翻白草总黄酮在制备预防和治疗缺血性脑卒中药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种预防和治疗缺血性脑卒的药物的应用，尤其是涉及一种翻白草总黄酮在制备预防和治疗缺血性脑卒药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

脑卒中是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病。其中以缺血性脑卒中的发病率高，占脑卒中总数的60%～70%。引起缺血性脑卒中的根本原因是，供应脑部血液的颅外或颅内动脉中发生闭塞性病变而未能获得及时、充分的侧支循环，使周部脑组织的代谢需要与可能得到的血液供应之间发生供不应求所致。

脑卒中是全球范围内危害人类健康的一大杀手，其发病率高、死亡率高、致残率高，严重危害人类身体健康与生活质量。据WHO统计，目前全球约有5 亿脑卒中患者，造成巨大的疾病负担。我国更是脑卒中的高发地区，目前每年新发脑卒中患者约有200万例，且还在以每年8.7％的速率迅速增长，每年死亡约165万人，预计到2030年，脑卒中死亡人数将达600万。如何预防脑卒中，降低高危人群的脑卒中风险成为国内外研究热点。

中医药对一些重大疾病的治疗具有其特有的特点和优势，发挥中药优势，研发具有自主知识产权和国际竞争力的治疗脑卒中的创新中药，可以显著提升我国中医药在重大疾病防治领域的研究水平和市场竞争力。

翻白草，为蔷薇科委陵菜属植物翻白草的带根全草。《本草纲目》载其：气味甘，微苦，性平，无毒；有清热解毒、凉血止血功效，主治肺热咳喘、泻痢、咳血、痈肿疮毒等。近年来民间流行用翻白草治疗糖尿病并取得一定疗效。现有研究表明，翻白草具有降血糖作用，且主要是与其所含的黄酮类成分有关，而黄酮类成分也是翻白草中最为主要的一类成分之一。

然而，目前对于翻白草黄酮类成分的研究还少有报道，而对于其应用的研究也多局限于降血糖作用方面。本申请的发明者在开发了一种有效的翻白草黄酮类成分分离纯化工艺的基础上，对于其在预防和治疗缺血性脑卒中的应用进行了研究，并确定了其在该领域的应用效果。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种疗效好、副作用少的预防和治疗缺血性脑卒中的中药。

本发明的技术方案为：

翻白草总黄酮在制备预防和治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

上述的药物的剂型为口服剂型或注射剂型，所述的口服剂型具体可为片剂、胶囊剂、冲剂、口服液中的任一种。

本发明的有益效果为：本发明所述的翻白草总黄酮在氧糖缺乏细胞模型以及大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）动物模型中具有显著的治疗效果，且其制备的药物具有毒副作用小，可显著提升我国中医药在重大疾病防治领域的研究水平和市场竞争力。

附图说明

图1为氧糖缺乏诱导PC12细胞损伤实验细胞存活率比较（n=3）；

图2为翻白草总黄酮对大鼠缺血再灌注损伤引起的神经功能缺损的影响；

图3为翻白草总黄酮对大鼠缺血再灌注损伤梗死面积的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：

翻白草总黄酮对氧糖缺乏诱导PC12细胞损伤的影响

细胞缺糖缺氧(OGD)损伤是多种临床上常见的缺血性损伤(如脑缺血、心肌缺血)的病理基础。尤其是脑组织缺血时，由于其高能耗低能储的能量代谢特点，一旦组织缺血、缺氧，神经细胞首先出现能量代谢障碍，引发一系列的细胞结构和功能上的改变导致神经细胞的损伤甚至死亡，本实施例应用体外氧糖剥夺建立细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程。

PC12细胞具有典型的神经内分泌细胞特征，其纯化程度高，繁殖速度快，培养周期短，使用方便且易检测，已被广泛用于神经细胞分化、离子通道、信号转导、受体及递质等研究工作中，采用的MTT方法快捷、经济，是筛选化合物活性的最佳方法之一。

1、药品

翻白草总黄酮，由江苏天晟药业有限公司提供，含量95.0%，药物均按实验要求配制成适宜浓度。

PC12(大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞)细胞株购自中科院上海细胞库。

2、实验方法

PC12细胞经胰蛋白酶消化后，悬于含10%新生牛血清的DMEM(低糖)培养液中。以6×10⁴cells/mL的密度将PC12细胞接种于96孔培养板上（一块板单独设置为正常对照组），接种体积为100μl/well，置于含5% CO₂的37℃恒温培养箱内培养。培养24h后，在给药组中加入相应浓度的待测化合物 (10μl/well)，正常对照组及氧糖缺乏损伤组加入化合物溶剂1%DMSO对照(10μl/well)。孵育2小时后，将氧糖缺乏损伤组及给药组均用无糖EBSS平衡盐溶液润洗一遍细胞，随后换成DMEM（无糖）培养液，并再次在给药组中加入相应浓度的待测化合物(10μl/well)，正常对照组换成含血清DMEM(LG)并加入化合物溶剂对照(10 μl/well)。将给药组及损伤组放入厌氧工作站内，通入5%CO₂、10%H₂、85%N₂混合气体缺氧3小时。正常对照组放入含5% CO₂的37℃恒温培养箱中。3小时后将培养板从厌氧工作站内取出，将氧糖缺乏损伤组及给药组加入100g/L的葡萄糖 (1μl/well)，终浓度为1g/L；并同时补回血清至终浓度9%。继续培养24小时后，加入5 mg/mL MTT (10μl/well)，进行活细胞染色。孵育3小时后，弃去培养液，加入100% DMSO (100μl/well)，并在摇板机上振摇使之充分溶解。490nm的波长下测定各组的OD值，重复试验三次，采用统计学方法对数据进行分析，计算出细胞存活率，用平均值 (Mean）±标准误(SEM）表示，图1为氧糖缺乏诱导PC12细胞损伤实验细胞存活率比较（n=3），如图1所示：图1中的数值为细胞存活率，用平均值(Mean）±标准误(SEM）表示，正常对照组存活率设为100%，其余各组为与正常组相比的百分值。^##p<0.01相比于正常对照组, **p<0.01相比于模型组。

图1中检测结果表明：翻白草总黄酮对于氧糖缺乏诱导的PC12细胞损伤均有较强的保护作用，且与其药物浓度呈正相关（p＜0.01）。

实施例2：翻白草总黄酮对大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）的影响

1、药品及动物

水合氯醛、75%消毒酒精由国药集团提供；2，3，5—三苯基氯化四氮唑（TTC）购自沃凯公司；栓线2636#、2838#购自北京沙东生物公司。

SD大鼠30只(购自上海斯莱克实验动物中心)，雄性，250-300g。实验前禁食12h，自由饮水。

2、实验方法

2.1、实验分组

将大鼠随机分成三组：假手术组（n=10），缺血再灌注组（n=10），翻白草总黄酮组（n=10）。

2.2、实验方法

短暂性MCAO模型主要依据（Longa, et al; Stroke，1989）所描述的方法进行。大鼠经水合氯醛麻醉（400 mg/Kg，i.p.）后，将大鼠固定于手术台，监测动物的直肠温度，手术过程中控制温度在37±0.5℃范围内；行颈部正中切口，钝性分离组织，暴露右侧颈总动脉（CCA）及颈外动脉（ECA）与颈内动脉（ICA）分叉处，细线在CCA下打活结，分离并用电凝器电凝两个小分支血管，分别是ECA上的分支、ECA与ICA的连接血管，用动脉夹夹闭ICA；将2636（2838）号栓线从ECA的切口插入，稍微结扎ECA上栓线尾部，并松开ICA上的动脉夹，栓线经ECA进入ICA，沿ICA推进至有阻力感即停止；结扎ECA上的栓线尾部，并剪断ECA，松开CCA上的活结，手术结束时，缝合颈部皮肤；缺血2h后，退出栓线即为再灌注，清醒后回笼，自由进食；手术结束后，按动物体重肌肉注射抗生素（0.5mL/200g）；假手术组手术步骤同缺血组，只是将ECA结扎并剪断，不进栓线阻塞大脑中动脉。

神经行为学评分：参照(Chen, et al; 2001 )提供的mNSS方法。0分：正常；1-6分：轻度损伤；7-12分：中度损伤；13-18分：重度损伤。

脑梗死区域测定：采用TTC染色方法，再灌注24h后大鼠断头处死，迅速分离取出大脑，置冰箱（-80℃）内冷冻组织僵化（约2min），取出进行冠状面切片，均匀切成2mm厚的脑片共6片，立即投入1% TTC染色液中，在37℃下避光孵育约15min，染色过程翻动脑片一次，尽量使两面染色均匀。24h后脑组织片拍照，使用图像处理软件计算各脑片梗死面积，总的梗死体积=各面积相加×脑片厚度。因为脑组织水肿，所以计算后还需校正，其校正公式如下：

2.3、实验结果及分析

运用统计学方法对实验数据进行分析，以Mean±SEM表示。图2为翻白草总黄酮对大鼠缺血再灌注损伤引起的神经功能缺损的影响；图3为翻白草总黄酮对大鼠缺血再灌注损伤梗死面积的影响。

如图2所示：图中数值为行为学评分分值，用平均值 (Mean）±标准误(SEM）表示；^##p<0.01相比于正常对照组, **p<0.01 相比于模型组。

由以上统计结果可以发现，再灌注24小时后，假手术组大鼠神经功能基本正常，无明显的缺损表现，行为学评分为0；模型组大鼠行为学评分均较高，功能缺损主要表现为：右前肢伸展困难且内收、向对侧倾斜或旋转、不能直行、平衡木上难以保持平衡姿势；翻白草总黄酮组以内收及对侧向旋转为主，神经功能缺损表现稍弱（模型组和翻白草总黄酮组评分分别为12.1±0.86和7.3±0.73，p＜0.01，n=10）。

如图3所示：图中数值为脑组织梗死体积百分比值，用平均值 (Mean）±标准误(SEM）表示；^##p<0.01相比于正常对照组, **p<0.01 相比于模型组。

由以上统计结果可以发现，再灌注24小时后，假手术组没有梗死灶；模型组梗死体积较大；经过翻白草总黄酮处理后梗死体积百分比较模型组显著减小（p＜0.01）。

以上具体实施方式不以任何形式限制本发明，凡是以等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。