRK3并列。其它易位基因融合包括导致BCR-ABL融合蛋白质表达的慢性骨髓样白血病，和染色体18的SYT基因与X染色体的SSX1或SSX2并列的滑膜肉瘤(AykutUrenandJeffreyA.Toretsky,Pediatricmalignanciesprovideuniquecancertherapytargets.CurrOpinPediatr17:14-19(2005))。因此，优选的实施方案的治疗剂具有用于在许多其它肿瘤中应用的潜力。更广泛地，一些最难的白血病还具有涉及混合谱系白血病基因(MLL,11q23)的易位-产生的融合蛋白质，并且我们的研究可用作癌症特有处理-耐受性基团的范式(PuiCH,ChessellsJM,CamittaB,等.Clinicalheterogeneityinchildhoodacutelymphoblasticleukemiawith11q23rearrangements.Leukemia2003；17(4):700-6.)。因此，实施方案包括已发生易位的癌症。易位融合基因在表1中列出。表1某些适应症本文提供的某些化合物、组合物和方法可用于治疗多种病症，诸如包含易位基因融合的肿瘤、尤文氏肉瘤、透明细胞肉瘤、黏液样脂肪肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、黏液样软骨肉瘤、急性骨髓样白血病、先天性纤维肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺腺癌或多形性成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症包含易位，所述易位包含选自由FLI1、ETV1、ETV4、ERG、ETS1和ETS2组成的组的ETS基因。实施例包括实验和获得的结果的以下实施例仅为了说明性目的而提供，并不被理解为限制本发明。当化学结构描绘了具有未满化合价的原子时，应理解所述化学价被一个或多个氢原子满足。实施例1-4,7二氯靛红类似物的合成将适当的苯乙酮和4,7-二氯靛红在催化量的二乙胺的存在下缩合以制备定量产率的所需化合物。实施例化合物：R1＝4'-CN(PT-1-11)；2'-OCH3(PT-1-12)；3'-OCH3(PT-1-18)；2',4'-OCH3(PT-1-19)；2',3'-OCH3(PT-1-20)；3',4'OCH3(PT-1-21)；3',5'OCH3(PT-1-22)；2',3',4',-OCH3(PT-1-23)；3',4',5'-OCH3(PT-1-13)；4'-OC2H5(PT-1-14)；4'-CF3(PT-1-15)；4'-OCF3(PT-1-16)；4'-N(CH3)2(PT-1-17)；4'-OPh(PT-1-60)；4'-SCH3(PT-1-67)和4'-C(CH3)2(PT-1-67)。实施例2-脱水4,7二氯靛红类似物的合成将4,7-二氯靛红于96％的H2SO4中的溶液在室温下搅拌以产生经还原的类似物。实施例化合物：R2＝4'-OCH3(PT-1-33)；2',4'-OCH3(PT-1-39)；2',3',4',-OCH3(PT-1-41)；4'-OC2H5(PT-1-43)和4'-N(CH3)2(PT-1-38)。实施例3-还原的4,7二氯靛红类似物的合成实施例4-还原的4,7二氯靛红吡啶衍生物的合成实施例5-某些化合物的生物活性表2中提供的化合物使用与本文所述的那些方法类似的方法制备。特定化合物在PANC1(人胰腺癌)、TC32(人ESFT细胞系)和TC71(人ESFT细胞系)细胞中的结构和IC50活性汇总于表2中。表2实施例6-用取代的类似物对EWS-FLI1细胞进行的生长抑制YK-4-279类似物对ESFT细胞的作用通过测定其生长抑制测定。对于以单层生长的细胞，先导化合物的IC50是900nM。测定各种浓度的特定化合物对ESFT细胞的生长抑制。测量各种浓度的YK-4-279和PT-1-33对TC71和TC32细胞的生长抑制(图3A)。测量各种浓度的YK-4-279、PT-1-33和PT-1-55对TC71细胞的生长抑制(图3B)。测量各种浓度的YK-4-279和PT-1-123对TC71细胞的生长抑制(图3C)。一些类似物具有与YK-4-279类似的活性。脱水的类似物和醇类似物显示了针对ESFT细胞的类似活性(图3A)。对酮的修饰不改善化合物的活性(图3B和图3C)。实施例7-EWS-FLI1细胞的凋亡免疫印迹从用YK-4-279处理并用RHA、EWS-FLI1或总蛋白共沉淀的TC32细胞的蛋白质裂解物制备(图4)。YK-4-279不直接影响EWS-FLI1或RHA的水平，但破坏其相互作用。破坏RHA与EWS-FLI1之间的相互作用给出了用于开发作为针对尤文氏家族肉瘤肿瘤的潜在治疗剂的一类小分子的途径。尽管YK-4-279破坏了蛋白质-蛋白质相互作用，但PT-1-17看起来在TC71细胞中更有效。YK-4-279的脱水类似物未显著增加所述化合物的效能。实施例8-EWS-FLI1/RHA结合的破坏在ELISA测定中筛选候选小分子破坏EWS-FLI1与His-标记的RHA蛋白质(His-TagRHA(647-1075))之间的结合的活性。简而言之，将候选剂在用EWS-FLI1涂覆的板上与RHA一起孵育。在洗涤板后，RHA保留结合至板的量使用一级抗-RHA抗体和二级信号抗体确定。将96-孔板中的各孔在4℃下与100μl/孔的20nMEWS-FLI1蛋白质溶液(1M咪唑、20mMTris、500mMNaCl)一起孵育过夜。将板用PBS洗涤，在室温下用150μl/孔的4％BSA阻断至少2小时，然后用ELISA洗涤溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)再次洗涤。将板在室温下与100μl/孔的于PBS中的候选剂(10μM或50μM最终)或DMSO对照一起孵育1小时。将板在4℃下与100μl/孔的20nMHis-RHA蛋白质溶液(0.5M咪唑，125mMNaCl，20mMTris)一起孵育过夜，然后用ELISA洗涤溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)洗涤。结合至板的RHA通过在室温下将板与100μl/孔的一级抗-RHA抗体(1:1000山羊抗-DHX9/EB09297，Everest)一起孵育1小时、然后用ELISA洗涤溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)洗涤进行检测。一级抗体通过在室温下将板与100μl/孔的二级抗-山羊抗体(1:500驴抗-山羊IgG-HRP:sc-2020)一起孵育1小时、然后用ELISA洗涤溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)洗涤进行检测。辣根过氧化物酶测定试剂盒用于测定于每个孔中的二级抗-山羊抗体的量(Bio-Rad-TMBPeroxidaseEIASubstrateKit#172-1066)，所述板在450nm处读取。表明少量HRP的相对较低的光学密度表明了对EWS-FLI1-RHA结合具有增加的抑制活性的候选剂。所述结果汇总于图5A-5G中。图5A汇总了以下候选分子的结果：YK-4-275、YK-4-285、PT-1-12、PT-1-18、PT-1-19、PT-1-20、PT-1-21、PT-1-22、PT-1-23、PT-1-175。图5B汇总了以下候选分子的结果：PT-2-84、PT-2-59、PT-1-17、PT-2-71、PT-2-89、PT-1-123、PT-1-15、PT-1-60、PT-1-67、PT-1-69。图5C汇总了以下候选分子的结果：YK-4-285、YK-4-286、PT-1-33、PT-1-38、PT-1-271、PT-1-52、PT-1-56、PT-1-64、PT-2-94、PT-1-267。图5D汇总了以下候选分子的结果：YK-4-282、YK-4-287、YK-4-280、YK-4-289、YK-4-288、YK-4-278、YK-4-276、YK-4-283、YK-4-277、YK-4-281。图5E汇总了以下候选分子的结果：PT-1-54、YK-4-279(S)、YK-4-279(R)、PT-1-55、PT-2-75、PT-2-39、PT-2-79、PT-1-16、PT-1-13、PT-2-64。图5F汇总了以下候选分子的结果：YK-4-284、PT-1-14、PT-1-39、PT-1-41、PT-1-43、PT-1-53、PT-2-56、PT-2-52、PT-1-61、PT-1-183。图5G汇总了以下候选分子的结果：PT-1-275、PT-2-69、PT-2-99、YK-4-288、PT-1-19、PT-1-20、PT-1-69、PT-2-89、PT-1-17、PT-2-94。实施例9-EWS-FLI1转录因子活性的破坏候选小分子破坏EWS-FLI1转录因子活性的活性使用荧光素酶测定筛选，其中EWS-FLI1结合至NROB1启动子增加了荧光素酶表达。简而言之，细胞用含有NROB1启动子驱动的荧光素酶表达的载体和EWS-FLI1表达载体转染。经转染的细胞用各种浓度的候选剂处理，并且测定荧光素酶表达的相对水平的任何变化。将COS7细胞涂铺在96-孔板中，并用pciNEO/EF载体和pGL3-NROB1转染。对照包括仅用每个载体进行的转染。将经转染的细胞用各种浓度的候选剂处理，并且测定经处理的细胞的荧光素酶活性。降低的荧光素酶活性表明在用作转录因子的EWS-FLI1中具有抑制活性的候选剂，从而促进了荧光素酶转录。图6A和图6B显示了各种浓度的候选剂的相对荧光素酶活性的一般趋势。图7A至图7I显示了各种浓度的候选剂的抑制活性。实施例10-治疗多形性成胶质细胞瘤多形性成胶质细胞瘤(GBM)就遗传学方面是被极其良好诠释的肿瘤，所述遗传学导致分子分离为经典的、原神经的、神经的和间充质细胞的类别(PurowBW,SchiffD.Glioblastomagenetics:inrapidflux.DiscovMed.2010年2月；9(45):125-31.PubMedPMID:20193638.PubmedCentralPMCID:3365574)。分类GBM的遗传变化包括信号传导途径的组成性激活、肿瘤抑制子丢失、代谢途径中的突变、异常DNA修复和有丝分裂调控子丢失(SuzukiE,WilliamsS,SatoS,GilkesonG,WatsonDK,ZhangXK.ThetranscriptionfactorFli-1regulatesmonocyte,macrophageanddendriticcelldevelopmentinmice.Immunology.2013年7月；139(3):318-27.PubMedPMID:23320737.PubmedCentralPMCID:3701178；ChowLM,EndersbyR,ZhuX,RankinS,QuC,ZhangJ,等.CooperativitywithinandamongPten,p53,andRbpathwaysinduceshigh-gradeastrocytomainadultbrain.CancerCell.2011年3月8日；19(3):305-16.PubMedPMID:21397855.PubmedCentralPMCID:3060664；SolomonDA,KimT,Diaz-MartinezLA,FairJ,ElkahlounAG,HarrisBT,等.MutationalinactivationofSTAG2causesaneuploidyinhumancancer.Science.2011年8月19日；333(6045):1039-43.PubMedPMID:21852505.Epub2011/08/20.eng)。甚至在这些类别中，GBM被认为是具有显著瘤内异质性的肿瘤(GarrawayLA,LanderES.Lessonsfromthecancergenome.Cell.2013年3月28日；153(1):17-37.PubMedPMID:23540688；NabilsiNH,DeleyrolleLP,DarstRP,RivaA,ReynoldsBA,KladdeMP.MultiplexmappingofchromatinaccessibilityandDNAmethylationwithintargetedsinglemoleculesidentifiesepigeneticheterogeneityinneuralstemcellsandglioblastoma.GenomeRes.2013Oct8.PubMedPMID:24105770)。尽管在遗传学中存在这种显著的可变性，但是几乎没人注意到转录调控子。转录因子尚未在GBM中很好研究的一个原因可为不存在有效的小分子抑制剂。对于这点例外的是p53，其野生型功能可用小分子蛋白质相互作用抑制剂Nutlin-3维持(VassilevLT.p53Activationbysmallmolecules:applicationinoncology.JMedChem.2005年7月14日；48(14):4491-9.PubMedPMID:15999986)。尽管有遗传多样性，许多临床试验已得以完成，其评估了GBM的靶向和非-靶向疗法。尽管所有这些试验包括放射疗法和分子指导的手术切除，但是朝向有效的长期GBM疗法的进展对于绝大部分的患者是不成功的(YinAA,ChengJX,ZhangX,LiuBL.Thetreatmentofglioblastomas:AsystematicupdateonclinicalPhaseIIItrials.CritRevOncolHematol.2013年9月；87(3):265-82.PubMedPMID:23453191)。最近的VEGFR小分子抑制剂加上替莫唑胺III期试验也显示标准护理替莫唑胺+放射疗法没有改善(BatchelorTT,MulhollandP,NeynsB,NaborsLB,CamponeM,WickA,等.PhaseIIIRandomizedTrialComparingtheEfficacyofCediranibAsMonotherapy,andinCombinationWithLomustine,VersusLomustineAloneinPatientsWithRecurrentGlioblastoma.JClinOncol.2013年9月10日；31(26):3212-8.PubMedPMID:23940216)。对任何GBM疗法的显著挑战是克服血脑屏障(BBB)，并且这已经影响许多潜在的靶向疗法(JuratliTA,SchackertG,KrexD.Currentstatusoflocaltherapyinmalignantgliomas--aclinicalreviewofthreeselectedapproaches.PharmacolTher.2013年9月；139(3):341-58.PubMedPMID:23694764)。使用微小RNA(miRNA)理解GBM的生物学并开发新型疗法导致新发现：甘油二酯激酶α可为潜在靶标并且对于这些抑制剂小分子优化目前正在进行(DominguezCL,FloydDH,XiaoA,MullinsGR,KefasBA,XinW,等.Diacylglycerolkinasealphaisacriticalsignalingnodeandnoveltherapeutictargetinglioblastomaandothercancers.CancerDiscov.2013年7月；3(7):782-97.PubMedPMID:23558954.PubmedCentralPMCID:3710531)。此外，miRNA已用于创建生物信息学模型，其的确表明转录调控网络对于GBM瘤形成非常重要(SunJ,GongX,PurowB,ZhaoZ.UncoveringMicroRNAandTranscriptionFactorMediatedRegulatoryNetworksinGlioblastoma.PLoScomputationalbiology.2012；8(7):e1002488.PubMedPMID:22829753.PubmedCentralPMCID:3400583)。Friend白血病插入序列-1(FLI1)是推测的新型GBM靶标转录因子在许多癌症中是局灶性驱动致癌基因，但未被认为是‘非成药的’，因为它们缺乏酶促活性。迄今，尽管存在GBM的TCGA数据库，关键转录结的治疗靶向尚未发生。ets家族转录因子FLI1基于查询TCGA数据库在GBM中表达(图8)。早期ETS-1研究使ETS-1表达与人星形细胞肿瘤中的恶性潜能相关(KitangeG,KishikawaM,NakayamaT,NaitoS,IsekiM,ShibataS.ExpressionoftheEts-1proto-oncogenecorrelateswithmalignantpotentialinhumanastrocytictumors.ModPathol.1999年6月；12(6):618-26.PubMedPMID:10392639)。此外，研究显示ETS-1可在星形细胞肿瘤中驱动血管生成(ValterMM,HugelA,HuangHJ,CaveneeWK,WiestlerOD,PietschT,等.ExpressionoftheEts-1transcriptionfactorinhumanastrocytomasisassociatedwithFms-liketyrosinekinase-1(Flt-1)/vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1synthesisandneoangiogenesis.CancerRes.1999年11月1日；59(21):5608-14.PubMedPMID:10554042)。许多研究表明ets家族ELK成员在GBM转录和整个生物学中的重要作用(DayBW,StringerBW,SpanevelloMD,CharmsazS,JamiesonPR,EnsbeyKS,等.ELK4neutralizationsensitizesglioblastomatoapoptosisthroughdownregulationoftheanti-apoptoticproteinMcl-1.NeuroOncol.2011年11月；13(11):1202-12.PubMedPMID:21846680.PubmedCentralPMCID:3199151；ShuklaAA,JainM,ChauhanSS.Ets-1/Elk-1isacriticalmediatorofdipeptidyl-peptidaseIIItranscriptioninhumangliblastomacells.FebsJ.2010年4月；277(8):1861-75.PubMedPMID:20236318；UhtRM,AmosS,MartinPM,RigganAE,HussainiIM.TheproteinkinaseC-etaisoforminducesproliferationinglioblastomacelllinesthroughanERK/Elk-1pathway.Oncogene.2007年5月3日；26(20):2885-93.PubMedPMID:17146445)。尽管一个免疫组织化学研究没有发现FLI1在GBM中表达，然而在抗体选择和抗原补偿方面存在显著挑战，其可影响这些阴性结果(Mhawech-FaucegliaP,HerrmannFR,BsharaW,OdunsiK,TerraccianoL,SauterG,等.Friendleukaemiaintegration-1expressioninmalignantandbenigntumours:amultipletumourtissuemicroarrayanalysisusingpolyclonalantibody.JClinPathol.2007年6月；60(6):694-700.PubMedPMID:16917000.PubmedCentralPMCID:195505)。使用癌症基因组学网站界面的cBioPortal，评估癌症涉及的ets家族成员的一个亚群。这些改变包括扩增(红色实条)、突变(小绿正方形)和mRNA上调(红色空条)。参见图8。在GBM中FLI1靶向基于其转录激活MDM2得以进一步支持(TruongAH,CerviD,LeeJ,Ben-DavidY.DirecttranscriptionalregulationofMDM2byFli-1.Oncogene.2005年2月3日；24(6):962-9.PubMedPMID:15592502)。在这种情况下，高MDM2将引起p53降解，从而导致关键肿瘤抑制子蛋白质丢失。值得注意的是，在七个GBM细胞系中具有高FLI1与高MDM2的那些之间存在松散的联系(表3和图10)。当蛋白质通过同源重组消除时，如由多种免疫缺陷所指示，在造血发育中FLI1显然是重要的蛋白质(SuzukiE,WilliamsS,SatoS,GilkesonG,WatsonDK,ZhangXK.ThetranscriptionfactorFli-1regulatesmonocyte,macrophageanddendriticcelldevelopmentinmice.Immunology.2013年7月；139(3):318-27.PubMedPMID:23320737.PubmedCentralPMCID:3701178；KruseEA,LoughranSJ,BaldwinTM,JosefssonEC,EllisS,WatsonDK,等.DualrequirementfortheETStranscriptionfactorsFli-1andErginhematopoieticstemcellsandthemegakaryocytelineage.ProcNatlAcadSciUSA.2009年8月18日；106(33):13814-9.PubMedPMID:19666492.PubmedCentralPMCID:2728977；LiuF,WalmsleyM,RodawayA,PatientR.Fli1actsatthetopofthetranscriptionalnetworkdrivingbloodandendothelialdevelopment.CurrBiol.2008年8月26日；18(16):1234-40.PubMedPMID:18718762)。尽管FLI1对胚胎形成是关键的，但其不可能在成熟组织是关键的，因为其表达受到免疫细胞和内皮的亚组限制(WatsonDK,SmythFE,ThompsonDM,ChengJQ,TestaJR,PapasTS,等.TheERGB/Fli-1gene:isolationandcharacterizationofanewmemberofthefamilyofhumanETStranscriptionfactors.CellGrowthDiffer.1992年10月；3(10):705-13.PubMedPMID:1445800；TruongAH,Ben-DavidY.TheroleofFli-1innormalcellfunctionandmalignanttransformation.Oncogene.2000年12月18日；19(55):6482-9.PubMedPMID:11175364；PrasadDD,RaoVN,ReddyES.StructureandexpressionofhumanFli-1gene.CancerRes.1992；52(20):5833-7)。此外，靶向FLI1的方法是用与YK-4-279的蛋白质相互作用对其进行破坏，而非消除其表达。YK-4-279抑制ets家族成员ERG、ETV1和EWS-FLI1的功能在儿童/青壮年癌症尤文氏肉瘤中，EWS转录激活结构域融合至ets家族成员，从而产生新型融合蛋白质EWS-FLI1。我们鉴定并验证了小分子YK-4-279，其预防EWS-FLI1与RHA结合，从而导致在一组尤文氏肉瘤细胞系中的细胞凋亡(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009年7月；15(7):750-6.PubMedPMID:19584866.eng)。我们还证实了尤文氏肉瘤异种移植模型中减少的肿瘤生长，同时不以类似剂量影响含有非-EWS-FLI1的肿瘤的生长。作为特异性的重要证据，仅YK-4-279的(S)对映异构体能够抑制EWS-FLI1的功能活性，包括结合至RHA、转录物激活和可变剪接(Barber-RotenbergJS,SelvanathanSP,KongY,ErkizanHV,SnyderTM,HongPS,等SingleEnantiomerofYK-4-279DemonstratesSpecificityinTargetingtheOncogeneEWS-FLI1.Oncotarget.2012年2月；3(2):172-82.PubMedPMID:22383402.Epub2012/03/03.eng)。晚期前列腺癌通过染色体易位或基因扩增过表达ERG、ETV1或ETV4。ERG、ETV1或ETV4活性已经直接涉及增加侵袭和转移。所有三种是共享与FLI1的显著同源性的ets家族蛋白质，并且具有基本上相同的DNA结合结构域。当用YK-4-279处理时，由ERG或ETV1驱动的前列腺细胞显示了显著减少的侵袭(RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279InhibitsERGandETV1MediatedProstateCancerCellInvasion.PLoSONE.2011；6(4):e19343.PubMedPMID:21559405.PubmedCentralPMCID:3084826.Epub2011/05/12.eng)。基于ets转录因子同源性的这种跨肿瘤活性让我们探索可能部分由ets转录因子驱动的另外的肿瘤。ets家族成员FLI1可因此是GBM中新型分子靶标，并且YK-4-279是GBM中潜在的靶向治疗剂。原位异种移植和GBM经遗传工程化的小鼠模型有助于原理循证研究以支持用于进展至人临床试验的基本原理。FLI1可为GBM的新的重要靶标并且YK-4-279可用作将来的治疗剂。GBM是癌症基因组图谱(TCGA)的靶向肿瘤类型之一，其多个数据集可用于分析。已经搜索了FLI1以及高度同源性蛋白质的变化，并且发现23％的GBM样本具有支持作为新型靶标的变化(图8)。考虑到FLI1、ERG与ETV1之间的密切同源性，评估YK-4-279与ERG和ETV1的结合(RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279InhibitsERGandETV1MediatedProstateCancerCellInvasion.PLoSONE.2011；6(4):e19343.PubMedPMID:21559405.PubmedCentralPMCID:3084826.Epub2011/05/12.eng)。YK-4-279对EWS-FLI1的亲和力(KD)经测量为9.5μM(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009年7月；15(7):750-6.PubMedPMID:19584866.Eng；Barber-RotenbergJS,Selvanath)。使用表面等离子体共振，结合至重组ERG和ETV1的YK-4-279的稳态动力学的结合亲和力(KD)对于ERG为11.7μM而对于ETV1为17.4μM，而其以122.4μM的较弱亲和力结合非特异性蛋白质BSA。图9显示了YK-4-279分别以11.7μM和17.9μM的KD结合至ERG和ETV1。稳态动力学如前所述在BiacoreT100仪器上测量(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009年7月；15(7):750-6.PubMedPMID:19584866.Eng；Barber-RotenbergJS,Selvanath)，SPR传感图(sensograms)未显示。包括XX细胞系分析的大量的GBM测序工程已经完成(SolomonDA,KimT,Diaz-MartinezLA,FairJ,ElkahlounAG,HarrisBT,等MutationalinactivationofSTAG2causesaneuploidyinhumancancer.Science.2011年8月19日；333(6045):1039-43.PubMedPMID:21852505.Epub2011/08/20.eng)。选择具有在GBM中发生的遗传异常光谱的七个细胞系。表3显示了GBM细胞系的异质性。需要一组代表所述疾病异质性的GBM细胞系。(+)表示表达列出的野生型或突变型蛋白质。(-)表示在免疫印迹上缺乏表达。这些细胞系用于评估FLI1表达以及对抑制剂YK-4-279的敏感性(图3)。表3DKMGDBTRG42MGBAGAMGU87MGH48MGBAEGFR+-+++-+Myc+-+++++PTEN+-+++-+MDM2++-+---p53++++--+p14ARF------+21WAF1/CIP+++++++CDK4+++++++CDK6++++-++p16INK4a------+p18INK4c++++-++RB++-+++-7个GBM细胞系中的6个(85％)通过免疫印迹证实存在FLI1表达(图10，上图)。这些细胞系的每一个的生长通过YK-4-279减少，其中IC50的范围在0.5至高达9.9μM之间，并且观察到FLI1水平与对YK-4-279的敏感性之间存在负相关(r2＝0.8，图10)。为了评估FLI1作为GBM靶标的潜力，分析了两种转基因模型(ChowLM,EndersbyR,ZhuX,RankinS,QuC,ZhangJ,等.CooperativitywithinandamongPten,p53,andRbpathwaysinduceshigh-gradeastrocytomainadultbrain.CancerCell.2011年3月8日；19(3):305-16.PubMedPMID:21397855.PubmedCentralPMCID:3060664)。观察到比较正常脑干、脑干星形胶质细胞和皮质星形胶质细胞的两种FLI1探针组的极低表达(图11)。然而，基于分析的两种探针组，22个双敲除(PTEN/p53)肿瘤中的20个和14个三敲除(PTEN/p53/Rb)肿瘤中的13个具有FLI1的显著表达(图11)。为了测定人GBM中的FLI1表达水平，将一组GBM用FLI1抗体染色。所述小组由六个随机选择的4级肿瘤组成；六个中的四个(66％)显示在优化抗体以消除交叉反应蛋白质和非特异性信号后显示出令人信服的FLI1的IHC染色(图12)。四个另外的肿瘤被认为是不可评估的，因为内部阳性对照即内皮细胞不是阳性的。使得新型靶向疗法进入GBM的一个重大挑战是克服血脑屏障(BBB)。作为YK-4-279的药代动力学评估的一部分，测量组织水平并将其与12只接受75mg/kgIV外消旋YK-4-279的小鼠的血浆比较。脑组织中YK-4-279的水平为尤文氏肉瘤胫骨前异种移植肿瘤的74％，这将足以抑制FLI1。此外，当使用IV注射化合物进行大鼠药代动力学时，大鼠在快速注射后变得困倦，这在较慢输注时不发生，因此支持了跨过BBB进入中枢神经系统的能力。本文提供的数据鉴定FLI1为GBM的假定靶标。TCGA数据、一组细胞系、GEMM模型及来自人肿瘤的IHC组的组合支持了对FLI1的进一步验证。验证FLI1为GBM中的新靶标FLI1作为假定靶标通过评估其是否为GBM细胞生长所必需来验证。确定FLI1是否为神经胶质干细胞中的潜在致癌基因。为了FLI1的重要性，将GBM细胞与正常人星形胶质细胞和神经胶质干细胞比较，以解决靶向FLI1的治疗指数。与正常脑细胞的比较可用于确立FLI1为具有优选治疗指数的有效靶标。GBM细胞系需要用于鉴定存活、生长和侵袭的FLI1表达使用用靶向FLI1的3’UTR的EGFP标记的shRNA载体，GBM细胞系需要用于鉴定存活、生长和侵袭的FLI1表达。将shRNA使用慢病毒系统感染至细胞中。因此，评估了FLI1在包括许多基因型异质性的七种GBM细胞系中的相对重要性(表3)。在FLI1用shRNA减少后，测量在单层生长、侵袭、非贴壁依赖性生长和肿瘤发生测定中乱序shRNA对照和FLI1减少之间的变化。细胞培养物实验如前所报道进行(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009年7月；15(7):750-6.PubMedPMID:19584866.Eng；RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279InhibitsERGandETV1MediatedProstateCancerCellInvasion.PLoSONE.2011；6(4):e19343.PubMedPMID:21559405.PubmedCentralPMCID:3084826.Epub2011/05/12.eng)。侵袭测定使用肿瘤细胞和使用基于电阻抗的技术使其侵袭通过脐带内皮细胞进行，所述技术实时监控并定量恶性肿瘤细胞侵袭内皮细胞。使用由Roche制造的xCELLigence仪器，其测量了细胞附着时和随后肿瘤细胞破坏这种附着时的电阻抗变化(RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279InhibitsERGandETV1MediatedProstateCancerCellInvasion.PLoSONE.2011；6(4):e19343.PubMedPMID:21559405.PubmedCentralPMCID:3084826.Epub2011/05/12.Eng；RahimS,UrenA.Areal-timeelectricalimpedancebasedtechniquetomeasureinvasionofendothelialcellmonolayerbycancercells.Journalofvisualizedexperiments:JoVE.2011(50).PubMedPMID:21490581.PubmedCentralPMCID:3169283)。异种移植实验使用所有七种细胞系中多克隆shRNA减少的FLI1。每个shRNAFLI1和乱序细胞系通过立体定向注射至5只无胸腺小鼠(由Fiandanca协助)。(7种细胞系，5只动物/细胞系，+/-FLI1＝70)。以7-10天间隔通过共享资源的GU动物成像(GUAnimalImaging)中的MRI监测生长。肿瘤生长动力学的计算通过如所述的目标区域分析使用BrukerParavision5.0软件或ImageJ(NIH)进行(TruongAH,CerviD,LeeJ,Ben-DavidY.DirecttranscriptionalregulationofMDM2byFli-1.Oncogene.2005年2月3日；24(6):962-9.PubMedPMID:15592502；PimandaJE,ChanWY,DonaldsonIJ,BowenM,GreenAR,GottgensB.EndoglinexpressionintheendotheliumisregulatedbyFli-1,Erg,andElf-1actingonthepromoteranda-8-kbenhancer.Blood.2006年7月15日；107(12):4737-45.PubMedPMID:16484587)。计算肿瘤生长统计学以建立进展和治疗的时间-依赖性曲线。用全长FLI1cDNA转染正常人星形胶质细胞为了确定FLI1对星形胶质细胞的转化作用，将正常人星形胶质细胞用全长FLI1cDNA使用慢病毒系统转染，并在软琼脂和体内原位注射测定中评估转化。将对照(空载体)和FLI1转染的多克隆细胞置于软琼脂中以用于非贴壁依赖性生长测定(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009年7月；15(7):750-6.PubMedPMID:19584866.eng)。如上所述进行异种移植研究。(2种细胞系+/-FLI1，五只动物/细胞系＝20只动物)。如上所述，每10天将动物通过MRI成像以评估肿瘤生长。当外源性表达FLI1时，评估神经胶质干细胞先天表达FLI1并评估致癌作用。使用公开的细胞系(LelievreE,LionnetonF,MattotV,SpruytN,SoncinF.Ets-1regulatesfli-1expressioninendothelialcells.IdentificationofETSbindingsitesinthefli-1genepromoter.JBiolChem.2002年7月12日；277(28):25143-51.PubMedPMID:11991951)和新型细胞系。为了评估非贴壁依赖性生长和侵袭测定，对对照和FLI1两者进行表达。此外，这些细胞系用于异种移植实验中，两者均用对照和FLI1表达转染(通常通过评估前的免疫印迹证明)。这些细胞均在含有外源生长因子而非血清的最低生长培养基中小心生长，以维持其原始神经品质(RossiS,OrvietoE,FurlanettoA,LaurinoL,NinfoV,DeiTosAP.UtilityoftheimmunohistochemicaldetectionofFLI-1expressioninroundcellandvascularneoplasmusingamonoclonalantibody.ModPathol.2004年5月；17(5):547-52.PubMedPMID:15001993)(3种细胞系+/-FLI1，5只动物/细胞系＝15只动物)。测量YK-4-279毒性与FLI1水平之间的相关性。YK-4-279靶向EWS-FLI1的FLI1组分(Barber-RotenbergJS,SelvanathanSP,KongY,ErkizanHV,SnyderTM,HongPS,等SingleEnantiomerofYK-4-279DemonstratesSpecificityinTargetingtheOncogeneEWS-FLI1.Oncotarget.2012年2月；3(2):172-82.PubMedPMID:22383402.Epub2012/03/03.Eng；RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279InhibitsERGandETV1MediatedProstateCancerCellInvasion.PLoSONE.2011；6(4):e19343.PubMedPMID:21559405.PubmedCentralPMCID:3084826.Epub2011/05/12.eng)。在评估FLI1抑制剂YK-4-279对一组细胞系的作用并将抑制与FLI1表达相关联后，将这些结果与shRNA数据比较。7种GBM细胞系的初步数据与FLI1表达相关。这可用所用以产生图9的方法论扩展至更多细胞系。包含非-肿瘤神经胶质细胞系以用于这些比较。确定FLI1表达是否与其它已知的GBM基因型和表型相关。使用来自TCGA的一系列在线信息学工具以及与我们细胞系数据的相关性。分析包括FLI1cDNA或蛋白质表达，并且评估了FLI1是否与其它已知的GBM遗传事件(诸如丢失PTEN、p16、p53突变、IDH1点突变或EGFR突变)相关。这可被扩展以包括在诊断和将FLI1纳入至经评估的遗传标志物组中时切除的患者肿瘤。利用GBM动物模型评估作为治疗的YK-4-279为了确认YK-4-279是否可有效减缓GBM生长或引起GBM退化，将YK-4-279施用给具有确定的GBM的小鼠。这评估了GBM的异种移植和转基因模型两者。为了建立用于评估多组小鼠中颅内病变的方法，而非用MRI进行一次的方法。尽管MRI提供了非常详细的GBM肿瘤图谱和代谢谱，但是筛选小鼠的时间限制了其用于更大型研究中。创建两种GBM细胞系，其选自用于Xenogen颅内成像的七种细胞系的GBM原位筛选。基于如上所确定的其对FLI1的要求和生长动力学，选择所述两种GBM细胞系。这两种GBM细胞系用荧光素酶稳定转染，使得动物组可使用Xenogen系统筛选/监控。为了更详细的研究和体积比较，经选择的动物使用MRI评估。体外筛选细胞系，然后进行原位异种移植初步研究(2种细胞系x5只动物＝10只动物)。在Xenogen成像前，将动物腹腔内注射荧光素酶基质。将异种移植GBM肿瘤上的YK-4-279通过在肿瘤注射之后七天处理动物和具有症状性肿瘤的那些动物进行评估。将早期肿瘤用Xenogen筛选，并将尺寸与MRI相关，并当动物有5mm3病变时开始处理。YK-4-279穿过血脑屏障。通过BID注射与导致尤文氏肉瘤肿瘤退化的剂量类似的YK-4-279处理动物(图13)。所述研究将测量脑肿瘤体积、动物症状和总存活期。在尸检时，通过免疫组织化学评估肿瘤和正常邻近脑的GBM标志物、凋亡和FLI1调控的靶标基因。图13说明了用(S)-YK-4-279或外消旋物处理三天显示了显著的肿瘤退化。图13A：将具有ES异种移植的小鼠用400mg/kg化合物或对照如所指示处理。开始于确定的(well-established)肿瘤(300mm3)，将小鼠用6个总剂量的腹腔内化合物处理三天。图13B：来自相同实验的H和E染色的肿瘤。因为绝大多数具有GBM的患者表现出具有症状和相对较大的肿瘤，所以针对较大的出现症状的肿瘤测试YK-4-279。因此，在肿瘤被确定且出现症状的首次体征之后，通过处理动物且通过MRI针对确定的GBM(20mm3)评估YK-4-279。当时的肿瘤可用Xenogen检测到。在处理时使动物以一周两次进行Xenogen评估。所述研究比较了肿瘤体积、动物症状和总存活期。在尸检时，通过免疫组织化学评估肿瘤和正常邻近脑的GBM标志物、凋亡和FLI1调控的靶标基因。使用GBM的GEMM模型。如所公开的进行繁育动物(ChowLM,EndersbyR,ZhuX,RankinS,QuC,ZhangJ,等CooperativitywithinandamongPten,p53,andRbpathwaysinduceshigh-gradeastrocytomainadultbrain.CancerCell.2011年3月8日；19(3):305-16.PubMedPMID:21397855.PubmedCentralPMCID:3060664)。在大约90天的生命中，每10-14天对动物进行MRI评估以寻找GBM发作。在实验1中，用YK-4-279或对照在第90天开始处理动物(对照的10只动物和经处理的10只动物＝20只动物)。在实验2中，在症状或MRI测量的在任何维度大于2mm肿瘤出现时处理动物(对照的10只动物和经处理的10只动物＝20只动物)。在处理后，如上所述评估动物。使用腹腔内途径施用YK-4-279。提供数据以支持进一步探索FLI1且潜在地支持其它ets家族成员作为GBM的驱动因子。有关所选癌症的参考文献包括以下：CBTRUSStatisticalReport:PrimaryBrainandCentralNervousSystemTumorsDiagnosedintheUnitedStatesin2004-2008(3月23日，2012修订版)。美国脑肿瘤注册中心(CentralBrainTumorRegistryoftheUnitedStates)[Internet].2012；http://www.cbtrus.org。可获自：http://www.cbtrus.org。实施例11-使用YK-4-279治疗肺癌上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)是癌发病机理的关键因素。EMT诱导了细胞形态学和行为的显著变化，所述变化赋予了转移性表型和耐药性表型。此外，有证据表明EMT参与癌症干细胞的产生。肺癌是癌症相关的死亡率的主导因素，主要因为其通常在难于治疗的晚期阶段被诊断出。我们对癌症分子遗传学理解的进步已经鉴定了肿瘤发生所需的各个分子。这导致开发了成功用于治疗某些癌症的靶向疗法。这些分子靶标的实例包括细胞表面生长因子受体和胞内蛋白质酪氨酸激酶。不幸的是，此类治疗不能显著改善肺癌患者的总存活期或生活质量。本文所述的最近研究产生了以下假说：E-26转化序列(ETS)-相关基因ERG(ETS转录因子家族成员)的产物在EMT中起重要作用。此外，其通过直接上调锌指E-盒结合同源框1和2基因(ZEB1,ZEB2)表达诱导了EMT和上皮细胞的恶性进展。在肺癌细胞中ZEB1连接至EMT，并且使用siRNA抑制其表达不仅逆转了EMT而且还抑制肿瘤体外和体内生长。因为肺癌细胞表达高水平的ERG，所以ERG可通过ZEB诱导EMT。进行实验确定ERG是否参与由ZEB1/2介导的肺癌细胞EMT。产生YK-4-279的新型制剂并评估其可用于治疗肺癌。作为转录因子的ERG调控了对致癌作用重要的许多基因的表达。早期观察表明ERG的致癌性质包括其诱导上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)的能力。在不同实验系统中，ERG已显示诱导了锌指E-盒结合同源框1和2基因(ZEB1,ZEB2)的表达，该基因是癌症细胞中EMT的阳性调控子。因为EMT导致在NSCLC中的转移和耐药性，故抑制导致EMT的分子途径可具有重大的临床用途。确定了于肺癌细胞内ERG在调控EMT中的作用。测定NSCLC细胞系响应于ERG表达变化的EMT和耐药性表型。确定ERG是否如在其它上皮肿瘤中诱导那样诱导EMT。此外，确定在NSCLC中ERG介导的EMT是否通过ZEB1/2基因。这些实验涉及通过RNAi技术抑制NSCLC细胞中的ERG和ZEB表达。EMT表型通过针对经建立的EMT标志物的实时PCR和蛋白质印迹评估。生产可肠胃外施用的YK-4-279的制剂，并且确定YK-4-279对肺癌细胞的增殖和恶性性质的作用。一种示例性赋形剂是β-羟丙基环糊精(β-HPCD)。将NSCLC细胞用YK-4-279处理，并且在多个体外和体内模型中测量它们的响应。在免疫受损小鼠中测量细胞活力、趋化性、内皮细胞侵袭和异种移植物生长。测定YK-4-279与最常见的NSCLC化疗剂之间的潜在协同作用。由EMT介导的NSCLC细胞的耐药性和高转移性潜力的性质显著促进了NSCLC患者的不良预后。由EMT介导的NSCLC细胞的耐药性和高转移性潜力的性质显著促进了NSCLC患者的不良预后。逆转肺癌中EMT表型的特异性蛋白质使用小分子靶向。图14说明了ERG诱导了ZEB1和ZEB2表达，这激活了EMT，从而导致肺癌转移和耐药性。尽管分子生物学和细胞生物学最近的进展，但是对于癌症细胞生长需要的的特定分子的靶向药物仍然是较难的挑战。尽管驱动癌症细胞非调控性复制的蛋白质是已知的，但是可仅有一些用作有效疗法的靶标。实例包括胞内蛋白质酪氨酸激酶，其活性由用于治疗慢性骨髓性白血病的被称为甲磺酸伊马替尼的小分子抑制；和由用于治疗乳腺癌的单克隆抗体(曲妥珠单抗)，靶向细胞表面生长因子受体。这些有限但重大且非常令人鼓舞的成功已刺激了药物行业持续和稳健的研究。抑制酶活性或激活受体是针对除了癌症之外的多种疾病的广泛接受的药物开发目标，因为很好理解这些蛋白质的生物化学。相反，涉及蛋白质彼此结合的生物化学复杂得多且知之甚少，并且抑制这些相互作用因此几乎没有受到注意。ERG是用于设计靶向疗法的另一个挑战，因为其定位至细胞核并缺乏酶活性。YK-4-279是抑制ERG转录活性的小分子，并且研究其在NSCLC中的作用。确定YK-4-279是否通过结合至并干扰EMT所需的ERG功能(图14)可用于治疗NSCLC。ERG是致癌蛋白质。E-26转化序列(ETS)-相关基因ERG编码ETS转录因子家族的成员，即在许多组织中为内皮内稳态、分化和血管生成所必需的成员(LiuF,PatientR.Genome-wideanalysisofthezebrafishETSfamilyidentifiesthreegenesrequiredforhemangioblastdifferentiationorangiogenesis.Circulationresearch.2008；103:1147-54；SashidaG,BazzoliE,MenendezS,LiuY,NimerSD.TheoncogenicroleoftheETStranscriptionfactorsMEFandERG.Cellcycle.2010；9:3457-9)。证据表明了由ERG调控的某些基因的活性为血管生成所需。例如，需要ERG用于其表达的VE-钙粘蛋白为内皮结合稳定性和内皮存活所必需的，这两者是血管生成中的关键过程(YuanL,SacharidouA,StratmanAN,LeBrasA,ZwiersPJ,SpokesK,等.RhoJisanendothelialcell-restrictedRhoGTPasethatmediatesvascularmorphogenesisandisregulatedbythetranscriptionfactorERG.Blood.2011；118:1145-53)。在癌发生中，ETS转录因子参与多个基因的调控，所述基因参与转移所需的过程，包括胞外基质降解和细胞到细胞和细胞到基质结合形成(LelievreE,LionnetonF,SoncinF,VandenbunderB.TheEtsfamilycontainstranscriptionalactivatorsandrepressorsinvolvedinangiogenesis.Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology.2001；33:391-407)。具体实例包括血管内皮生长因子受体、内皮糖蛋白、基质金属蛋白酶、胶原酶1和血红素加氧酶1。ERG在造血细胞癌和上皮细胞癌中过表达，并用作人前列腺癌中的有效致癌基因(ChenY,ChiP,RockowitzS,IaquintaPJ,ShamuT,ShuklaS,等.ETSfactorsreprogramtheandrogenreceptorcistromeandprimeprostatetumorigenesisinresponsetoPTENloss.Naturemedicine.2013；RahimS,UrenA.EmergenceofETStranscriptionfactorsasdiagnostictoolsandtherapeutictargetsinprostatecancer.Americanjournaloftranslationalresearch.2013；5:254-68；TurnerDP,WatsonDK.ETStranscriptionfactors:oncogenesandtumorsuppressorgenesastherapeutictargetsforprostatecancer.Expertreviewofanticancertherapy.2008；8:33-42)。ERG和EMT意味着NSCLC中的不良临床结果。导致我们对ERG在肺癌中的作用感兴趣的值得注意的结果包括检测NSCLC中相对高水平的ERG表达和与正常组织相比在100％的肺肿瘤样品中存在可变剪接形式的ERG(XiL,FeberA,GuptaV,WuM,BergemannAD,LandreneauRJ,等.Wholegenomeexonarraysidentifydifferentialexpressionofalternativelyspliced,cancer-relatedgenesinlungcancer.Nucleicacidsresearch.2008；36:6535-47)。通过微阵列分析NSCLC组织样品中的mRNA表达：ERGmRNA表达排名在前8％(RamaswamyS,RossKN,LanderES,GolubTR.Amolecularsignatureofmetastasisinprimarysolidtumors.Naturegenetics.2003；33:49-54)，和在前11％(DingL,GetzG,WheelerDA,MardisER,McLellanMD,CibulskisK,等.Somaticmutationsaffectkeypathwaysinlungadenocarcinoma.Nature.2008；455:1069-75)。因为ERG靶标基因参与EMT表型，我们假设ERG介导的EMT可促进NSCLC的恶性表型。当细胞丧失其上皮特征并需要间充质细胞表型时，EMT首先描述于早期胚胎发育中(SatoM,ShamesDS,HasegawaY.Emergingevidenceofepithelial-to-mesenchymaltransitioninlungcarcinogenesis.Respirology.2012；17:1048-59)。随着EMT发展，细胞需要更能动和有侵袭性的表型。因此，EMT作为癌发生的重要组分而出现。EMT与NSCLC局灶性侵袭、血管生成、远距离转移以及耐药性和抗-凋亡表型之间的关联性已得到多个体内和体外进行的研究证实(表4)。例如，参与EMT的分子的表达与NSCLC的临床-病理特征(包括患者增加的转移和缩短的总存活期)相关(DauphinM,BarbeC,LemaireS,Nawrocki-RabyB,LagonotteE,DelepineG,等.Vimentinexpressionpredictstheoccurrenceofmetastasesinnonsmallcelllungcarcinomas.Lungcancer.2013；81:117-22)。此外，EMT在癌发生中的重要作用由干细胞的细胞表现特征表明(ManiSA,GuoW,LiaoMJ,EatonEN,AyyananA,ZhouAY,等.Theepithelial-mesenchymaltransitiongeneratescellswithpropertiesofstemcells.Cell.2008；133:704-15)。总之，这些研究为抑制在肺癌发展中发生的EMT提供了强有力的理由。表4列出了与NSCLC中的临床特征相关的EMT中涉及的分子。表4ERG靶标基因ZEB1介导了EMT。EMT是涉及多个信号传导途径的复杂细胞响应。锌指E-盒-结合同源框(ZEB)蛋白质是EMT的关键调控子(TakeyamaY,SatoM,HorioM,HaseT,YoshidaK,YokoyamaT,等.KnockdownofZEB1,amasterepithelial-to-mesenchymaltransition(EMT)gene,suppressesanchorage-independentcellgrowthoflungcancercells.Cancerletters.2010；296:216-24)。特别地，ZEB1通过调节编码参与EMT的蛋白质的基因的表达而在肺癌的EMT-相关的致癌表型中起主导作用。例如，在肺癌细胞系中siRNA抑制ZEB1表达导致EMT逆转、对多西他赛的敏感性增加和肺癌细胞体外和体内生长减少(RenJ,ChenY,SongH,ChenL,WangR.InhibitionofZEB1reversesEMTandchemoresistanceindocetaxel-resistanthumanlungadenocarcinomacellline.Journalofcellularbiochemistry.2013；114:1395-403)。最重要的，ERG在前列腺癌细胞中通过ZEB轴介导EMT(LeshemO,MadarS,Kogan-SakinI,KamerI,GoldsteinI,BroshR,等.TMPRSS2/ERGpromotesepithelialtomesenchymaltransitionthroughtheZEB1/ZEB2axisinaprostatecancermodel.PloSone.2011；6:e21650)。此外，miR-30在前列腺癌细胞中通过直接靶向ERG表达抑制EMT(KaoCJ,MartiniezA,ShiXB,YangJ,EvansCP,DobiA,等.miR-30asatumorsuppressorconnectsEGF/SrcsignaltoERGandEMT.Oncogene.2013)。这些和其它研究表明以下推断是合理的：在肺癌中靶向ZEB1和ZEB2以逆转EMT的努力可能是成功的。因为RNAi技术不够先进不能用于临床应用，因此有必要识别在肺癌中抑制ZEB1表达的替代机制。已知ERG结合位点存在于ZEB1和ZEB2启动子区域中(LeshemO,MadarS,Kogan-SakinI,KamerI,GoldsteinI,BroshR,等.TMPRSS2/ERGpromotesepithelialtomesenchymaltransitionthroughtheZEB1/ZEB2axisinaprostatecancermodel.PloSone.2011；6:e21650)。在2009年，我们发现YK-4-279作为EWS-FLI1抑制剂，EWS-FLI1为尤文氏肉瘤中由肿瘤-特异性重排基因编码的融合蛋白质(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.Naturemedicine.2009；15:750-6)。新近，基于两个ETS成员FLI1和ERG之间的同源性，YK-4-279直接结合至ERG并抑制其转录活性(RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279inhibitsERGandETV1mediatedprostatecancercellinvasion.PloSone.2011；6:e19343)。在肺癌细胞中抑制ERG功能可逆转由ZEB蛋白质介导的EMT，并导致抑制转移性生长和对化疗药物增加的敏感性。YK-4-279结合ERGYK-4-279，一种直接结合至EWS-FLI1并抑制尤文氏肉瘤细胞生长的小分子(ErkizanHV,KongY,MerchantM,SchlottmannS,Barber-RotenbergJS,YuanL,等.AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.Naturemedicine.2009；15:750-6)。EWS-FLI1是染色体易位的产物。FLI1是具有保守DNA结合结构域的ETS家族转录因子。比对FLI1与另一个ETS家族成员ERG，氨基酸序列显示了显著的类似性(63.5％同一性，80.2％同源性)。获得可商购获得的重组ERG蛋白质(Origene,Rockville,MD)并在BiacoreT-100上测量对YK-4-279的直接结合亲和力(图15)，所述BiacoreT-100在没有报道子部分的情况下实时检测分子相互作用。将重组蛋白质固定在Biacore微芯片上并在各种YK-4-279浓度的存在下测量结合。我们检测了YK-4-279以11.7μM的稳态KD结合至ERG。图15说明了YK-4-279与ERG蛋白质直接相互作用。将经纯化的重组ERG固定在BiacoreCM5微芯片上，并且通过SPR测定对八种不同浓度的YK-4-279(0.1-50μM)的直接结合。稳态KD使用Biaevaluation软件计算。YK-4279抑制ERG的转录活性。ETS蛋白质控制编码参与多个生化过程的蛋白质的靶基因的表达，许多所述生化过程有助于致癌生长(HollenhorstPC,McIntoshLP,GravesBJ.GenomicandbiochemicalinsightsintothespecificityofETStranscriptionfactors.Annualreviewofbiochemistry.2011；80:437-71)。利用启动子报道子测定和内源基因表达谱分析测试YK-4-279对ERG转录活性的作用。YK-4-279抑制了ERG激活控制COS7细胞中荧光素酶表达的ETS靶基因启动子(Id2)(图16A)。VCaP前列腺癌细胞具有TMPRSS2/ERG融合基因，其中ERG诱导了特定内源靶基因(诸如PLAU、ADAM19和PLAT)的表达。实时(RT)-PCR分析揭示了YK-4-279显著抑制了其表达但不抑制ERG表达(图16B)。将这些发现扩展至ERG和PLAU的蛋白质水平。由YK-4-279引起的抑制与当用ERGsiRNA处理细胞时观察到的抑制相当(图16B)(RahimS,BeauchampEM,KongY,BrownML,ToretskyJA,UrenA.YK-4-279inhibitsERGandETV1mediatedprostatecancercellinvasion.PloSone.2011；6:e19343)。因为上皮细胞不表达FLI1，故YK-4-279的作用最可能由于抑制ERG导致。这提供了另外的证据即YK-4-279不仅是通用的转录和翻译抑制剂(ERGmRNA和蛋白质水平不改变)，而且其特异性抑制ETS家族蛋白质的转录活性。ERG在NSCLC细胞系中表达并诱导EMT标志物检查五种NSCLC细胞系以确认存在与在人肿瘤样品中观察到的ERG表达类似的显著ERG表达。进行A549、H1944、H358、H1395和H596细胞裂解物的蛋白质印迹分析(图17)。5种细胞系中的四种表达高水平的ERG蛋白质。表达极低ERG的H358细胞系将在我们研究中用作阴性对照。在其它肿瘤类型中的早期工作表明ERG可诱导EMT。为了测试，如果相同效果存在于NSCLC细胞中，则将ERG表达载体转染至具有相对极低水平的内源ERG蛋白质的H358细胞(图18A)。当H358细胞表达高水平的ERG蛋白质时，我们观察到两种EMT标志物ZEB1和Foxc2表达显著增加(图18B)，表明ERG可在NSCLC细胞中诱导EMT。图18A和图18B说明了ERG表达诱导了EMT标志物。将H358NSCLC细胞用编码人ERG蛋白质的cDNA转染。增加的ERG表达通过蛋白质印迹检测(图18A)。实时PCR分析揭示了在ERG表达细胞中ZEB1和FOXC2的更高表达(图18B)。将数据首先针对18SRNA标准化，然后表达为基于空载体转染的细胞的倍数减少。YK-4-279抑制ERG依赖性EMT标志物的表达A549细胞表达了相对高水平的ERG蛋白质(图17)。我们通过实时定量PCR评估了这些细胞中的EMT标志物基因表达(图19)。TGF-β，一种已知的EMT诱导剂处理A549细胞导致增加的ZEB1和FOXC2表达。当未转染的A549细胞用ERG抑制剂YK-4-279处理时，我们观察到完全相反，ZEB表达和FOXC2表达都被抑制。本文呈现的初始数据证实YK-4-279直接结合至ERG蛋白质并抑制其作为转录因子的功能。此外，我们证明ERG可在NSCLC细胞中诱导EMT标志物，并且该作用可由YK-4-279逆转。该章节中概述的实验测试了以下假设：ERG通过诱导(EMT)促进NSCLC的发病机理和ERG可用作肺癌疗法的靶标。我们确认了ERG可被作为新治疗方法的YK-4-279成功抑制。ERG在肺癌细胞中介导EMT的作用我们评价了调控ERG表达水平对肺癌细胞系特别是关于EMT的作用。来源于非小细胞肺癌的H358细胞系表达相对低水平的内源ERG蛋白质(图17)。我们在这些细胞中引入ERG-表达载体以提升ERG水平。其它肺癌细胞系(A549、H1944、H1395和H596)表达极高水平的内源ERG。我们使用靶向ERG的RNA干扰技术(shRNA或siRNA)以降低其在这些细胞中的表达水平。在每种情况下，对EMT的作用通过测定mRNA及其用作EMT的特异性标志物的同源蛋白质的表达水平来评估，同源蛋白质如下：E-钙粘蛋白、波形蛋白、Snail、Slug和ZEB1。观察到过表达ERG的H358细胞中升高的EMT表达谱，或其中ERG表达已被RNA干扰抑制的细胞(A549、H1944、H1395和H596)中减少的EMT表达谱，我们通过测定ZEB1和ZEB2siRNA的作用延展了这些研究。如果当ZEB1和ZEB2表达受到抑制时ERG对EMT的作用减少，则支持以下假设：ERG通过ZEB1和ZEB2介导EMT功能。我们测定了五种NSCLC细胞系上常见化疗剂顺铂、紫杉醇、吉西他滨、依托泊苷和长春碱的IC50值。细胞活力通过电阻抗和WST测定测定。一旦基线IC50值确定，则我们就通过改变的EGR表达重复实验。在A549,H1944,H1395,andH596细胞中用shRNA抑制ERG表达。如果不可获得稳定的shRNA表达和减少的ERG蛋白质表达，则我们将通过瞬时转染靶向ERG的siRNA进行这些实验。NSCLC细胞系中减少的ERG表达被预期使IC50曲线明显地移动至左边，使得所述细胞变得对这些化疗剂更敏感。为了补充这些实验，我们建立了稳定的H358细胞系，其从哺乳动物表达载体表达高水平的ERG蛋白质。在该细胞系中，我们见到了IC50曲线明显地移动至右边，使得所述细胞变得对化疗更耐受。制备可肠胃外施用的YK-4-279的新型制剂并且测定YK-4-279对肺癌细胞的增殖和恶性性质的作用。先导赋形剂是β-羟丙基环糊精(β-HPCD)，同时β-HPCD是临床可行的媒介物。将前七种制剂与HPβCD的动力学比较。按照时间点在0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟和480分钟时IP注射CD-1。24小时点也检查了延迟清除率。按照时间点在0、5、10、15、30、60、120、180、240时IV注射的一系列CD-1小鼠用于测量吸收水平。分析血浆并计算药代动力学参数。这些研究的目标是通过比较吸收和半寿期确定是否存在对于HPβCD的优良制剂。如果制剂可实现IP吸收并维持血浆水平大于3μM持续24小时，我们认为这是显著改善。这使得我们评估与连续输注疗法相比的每日给药。每日给药而非连续IV的使用对于未来动物和临床研究是优选的。我们通过用YK-4-279处理细胞抑制了ERG功能。如上所述测定EMT标志物的变化以确认YK-4-279处理导致与缺乏ERG(siRNA或shRNA)相同的EMT标志物表达曲线。以下实验的目的是评估当改变EMT时对功能结果的作用。为了该目的，我们评估了如下恶性表型的替代标志物：细胞运动性、趋化性、内皮细胞单层的侵袭、在塑料上的生长、在软琼脂中的生长及作为异种移植物的体内生长。在平行实验中，将细胞用YK-4-279和各种浓度的不同NSCLC化疗剂(包括顺铂、紫杉醇、吉西他滨、依托泊苷和长春碱)处理。我们观察到由与这些药物组合的YK-4-279诱导的协同抑制作用。为了支持抑制ERG表达通过ZEB1/2减少了EMT的假设，我们确定了强制(enforced)过表达ZEB1/2是否逆转YK-4-279对细胞表型的作用。我们测试了YK-4-279对NSCLC细胞运动性和侵袭的作用。我们使用xCELLigence系统测试了YK-4-279抑制NSCLC细胞侵袭的能力。该新方法使得能够以经典Boyden室方式用在多孔膜(xCELLigencesim-板)底面上的一层金电极实时测量细胞运动性。由于所述细胞从上室移动穿过膜到下室内的化学引诱物，故它们增加了所述膜下表面上的电阻抗，所述电阻抗实时记录。相同的仪器还用于测量穿过内皮单层的侵袭(RahimS,UrenA.Areal-timeelectricalimpedancebasedtechniquetomeasureinvasionofendothelialcellmonolayerbycancercells.Journalofvisualizedexperiments:JoVE.2011)。在该实验方式中，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长在表面上具有金电极的常规细胞培养板上(xCELLigenceE-板)。一旦内皮细胞形成稳定的单层，就将NSCLC细胞添加在顶部。因为癌症细胞破坏了内皮细胞之间的紧密连接并穿透内皮层，故它们改变了电阻抗。这些实验使得我们评估了YK-4-279是否改变NSCLC细胞的运动性、趋化性和侵袭表型。我们在细胞培养物中通过滴定YK-4-279和化疗剂(顺铂、紫杉醇、吉西他滨、依托泊苷和长春碱)进行了协同研究。细胞死亡用作终点，并且任何潜在的协同作用通过复合指数(CI)等效应图等式法计算(ChouTC.Theoreticalbasis,experimentaldesign,andcomputerizedsimulationofsynergismandantagonismindrugcombinationstudies.Pharmacologicalreviews.2006；58:621-81)。我们测试了ERG抑制对3种不同的人NSCLC异种移植(两种具有高ERG表达和一种具有低ERG表达)生长的作用。将于基质胶中制备的细胞混悬剂皮下植入四至六周龄的雄性SCID小鼠。调整采集速率，向两组动物(10只动物/异种移植系)施用抑制剂YK-4-279，和基于每种异种移植配制研究的载体(仅安慰剂)。当肿瘤达到200mm3大小时开始药物处理。每周测量两次肿瘤生长和体重。所有实验组具有83％的功效(p<0.05)以检测总肿瘤体积的35％差异。在第八周或如果动物变得受损(初始肿瘤达到2000mm3、初始肿瘤形成溃疡或小鼠显示出疼痛和痛苦的体征)则更早收集动物。将一半的肿瘤组织包埋在石蜡中以用于免疫组织化学分析，并且另一半被快速冷冻以用于分子分析。我们假设在NSCLC异种移植中阻断ERG活性可导致初始肿瘤大小减小。尽管本公开已详细说明并在附图和前文描述中描述，但此类说明和描述被认为是说明性或示例性的而非限制性的。公开内容不限于公开的实施方案。对公开的实施方案的变型可被实施要求保护的公开内容的领域的技术人员通过学习附图、公开内容和随附权利要求而理解和实现。本文引用的所有参考文献通过引用以其整体方式并入本文。在通过引用并入的公开和专利或专利申请与说明书所含的公开内容矛盾的情况下，说明书意在替代和/或优先于任何此类矛盾的材料。除非另外说明，否则所有术语(包括技术和科学术语)被赋予本领域普通技术人员常见和习惯的含义，并且除非本文明确定义否则不限于特定的或自定义的含义。应注意，当描述本公开的某些特性或方面时使用特定术语不应该被认为暗示此术语在本文被重新定义以限定地包括与此术语相关的本公开的特性或方面的任何特征。本申请中使用的术语和短语及其变型，特别是在随附权利要求书中的术语和短语及其变型，除非另外明确说明否则应被理解为开放的而不是限制性的。作为前述的实例，术语‘包括’应被解读为意指‘包括不限于’、‘包括但不限于’等；如本文所用的术语‘包含’与‘包括’、‘含有’或‘特征在于’同义，并且是包含性的或开放性的且不排除另外的、未陈述的元素或方法步骤；术语‘具有’应被理解为‘至少具有’；术语‘包括’应被理解为‘包括但不限于’；术语‘实例’用于提供讨论中的项目的示例性实例，而不是其详尽性或限制性列表；形容词诸如‘已知的’、‘正常的’、‘标准的’及具有类似含义的术语不应被理解为限制所述的项目为给定的时期或到给定时间为止可获得的项目，但反而应被解读为涵盖现在或在未来的任何时间可获得或已知的已知的、正常的或标准的技术；及使用术语如‘优选’、‘优选的’、‘所需的’或‘合意的’及具有类似含义的词汇不应理解为暗示某些特征对本发明的结构或功能是关键的、必需的或甚至重要的，但反而理解为仅意在强调可或不可用于本发明的特定实施方案中的可替代或另外的特征。同样地，除非明确说明，否则与连接词‘和’连接的一组项目不应被解读为这些项目中的每个或每一个存在于分组中，而被解读为‘和/或’。类似地，除非明确说明，否则与连接词‘或’连接的一组物品不应被解读为需要在此组中的互斥性，而应被解读为‘和/或’。在提供值的范围的情况下，应理解，上限和下限及在该范围的上限和下限之间的每个插入值都被涵盖在实施方案内。就本文使用的基本上任何复数和/或单数术语而言，只要适合于上下文和/或应用，则本领域技术人员可由复数转化为单数和/或由单数转化为复数。为清楚起见，各种单数/复数转换可以在本文明确指出。不定冠词“一个”或“一种”不应排除多个。单个处理器或其他单元可以实现权利要求中陈述的若干项的功能。在相互不同的从属权利要求中陈述的某些措施的起码事实并不表示这些措施的组合不能被有利地使用。权利要求中的任何参考标记不应当被解释为限制范围。本领域技术人员还应理解，如果特定数目的所介绍的权利要求陈述是预期的，那么将在该权利要求中明确陈述这种意图，并且在不存在这样的陈述下，这样的意图未被提出。例如，为有助于理解，以下所附的权利要求书可含有使用介绍性短语“至少一个/种”和“一个或多个/一种或多种”来介绍权利要求陈述。然而，这些短语的使用不应当被理解为暗示由不定冠词“一个”或“一种”介绍权利要求陈述限制含有此类介绍的权利要求陈述的任何特定权利要求为仅含有一个此类陈述的实施方案，甚至当相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/种”及不定冠词诸如“一个”或“一种”(如“一个”和/或“一种”应通常被理解为意指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”)时；这同样适用于用于介绍权利要求陈述的定冠词的使用。此外，即使明确地陈述特定数目的所介绍的权利要求陈述，本领域的技术人员将认识到此类陈述应通常被理解为意指至少陈述的数目(如没有其他修饰语的“两个陈述”的裸陈述(barerecitation)通常意指至少两个陈述、或两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一者”的惯例的那些情况下，通常此类构建的目的在于在这个意义上本领域的技术人员将会理解这个惯例(例如，“一个具有A、B和C中的至少一者的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B两者、具有A和C两者、具有B和C两者、和/或具有A、B和C三者等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一者”的惯例的那些情况下，通常这样的构建的目的在于在这个意义上本领域的技术人员将会理解这个惯例(例如，“一个具有A、B或C中的至少一者的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B两者、具有A和C两者、具有B和C两者、和/或具有A、B和C三者等的系统)。本领域的技术人员将进一步理解地是，实际上无论是在说明书、权利要求书中，还是在附图中，呈现两个或更多个可替代术语的任何转折性词语和/或短语都应当理解为考虑包括这些术语中的一者、这些术语中的任一者、或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。用于本说明书中的表达成分、反应条件等的数目的所有数目被理解为在所有情况下由术语‘约’修饰。因此，除非有相反的指示，否则本文阐述的数值参数是近似值，其可根据期望的寻求获得的性质而变化。在最低限度，并且不试图限制对要求本申请优先权的任何申请中的任何权利要求的范围应用等同原则，应当根据有效数字个数和普通舍入方法解释每个数值参数。本申请要求优先权的任何申请中的任何权利要求的范围。此外，尽管为了清楚和理解的目的前文已通过阐释和实例得以详细描述，本领域的技术人员将显而易见可实施某些改变和修改。因此，描述和实例不应理解为限制本发明的范围为本文所述的特定实施方案和实例，而且还覆盖伴随本发明的真正范围和精神发生的所有修改和变化。