石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及石墨烯修饰的生物陶瓷支架及其制备方法和用途，属生物材料领域。

背景技术：

癌症，是新世纪人类健康的最大威胁之一。骨特殊的微观环境极易导致其他癌症转移到骨，乳腺癌、前列腺癌、肺癌极易会转移到骨[1]。因此骨癌的治疗也受到很大的关注。目前最常用的是化疗和手术相结合的方法，通过切除肿瘤病灶，再利用骨移植材料修复损伤[2]。然而手术治疗通常无法根治已有肿瘤转移的晚期病人，放疗和化疗对病人会造成很大的毒副作用[3]。光热治疗作为较为安全的新型肿瘤治疗方法得到了广泛关注[4]。光热治疗在增加肿瘤疗效和减小副作用上展现了显著地优势。只有暴露在光照下的肿瘤才会有损伤，不会对没有光照的正常组织造成明显的伤害。因此，如何开发兼有骨修复和抗肿瘤能力的生物材料仍然是一个重大的挑战。先前的研究表明，石墨烯具有很好的光热性能[5]，生物相容性好[6]，可用于组织工程。多级孔结构三维支架，提供一个有利于细胞黏附、增殖、分化及生长的三维支架式外环境。

参考文献：

[1]Marjolein van Driel,Johannes P.T.M.van Leeuwen.Cancer and bone:A complex complex.Archives of Biochemistry and Biophysics 2014；561:159–166.；

[2]Drew D,Moore and Hue H.Luu.Osteosarcoma.Cancer Treat Res 2014；162:65-92.；

[3]Peer D,Karp JM,Hong S,Farokhzad OC,Margalit R,Langer R.Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.Nat Nano 2007；2:751-760.；

[4]D.Jaque,a L.Mart′inez Maestro,a B.del Rosal,a P.Haro-Gonzalez,a A.Nanoparticles for photothermal therapies.Nanoscale 2014；6:9494–9530.；

[5]Yang K,Zhang S,Zhang G,Sun X,Lee S-T,Liu Z.Graphene in Mice:Ultra-high in vivo Tumor Uptake and Photothermal Therapy.Nano letters 2010；10:3318-3323.；

[6]Nayak TR,Andersen H,Makam VS,Khaw C,Bae S,Xu X,et al.Graphene for controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.ACS Nano 2011；5:4670-8.。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种兼有骨修复和抗肿瘤能力的石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料及其制备方法和应用。

在此，一方面，本发明提供一种石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料，其特征在于，包括β-磷酸三钙支架和均匀涂覆于所述β-磷酸三钙支架的表面的石墨烯层。

本发明的石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料(简称“β-TCP-GRA”)中，β-磷酸三钙支架具有良好的诱导骨髓基质干细胞的成骨分化能力和体内促进成骨的能力，可以起到修复骨缺损的作用；石墨烯的功能化并没有改变生物陶瓷支架的生物活性，而且石墨烯具有良好的光热性能，在近红外光照射下可有效杀死肿瘤细胞，因此，本发明的石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料具有很好的抗肿瘤能力和促进成骨的特性，可以作为切除骨肿瘤后的修复材料，同时利用其光热性能，杀死残余肿瘤细胞，起到治疗与修复的双重作用。

较佳地，所述β-磷酸三钙支架是通过3D打印制得的多级孔结构三维支架(大孔100～500μm，小孔约1μm)。

较佳地，所述石墨烯层的厚度为1～10nm。

另一方面，本发明提供上述石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将β-磷酸三钙粉末与粘结剂以一定比例充分混合，利用三维打印技术制备β-磷酸三钙支架；

(2)将打印出的β-磷酸三钙支架进行烧结，得到β-磷酸三钙陶瓷支架；

(3)将所得的β-磷酸三钙陶瓷支架浸泡在石墨烯溶液中一定时间后干燥，即得到石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料。

本发明中，通过3D打印制备β-磷酸三钙支架，无需模具即可制备形状复杂的三维支架，而且容易制得孔径和孔隙率可控的多孔级结构三维支架。此外，通过简单的浸泡法即可在支架表面修饰石墨烯，制备工艺简单，可控性强，重复性好。

较佳地，步骤(1)中，β-磷酸三钙粉末与粘结剂的质量比为(1.5～2):1。

较佳地，所述粘结剂包括聚乙烯醇、海藻酸钠、和/或甲基纤维素等。

较佳地，步骤(1)中，三维打印的参数为：单层厚度为1mm，粘结剂浓度为5～15wt％，打印速度为1～10mm/s,气压为400～700kPa。

较佳地，步骤(2)中，在1100～1150℃烧结3～5小时。

较佳地，步骤(3)中，所述石墨烯溶液的浓度为0.25～1.0mg/mL，浸泡次数为1～6次，每次浸泡时间为10～15分钟。

再一方面，本发明还提供上述石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料在制备用于切除骨肿瘤后的骨修复和骨肿瘤治疗的材料中的应用。

附图说明

图1为纯β-磷酸三钙支架光学显微镜图(a)，SEM图(b)，β-TCP-GRA光学显微镜图(c)，SEM图(d)。从图中可以看出石墨烯均匀的修饰在β-TCP表面；

图2为β-TCP-GRA光热性能图。从图中可以看出β-TCP-GRA在极短时间内，就可以迅速升温，具有优良的光热性能；

图3为骨髓基质干细胞的增殖(a)和ALP活力表达(b)，β-TCP-GRA提高了骨髓基质干细胞的成骨相关的基因表达(c),(d),(e),(f)；

图4为在植入两种材料4周和8周后，在缺损处骨形成能力的Micro-CT分析，植入β-TCP-GRA组在缺损处形成的新骨明显比植入纯β-磷酸三钙支架组多；

图5为在缺损处植入两种材料4周和8周后的组织切片分析，石墨烯修饰组新骨形成的量明显比β-TCP组更多，骨质更好；

图6为利用808nm近红外光照射两种材料，光照前后肿瘤细胞数量的变化。可看出β-TCP-GRA能有效杀死肿瘤细胞；

图7为改变光照时间，肿瘤数量的变化，可见光照30min，肿瘤死亡率更高。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明一方面提供一种石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料(β-TCP-GRA)，其包括β-磷酸三钙支架和均匀涂覆于所述β-磷酸三钙支架的表面的石墨烯层，石墨烯是以薄膜层涂覆用于支架表面。图1示出发明一个示例的β-TCP-GRA的光学显微镜图和SEM图(图1(c)、(d))以及未修饰石墨烯的纯β-磷酸三钙支架的光学显微镜图和SEM图(图1(a)、(b))。从图中可以看出石墨烯均匀地修饰在β-TCP表面。其中石墨烯层的厚度可为1～10nm。

本发明中，作为支架的β-磷酸三钙支架可以是多级孔结构三维支架。多级孔结构中，可以是大孔100～500μm，小孔约1μm。另外，其优选为通过3D打印制得。通过3D打印，可以无需模具即可制备形状复杂的三维支架，而且可以控制多孔级结构的孔径和孔隙率。

通过在β-磷酸三钙支架表面修饰石墨烯，一方面，β-磷酸三钙支架能够很好地支持骨髓基质干细胞粘附，增殖和碱性磷酸酶的表达；另一方面，石墨烯具有优异的光热性能，可有效杀死肿瘤细胞，而且石墨烯的功能化并不会改变β-磷酸三钙生物陶瓷支架的生物活性， 以此本发明的β-TCP-GRA具有很好的抗肿瘤能力和促进成骨的特性(参见后述的生物活性测试)，可作为切除骨肿瘤后的修复材料，同时利用其光热性能，杀死残余肿瘤细胞，起到治疗与修复的双重作用。

上述石墨烯修饰的生物陶瓷支架材料的制备可以包括：利用三维打印技术制备出β-TCP支架；将制得的β-TCP支架浸泡在石墨烯溶液中，得到石墨烯功能化的生物活性陶瓷支架。

在利用三维打印技术制备β-TCP支架的一个示例中，采用β-磷酸三钙粉末为原材料，并将其与粘结剂充分混合，同时调整其与粘结剂的比例，例如β-磷酸三钙粉末和粘结剂的质量比可为(1.5～2):1，其中粘结剂包括但不限于聚乙烯醇、海藻酸钠、甲基纤维素等；然后利用软件设计支架具体参数，调控支架的形状、尺寸等，进行3D打印。3D打印的参数可包括：单层厚度为1mm，粘结剂浓度为5～15wt％，打印速度为1～10mm/s,气压为400～700kPa。

通过3D打印制得的β-TCP支架素坯进行烧结，制得β-磷酸三钙陶瓷支架。其中烧结例如可在1100～1150℃烧结3～5小时。

利用石墨烯对β-磷酸三钙陶瓷支架进行改性。在一个示例中，改性方法是将支架浸泡在石墨烯溶液中一定时间后进行干燥。其中所浸泡的石墨烯溶液的浓度可为0.25～1.0mg/mL。浸泡次数可为一次以上，例如为1～6次，每次的浸泡时间可为10～15分钟。通过改变浸泡次数、石墨烯浓度等可对功能化支架的光热性能进行调控。

以下，作为示例，说明本发明的一个实施方式。

1.石墨烯修饰的β-磷酸三钙陶瓷的制备和表征：

(1)将β-磷酸三钙粉与PVA按质量比(1.5－2):1的比例混合，利用软件设计好所需程序，进行三维打印；

(2)将打印好的支架在1100－1150℃煅烧3-5小时，得到β-磷酸三钙陶瓷；

(3)将β-磷酸三钙陶瓷浸泡在0.25-1mg/mL的石墨烯中，浸泡1-6次，每次时间为10-15min。然后再120℃烘箱内干燥；

(4)通过光学显微镜和SEM对合成的功能化支架进行表征。

2、GO功能化的β-磷酸三钙的性能评价

2.1、功能化支架的光热性能

将β-磷酸三钙支架分别浸在石墨烯中，通过改变浸泡次数、石墨烯浓度、激光功率等可对功能化支架的光热性能进行调控。利用808nm近红外光照射功能化支架，利用热成像仪实时 监控温度变化，结果参见图2，显示功能化支架在极短时间内，温度显著升高，具有良好的光热性能。

2.2、功能化支架与骨髓基质干细胞的相互作用

将骨髓基质细胞种分别植在纯β-磷酸三钙和功能化后的β-磷酸三钙支架上，培养1，3，7天后用扫描电镜观察细胞的形貌，并采用MTT法检测细胞的增殖能力。通过RT-PCR测试骨髓基质干细胞在陶瓷片上的基因表达。结果参见图3，结果表明骨髓基质干细胞能够在两种支架材料上进行很好的黏附和增殖，石墨烯功能化支架相对于纯β-磷酸三钙陶瓷更能促进骨髓基质干细胞的成骨相关的基因表达。说明功能化支架具有很好的诱导骨髓基质干细胞的成骨分化能力。

2.3、功能化支架动物体内成骨能力

本发明首次证实GO修饰的β-磷酸三钙有促进体内成骨的能力。GO修饰后的支架具有很好的矿化能力，而纯β-磷酸三钙支架不具备这样的能力。Micro-CT结果(参见图4)显示植入GO修饰支架组在缺损处形成的新骨明显比植入纯β-磷酸三钙支架组多。组织切片分析(参见图5)显示植入材料4周后，β-TCP组骨缺损周围形成少量的新骨，而石墨烯修饰组在骨缺损周围和中心都有新骨形成。植入8周后，石墨烯修饰组新骨形成的量明显比β-TCP组更多，而且骨质更好。以上结果，说明功能化支架具有很好的体内促进成骨的能力。

2.4、功能化支架抗肿瘤能力

将MG-63骨肿瘤细胞种植在纯β-磷酸三钙和功能化后的β-磷酸三钙支架上，培养1、3天后，利用808nm近红外光对两种支架光照10min。用扫描电镜观察两种支架上的细胞在光照前后细胞形貌的变化，并采用MTT法检测细胞的数量的变化。结果(参见图6)显示功能化支架组光照后肿瘤细胞显著减少，而纯β-磷酸三钙支架光照前后细胞数量没有显著变化。图7示出改变光照时间时肿瘤数量的变化，可见光照30min，肿瘤死亡率更高。以上说明功能化后，利用其优异的光热性能，可以有效杀死肿瘤细胞。

石墨烯功能化的生物活性陶瓷支架具有优异的光热性能，通过改变石墨烯浓度、浸泡时间、浸泡次数、激光功率，可对其光热性能进行调控。利用808nm近红外光照射功能化材料，可有效杀死肿瘤细胞。同时功能化并没有改变生物陶瓷支架的生物活性，能够很好地支持兔子的骨髓基质干细胞粘附，增殖和碱性磷酸酶的表达。动物体内实验进一步证实，功能化支架具有促进成骨的能力。因此，制备的石墨烯功能化的β-TCP具有很好的抗肿瘤能力和促进成骨的特性，可作为切除骨肿瘤后的修复材料，同时利用其光热性能，杀死残余肿瘤细胞，起到治疗与修复的双重作用。本发明的功能化支架不仅具有较好的体外生物活 性，体内促进成骨能力，而且利用其光热性能，可有有效抗肿瘤。有望作为切除骨肿瘤后的骨修复和骨肿瘤治疗材料。是一种潜在的多功能硬组织生物活性植入材料。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实例1：

(1)纯β-磷酸三钙粉体4.5g，与3gPVA充分混合后，利用三维打印技术制备支架材料；

(2)将打印支架在1100℃煅烧3小时，得到纯的β-磷酸三钙陶瓷；

(3)将纯β-磷酸三钙支架浸泡在1mg/mL石墨烯中10min，涂覆3次；

(4)在120℃烘箱内干燥，制得β-TCP-GRA；

然后采用上述方法进行生物活性，成骨性和抗肿瘤性的评价。

实例2：

(1)纯β-磷酸三钙粉体4.5g，与2gPVA充分混合后，利用三维打印技术制备支架材料；

(2)将打印支架在1150℃煅烧3小时，得到纯的β-磷酸三钙陶瓷；

(3)将纯β-磷酸三钙支架浸泡在0.5mg/mL石墨烯中10min，涂覆6次；

(4)在120℃烘箱内干燥，制得β-TCP-GRA；其结构表征结果参见图1；

然后采用上述方法进行生物活性，降解性和细胞相容性的评价，结果参见图2～图7。