一种载药二氧化硅纳米粒及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种载药二氧化硅纳米粒及其制备方法和用途。

背景技术：

随着近代工业的迅猛发展，重金属在工农业中的广泛应用，人们在享受着生活便捷的同时，人为活动引起的饮食、环境污染也在加剧。其中最为严重的危害之一就是重金属污染，严重危害人类健康。

重金属是指密度大于4.5kg/cm³的金属，例如au、ag、hg、cu、pb、cd等。重金属很多可以通过食物进入人体，破坏人体正常的生理功能从而损害人体健康。重金属与酶的活性部位螯合，使得蛋白构象发生变化，从而使酶失活，破坏细胞正常的生理代谢。此外，重金属也能通过人体的自由基反应产生自由基，对细胞造成氧化损伤，具有极大的毒性。

二巯基丁二酸是临床上常用的重金属解毒药物，但其重金属结合能力较弱，口服给药后药物的吸收率仅为20％，并且易造成肠道失调，血浆蛋白结合率高达95％，游离药物浓度低。此外，二巯基丁二酸不溶于水，无法对污水中的重金属进行净化。

技术实现要素：

本发明提供一种载药二氧化硅纳米粒及其制备方法和用途。

所述载药二氧化硅纳米粒特征在于，含有二巯基丁二酸和巯基化介孔二氧化硅纳米粒，所述二巯基丁二酸任选地与所述巯基化介孔二氧化硅纳米粒偶联。

可选地，上述的载药二氧化硅纳米粒中，所述二巯基丁二酸占所述载药二氧化硅纳米粒重量的3～7％，可选为4～5.9％。

可选地，上述的载药二氧化硅纳米粒中，以二巯基丁二酸的总量计，与巯基化介孔二氧化硅纳米粒偶联的二巯基丁二酸为10％～100％，可选为10％～90％，可选为10％～80％，可选为10％～70％，可选为10％～50％，可选为20％～90％，可选为20％～80％，可选为20％～70％，可选为30％～90％，可选为30％～80％，可选为30％～60％。

可选地，上述的载药二氧化硅纳米粒的粒径为50～100nm，可选为50～70nm。

本发明还提供一种上述的载药二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征在于：包括将巯基化介孔二氧化硅纳米粒与二巯基丁二酸混合的步骤，所述二巯基丁二酸任选地与巯基化介孔二氧化硅纳米粒进行偶联反应；

可选地，所述二巯基丁二酸∶巯基化介孔二氧化硅纳米粒中巯基＝1∶2～1∶1，可选为1∶1.25；

可选地，所述偶联反应包括以下步骤：向巯基化介孔二氧化硅纳米粒中加入2，2-二硫二吡啶进行反应，然后加入二巯基丁二酸进行反应，制得所述载药二氧化硅纳米粒。

可选地，所述方法包括以下步骤：

将巯基化介孔二氧化硅纳米粒分散于醇中，加入2，2-二硫二吡啶进行反应，离心，有机溶剂洗涤，分散于醇中，加入二巯基丁二酸进行反应，离心，有机溶剂洗涤，制得所述载药二氧化硅纳米粒。

可选地，所述2，2-二硫二吡啶∶巯基化介孔二氧化硅纳米粒中巯基＝2∶1～4∶1，可选为3∶1；

可选地，所述方法还包括制备巯基化介孔二氧化硅纳米粒的步骤，包括：

将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚氧乙烯醚(brij58)、正硅酸四乙酯(teos)混合，然后加入3-巯丙基三乙氧基硅烷进行反应，制得巯基化介孔二氧化硅纳米粒；

可选地，所述制备巯基化介孔二氧化硅纳米粒的步骤包括：

向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚氧乙烯醚(brij58)中加入磷酸盐(pb)缓冲液，升温，加入正硅酸四乙酯(teos)，然后加入3-巯丙基三乙氧基硅烷进行反应，水洗，有机溶剂洗涤，然后分散于含酸的醇中进行回流，有机溶剂洗涤，制得巯基化介孔二氧化硅纳米粒。

可选地，所述制备巯基化介孔二氧化硅纳米粒的步骤中，所述十六烷基三甲基溴化铵与聚氧乙烯醚(brij58)的质量比为1∶1～2∶3；

可选地，所述3-巯丙基三乙氧基硅烷与正硅酸四乙酯的摩尔比为1∶10～1∶5，可选为1∶10；

可选地，所述磷酸盐(pb)缓冲液的ph为7.0；

可选地，所述升温为升温至50～80℃，可选为58～62℃；

可选地，所述水洗为用去离子水洗；

可选地，所述有机溶剂选自醇、n，n二甲基甲酰胺中的至少一种；

可选地，所述醇各自独立地选自甲醇、乙醇中的至少一种；可选地，所述醇为甲醇。

可选地，上述载药二氧化硅纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚氧乙烯醚brij58(brij58)中加入ph为7.0的磷酸盐(pb)缓冲液，于50～80℃水浴中加热溶解，滴加正硅酸四乙酯(teos)，搅拌30～60min，滴加3-巯丙基三乙氧基硅烷，反应8～12h，去离子水洗涤2～3次；无水乙醇洗涤2～3次后，分散于含浓盐酸的无水乙醇中，回流8h；将无水乙醇洗涤和在含浓盐酸的无水乙醇中回流的操作重复进行3～5次，然后用无水乙醇洗涤3～6次，制得巯基化介孔二氧化硅纳米粒；

(2)将上述步骤(1)制得的巯基化介孔二氧化硅纳米粒分散于甲醇中，加入2，2-二硫二吡啶，室温避光搅拌18～24h，离心分离，固体物用甲醇洗涤6～8次，分散于甲醇中，加入二巯基丁二酸，室温避光搅拌18～24h，离心，固体物用甲醇洗涤6～8次，制得所述载药二氧化硅纳米粒。

本发明还提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括上述的载药二氧化硅纳米粒和医药上可接受的辅料。

本发明还提供上述的载药二氧化硅纳米粒在重金属解毒剂中的用途。可选地，所述重金属解毒剂为非医用重金属解毒剂。

本发明还提供上述的载药二氧化硅纳米粒在制备重金属解毒药物中的用途。

本发明还提供上述的载药二氧化硅纳米粒在环境净化或重金属解毒中的用途。

本发明还提供上述的药物组合物在制备重金属解毒药物中的用途。

本发明还提供上述的药物组合物在环境净化或重金属解毒中的用途。

根据本发明一方面的实施方式，所述载药二氧化硅纳米粒可以用于环境净化(如污水处理)方面。

根据本发明一方面的实施方式，所述载药二氧化硅纳米粒，粒度分布均匀，单分散性优良。

根据本发明一方面的实施方式，所述载药二氧化硅纳米粒，能够很好地将重金属解毒药物负载进入细胞内，避免药物的血液浓度过高造成的毒副作用，显著提高了重金属解毒药物在细胞中的累积。

根据本发明一方面的实施方式，所述载药二氧化硅纳米粒，对重金属的结合能力高，具有显著高于游离药物的解毒功能。

根据本发明一方面的实施方式，所述载药二氧化硅纳米粒，具有环境响应性智能释放特点。

本发明令人意外地发现，本发明的载药二氧化硅纳米粒，优选通过二硫键的方式将重金属解毒剂二巯基丁二酸部分或全部偶联到巯基化介孔二氧化硅纳米粒表面，当进入体内时，物理吸附的二巯基丁二酸在血液中解吸附，在血液中进行解毒，偶联的二巯基丁二酸随纳米粒进入细胞，通过谷胱甘肽的还原使二硫键断裂，释放出二巯基丁二酸，最大程度地发挥其重金属鳌合能力，且巯基化介孔二氧化硅纳米粒同样能够发挥重金属鳌合和吸附作用，能够显著地提高重金属解毒效果，是一种载体、药物双功能，并具有环境响应性智能释放特点的纳米给药系统。

附图说明

图1：实施例1制备的载药二氧化硅纳米粒的结构示意图，其中a为介孔二氧化硅纳米粒；b为巯基；c为二巯基丁二酸；

图2：(a)为实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的扫描电子显微镜图；

(b)为实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的透射电子显微镜图；

图3：(a)为实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的红外光谱图；

(b)为实施例1制备的载药二氧化硅纳米粒的红外光谱图；

图4：(a)为实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的拉曼光谱图；

(b)实施例1制备的载药二氧化硅纳米粒的拉曼光谱图；

图5：(a)为实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的热失重图谱；

(b)实施例1制备的载药二氧化硅纳米粒的热失重图谱；

图6：实施例2制备的载药二氧化硅纳米粒的拉曼光谱图；

图7：(a)为试验例2中dapi染的细胞核的荧光影像图；

(b)为试验例2中fitc标记的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的荧光影像图；

(c)为(a)和(b)的荧光融合图；

图8：试验例3(1)中msn-sh、msn-s-s-dmsa各浓度实验组的细胞存活率柱形图；

图9：试验例3(1)中铅离子浓度-细胞存活率曲线图；

图10：试验例3(2)中各实验组细胞存活率柱形图。

具体实施例方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于示例性地说明本发明，并不用于限制本发明。

实施例1

(1)称取ctab0.45g、brij580.47g，向其中加入120mlph为7.0的pb缓冲液，于60℃水浴中溶解，待反应体系温度稳定后，缓慢滴加teos2.14ml，继续磁力搅拌45min后，缓慢滴加3-巯丙基三乙氧基硅烷180μl，反应8h，过滤，滤饼用去离子水洗涤2次。然后，用无水乙醇洗涤2次，分散于150ml无水乙醇(含有2ml浓盐酸)中，78℃水浴加热回流8h，将无水乙醇洗涤和含浓盐酸的无水乙醇中回流的操作重复3次，然后用无水乙醇洗涤3次，制得巯基化介孔二氧化硅纳米粒，将所得巯基化介孔二氧化硅纳米粒(msn-sh)分散于乙醇中保存。

所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒的形貌通过jsm-5600lv型扫描电子显微镜(sem)和jsm-100cxii型透射电子显微镜观察，如图2所示，可见制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒为粒径均匀分布的球状纳米粒，并且含有大量的孔道。

(2)将100mg上述步骤(1)制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒超声分散于20ml甲醇中，然后加入300mg2，2-二硫二吡啶，室温下避光搅拌24h，离心分离，收集纳米粒，用甲醇洗涤6次后，分散于20ml甲醇中，向其中加入二巯基丁二酸80mg，室温下避光搅拌24h，离心分离(15000rpm，10min)，收集纳米粒，并用甲醇洗涤6次，制得所述载药二氧化硅纳米粒(msn-s-s-dmsa)。

将实施例1所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒和所述载药二氧化硅纳米粒分别通过激光粒度及zeta电位分析仪、红外光谱、拉曼光谱、热重分析对其进行表征，结果分别见表1，图3，图4，图5。

激光粒度及zeta电位分析：取实施例1所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒和所述载药二氧化硅纳米粒各20mg，分别分散在2ml水中，使用zetasizernanozs900型纳米粒度及zeta电位分析仪测定。

红外光谱：将实施例1所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒和所述载药二氧化硅纳米粒分别研磨成粉末，使用傅里叶变换红外光谱仪(vertex70型)进行测试。

拉曼光谱：将实施例1所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒和所述载药二氧化硅纳米粒分别研磨成粉末，使用激光显微拉曼光谱仪(renishawinvia)进行测试。

热重分析：将实施例1所制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒和所述载药二氧化硅纳米粒分别研磨成粉末，使用热重分析仪(mettler)以10℃/min从30℃升温至1000℃。

表1.巯基化介孔二氧化硅纳米粒和载药二氧化硅纳米粒的粒径和zeta电位

由表1可知，与巯基化介孔二氧化硅纳米粒相比，载药二氧化硅纳米粒的平均粒径增大，zeta电位由-24.4mv变为-41.5mv，结果表明载药二氧化硅纳米粒中含有二巯基丁二酸。

由图3可知，(b)中1729.2cm^-1处出现的吸收峰由二巯基丁二酸中-cooh的伸缩振动造成，表明载药二氧化硅纳米粒中含有二巯基丁二酸。

由图4可知，msn-sh在2564cm^-1有明显的巯基峰，而msn-s-s-dmsa中的巯基峰减弱(b)，且在510cm^-1处有明显的二硫键特征性拉曼光谱峰，表明二巯基丁二酸分子上的巯基通过二硫键的方式偶联到巯基化介孔二氧化硅纳米粒上。

由图5可知，msn-sh和msn-s-s-dmsa之间的失重数值相差4.1％，说明载药二氧化硅纳米粒中含有二巯基丁二酸，载药量约为4.1％。

透析实验：将制备的msn-s-s-dmsa50mg置于透析袋中，使用甲醇进行透析48h。透析结束后，将材料冻干，然后使用热重分析仪进行热重分析，与msn-sh相比，透析后的msn-s-s-dmsa失重数值相差2％，因此，以msn-s-s-dmsa中二巯基丁二酸的总量计，与巯基化介孔二氧化硅纳米粒偶联的二巯基丁二酸为48.8％。

实施例2

将100mg上述实施例1中步骤(1)制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒超声分散于20ml甲醇中，向其中加入二巯基丁二酸80mg，室温下避光搅拌24h，离心分离(15000rpm，10min)，收集纳米粒，并用甲醇洗涤6次，制得所述吸附型的二氧化硅纳米粒(msn-sh吸附dmsa)。

msn-sh吸附dmsa后，采用实施例1中的方法进行拉曼光谱检测，由图6可知，在2560cm^-1有巯基峰存在，表明材料上的巯基及dmsa巯基的存在，而在510cm^-1处并没有出现二硫键的吸收峰，可知二者并没有偶联。

以下试验例1～3中所采用的实施例1中的载药二氧化硅纳米粒为未透析前的载药二氧化硅纳米粒。

试验例1

采用edta滴定法测定巯基化介孔二氧化硅纳米粒及载药二氧化硅纳米粒对pb²⁺的螯合：

分别取10mg实施例1制备的巯基化介孔二氧化硅纳米粒及载药二氧化硅纳米粒，各自采取如下操作：与1ml的50mg/ml的pb(ac)2混合，置于摇床180rpm、37℃孵育20min，离心，并用去离子水洗涤，收集上层清液置于250ml的锥形瓶中，加入10ml的nh3nh4cl和5滴铬黑t指示剂，使用0.01m的edta标准液进行滴定，至溶液由酒红色变为纯蓝色为终点，平行测定3份。

空白试验：取1ml的50mg/ml的pb(ac)2，置于摇床180rpm、37℃孵育20min，离心，并用去离子水洗涤，收集上层清液置于250ml的锥形瓶中，加入10ml的nh3nh4cl和5滴铬黑t指示剂，使用0.01m的edta标准液进行滴定，至溶液由酒红色变为纯蓝色为终点。

式中：

cedta为edta标准溶液的浓度，mol/l；

v滴定前为初始的edta标准溶液的体积，ml；

v滴定后为滴定终点剩余的edta标准溶液的体积，ml；

mpb²⁺为pb²⁺的摩尔质量。

表2巯基化介孔二氧化硅纳米粒和载药二氧化硅纳米粒通过edta滴定法测定二者对铅离子的结合量

二巯基丁二酸不溶于水，无法鳌合水中结合铅离子。由表2可知，巯基化介孔二氧化硅具有良好的铅离子结合能力；本发明的载药二氧化硅纳米粒水分散性好，每毫克载药二氧化硅纳米粒能够结合272.46μgpb²⁺，与巯基化介孔二氧化硅相比，载药二氧化硅纳米粒铅离子结合量进一步提高(增加了20.99％)，二者具有协同效果，重金属结合能力强。可以用于污水处理，利于环境净化。

试验例2

细胞摄取实验：hepg2细胞以每孔1×10⁴个接种于激光共聚焦培养皿(北京索莱宝生物科技有限公司)，利用含有10％fbs的培养基于37℃，5％co2中培养24h，随后，换过新鲜培养基后，加入100μg/ml的fitc(异硫氰酸荧光素，fluoresceinisothiocyanate)标记的巯基化介孔二氧化硅纳米粒。孵育4h后，弃掉培养基，使用pbs洗涤2次，用预冷的甲醇4℃固定细胞，向培养皿中滴加1ml的dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，4′，6-diamidino-2-phenylindole)反应液，37℃、避光条件下孵育40min，再次使用pbs洗涤2次，加入1ml的pbs，使用荧光显微镜观察摄取情况。

从图7可以看出，在图7c中，fitc标记的msn-sh均匀分布于细胞核周围，表明msn-sh能够被细胞摄取，进而可以确定本发明的msn-s-s-dmsa能够被细胞摄取，进入到细胞内，发挥其重金属解毒功能。

试验例3

载药二氧化硅纳米粒作为重金属解毒材料的细胞毒性试验

mtt测试方法：hepg2细胞以5×10³的密度接种于96孔板，利用含有10％fbs的dmem培养基于37℃，5％co2中培养24h，分别加入实验样品作为实验组，对照组不加入实验样品，置于37℃，5％的co2中培养，结束以后弃去上清液，加入mtt10μl/孔，继续培养4h后，加入dmso100μl/孔，避光孵育4h，酶标仪测定od值，波长为570nm按下列公式计算存活率，评价毒性以及重金属的吸附效果。

存活率％＝加药孔平均od值/对照孔平均od值×100％

(1)msn-sh、msn-s-s-dmsa及铅离子的毒性试验

使用细胞培养基将msn-sh、msn-s-s-dmsa及铅离子配制成不同浓度的实验样品，采用上述mtt测试方法进行毒性试验，实验结果如图8所示，可以看出msn-sh的毒性比msn-s-s-dmsa稍大一些，但是在给药浓度范围内(10-100μg/ml)，两者均可以认为是无毒性的。

从图9中可以看出，铅离子浓度越高，对细胞的杀伤程度越强，当铅离子浓度为1000μg/ml时，细胞的存活率仅为37％。

(2)msn-sh、msn-s-s-dmsa对铅离子的捕获试验

使用细胞培养基将msn-sh、msn-s-s-dmsa各自配制成浓度为100μg/ml的混悬液，分别与不同浓度的铅离子混合，使用200μl的移液枪吹打5min。将制得的含铅离子的msn-sh溶液、含铅离子的msn-s-s-dmsa溶液以及单一铅离子溶液作为实验样品，采用上述mtt测试方法进行毒性试验，实验结果如图10所示。可以看出，在铅离子浓度100～1000μg/ml的范围内，msn-s-s-dmsa组细胞存活率均保持在较高的水平，说明本发明的msn-s-s-dmsa对铅离子有明显的吸附和螯合作用，使dmsa与巯基化介孔二氧化硅产生协同效果，从而避免了铅离子对细胞的杀伤，而msn-sh组的细胞存活率较低，说明未结合药物的msn-sh与铅结合能力相对较弱。结果表明本发明的载药二氧化硅纳米粒在重金属解毒方面具有很大的优势。