一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料及其制备方法与流程

本发明涉及一种敷料，具体涉及一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料及其制备方法。

背景技术：

在现有的技术和材料中，有关医用敷料通常由无纺布、吸水纸、絮棉、防漏膜组成，这种纸型医用敷料吸液量大，吸液后不变型，不产生折断破散现象。但是这种医用敷料若用于婴儿、烫伤、烧伤病人时，敷料很容易和创口粘连，不易剥离，并且不被人体组织吸收。因此，本申请人将研究构建模拟机体组织和功能的基质和支架系统作为科研的重点，并以重建或恢复皮肤屏障是受伤创面治疗的最终目标。生物敷料是当前被重视的创面覆盖物，理想的创面敷料首先应该有效阻止细菌感染，加速创面愈合，同时应具有良好的生物相容性、能够控制和吸收创面渗液、适合气体和水蒸气透过、保护新生组织、加速创面愈合等特性。

角蛋白生物材料具有利于细胞渗入、粘附和增殖的三维支架结构，在细胞粘附和增殖方面具有明显优于其他材料的特性，同时具有神经诱导性，在止血方面也显示出很好的效果。虽然，本申请人多年研究发现角蛋白本身具有很多的优势，但其单独作用在修复效果方面仍然具有很大的改进空间。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷提供了一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，所述敷料的原料成分以及各种成分的质量百分比为：角蛋白：2％～8％；羧甲基纤维素钠：0.6％～1％；壳聚糖：0.3％～0.9％；甘油：6％～8％；余量为水。

进一步地，所述敷料的原料成分以及各种成分的质量百分比为：角蛋白：4％～6％；羧甲基纤维素钠：0.8％～0.9％；壳聚糖：0.6％～0.7％；甘油：7％；余量为水。

进一步地，所述角蛋白为毛发角蛋白，所述毛发角蛋白为由人头发、指甲或动物毛发制备的角蛋白。

进一步地，所述毛发角蛋白为颗粒状的毛发角蛋白和凝胶化的毛发角蛋白中的任意一种。所述凝胶化的毛发角蛋白的浓度为0.5～5％，优选2～3％。

进一步地，所述敷料还包括CaCl₂溶液、NaOH溶液和甘油水溶液。

一种所述的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料的制备方法，所述制备方法如下：

S1：制备角蛋白；

S2：按比例称取各种成分，然后将角蛋白和羧甲基纤维素钠加入水中得初溶液；

S3：将壳聚糖和甘油加入至步骤S2所述的初溶液中，混合均匀后进行第一次冷冻干燥，该第一次冷冻干燥优选在-15～-25℃下冷冻干燥2～5小时；

S4：经过步骤S3的第一次冷冻干燥后依次放入CaCl₂溶液中浸泡2～5小时和NaOH溶液中浸泡2～5小时，浸泡完毕再进行第二次冷冻干燥，该第二次冷冻干燥优选在-25～-35℃下冷冻干燥4～8小时；

S5：经过步骤S4的第二次冷冻干燥后再在甘油水溶液中浸泡2～8h，浸泡完毕再进行第三次冷冻干燥，该第三次冷冻干燥优选在-45～-55℃下冷冻干燥10～20小时，即得到角蛋白、壳聚糖复合医用敷料。

进一步地，步骤S1中所述的角蛋白为毛发角蛋白，所述毛发角蛋白为颗粒状的毛发角蛋白和凝胶化的毛发角蛋白中的任意一种。

进一步地，所述凝胶化的毛发角蛋白的浓度为0.5～5％，优选2～3％。

进一步地，步骤S4中，所述CaCl₂溶液的浓度为0.5～1％(质量体积比)，所述NaOH溶液的浓度为1-2％(质量体积比)；步骤S5中，所述的甘油水溶液为含有20％～40％体积百分比的甘油水溶液。

进一步地，步骤S3中所述的第一次冷冻干燥，冷冻干燥至含水量为15～25％为止，优选20％为止。

步骤S4中所述的第二次冷冻干燥，冷冻干燥至含水量低于15％为止，优选为6～14％为止，更优选10％为止。

步骤S5中所述的第三次冷冻干燥，冷冻干燥至含水量小于5％为止。

进一步地，所述颗粒状的毛发角蛋白的制备方法为：①：脱脂与软化：称取毛发进行脱脂和软化；②：脱色；③：清洗、烘干：将脱色后的毛发进行清洗，并且干燥；④：颗粒的制备：将干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到毛发粗粉；将粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，旋转，球磨，直至粒径达到50μm～90μm为止，则为毛发角蛋白颗粒匀浆；⑤：纯化：在匀浆中加入生理盐水进行离心，弃去上清液，并去除沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，加生理盐水混匀继续离心，重复上述操作2～4次，最后仍然取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，则得到高纯度的颗粒状的毛发角蛋白，灭菌后备用。

进一步地，步骤②中的脱色过程为：将软化后的毛发放置于脱色溶液中进行脱色，所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠3～5重量份、过硫酸钾1～2重量份、双氧水70～90体积份、浓氨水22～33体积份以及水350～450体积份。

进一步地，所述凝胶化的毛发角蛋白的制备方法为：取步骤⑤中所制备的颗粒状的毛发角蛋白，加水，充分混匀，放置于温箱中孵育，至呈现较为均一的颜色和性状为止，得到凝胶化的毛发角蛋白，灭菌后备用。

进一步地，所制备的颗粒状的毛发角蛋白和凝胶化的毛发角蛋白均要进行灭菌处理；所述灭菌处理为采用钴⁶⁰辐照进行灭菌。

进一步地，步骤④的具体过程为：将干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到长度为0.1～2mm的毛发粗粉；将毛发粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，毛发粗粉与生理盐水的质量体积比为2:5，球磨1～3小时，在显微镜下观察粒径大小，直至形成粒径约60μm-80μm；所述玛瑙珠的数量为：每1g的毛发粗粉对应直径1cm玛瑙珠10颗和直径6mm玛瑙珠50颗。

进一步地，所述凝胶化的毛发角蛋白还能够通过以下方法制备：

(1)毛发角蛋白成盐：称取毛发，加入乙醇和水的混合溶液，加热，回流，边回流边滴加碱溶液，至pH值为6.5～7.5时结束，然后继续搅拌，使反应完全，过滤得到毛发角蛋白盐，干燥，粉碎至微米级，冻干，即得到毛发角蛋白磺酸盐粉末；

(2)毛发角蛋白凝胶的制备：称取毛发角蛋白磺酸盐粉末，加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育，灭菌，得到毛发角蛋白凝胶。

本发明提供了一种修复创面的敷料，其主要具有的有益效果为：

本发明中角蛋白和壳聚糖以及其他成分之间是相互关联、协同作用的，比单独作用具有更加优异的技术效果：具体表现在以下几个方面：(1)其共同作用使得敷料无任何免疫原性，并且没有发现任何毒副作用，即使过敏体质也不会发生过敏现象；(2)具有良好的生物相容性，可随着创伤慢慢愈合和自身皮肤生长，毛发角蛋白能自行溶解被机体吸收，避免普通辅料黏着创面的再次损伤，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境；(3)止血效果非常好，并能有效加速创面愈合，且能起到皮肤屏障功能的部分作用，其有效阻止细菌感染；(4)具有吸湿性，控制和吸收创面渗液，保持创面干燥，促进细胞生长，促进创面愈合的作用，避免普通辅料黏着创面的再次损伤，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境；(5)透气性强，适合气体和水蒸气透过，(6)保护新生组织等优势。

通过本发明的方法(包括原料制备、加料顺序、浸泡以及干燥方法次数等等)所述制备的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料呈多孔支架，且多孔支架呈现片层多孔结构，具有较高的孔隙率，能给细胞生长和迁移提供适宜的空间结构。而且该多孔支架对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，多孔支架能够促进红细胞聚集形成聚集体，堵住血管破损处而达到止血的目的；同时，多孔支架具有良好的细胞相容性。因此，胶原/壳聚糖基双层伤口敷料在伤口治疗方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例所述的在光镜下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图2是本发明实施例所述的在扫描电镜(1.69×10³)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图3是本发明实施例所述的在扫描电镜(1.25×10³)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图4是本发明实施例所述的在透射电镜(1×10⁵)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图5是本发明实施例所述的在透射电镜(2×10⁵)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图6是本发明实施例所述的4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状；

图7是本发明实施例所述的为损伤后修复的创面组织局部切片和免疫组织化学染色；

图8是本发明实施例所述的将角蛋白、壳聚糖复合医用敷料贴合于大鼠创面的示意图；

图9是本发明实施例所述的21天后大鼠创面愈合情况的示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，该敷料的成分以及各种成分的质量按以下质量百分比添加：角蛋白：2％；羧甲基纤维素钠：1％；壳聚糖：0.3％；甘油：8％；余量为水。其中，角蛋白为由人头发制备的颗粒状的角蛋白，颗粒状的角蛋白即为粉末状的角蛋白。

实施例2

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，该敷料的成分以及各种成分的质量按以下质量百分比添加：角蛋白：8％；羧甲基纤维素钠：0.6％；壳聚糖：0.9％；甘油：6％；余量为水。其中，角蛋白为由羊毛制备的颗粒状的角蛋白，颗粒状的角蛋白即为粉末状的角蛋白。

实施例3

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，该敷料的成分以及各种成分的质量按以下质量百分比添加：角蛋白：4％；羧甲基纤维素钠：0.9％；壳聚糖：0.6％；甘油：6.5％；余量为水。

其中，角蛋白为由羊毛制备的浓度为3％的凝胶化的角蛋白，该凝胶化的角蛋白的制备方法为：取由羊毛制备的颗粒状的角蛋白200mg中加入5ml的水中，充分混匀，放置于温箱中在37℃下孵育，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为4％，图6为浓度是4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状。

实施例4

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，该敷料的成分以及各种成分的质量按以下质量百分比添加：角蛋白：6％；羧甲基纤维素钠：0.8％；壳聚糖：0.7％；甘油：7.5％；余量为水。

其中，角蛋白为由人头发制备的浓度为2.5％的凝胶化的角蛋白，该凝胶化的角蛋白的制备方法为：取由人头发制备的颗粒状的角蛋白125mg加入5ml的水中，充分混匀，放置于温箱中在37℃下孵育，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为2.5％，该浓度的凝胶化毛发角蛋白比图6所示的浓度是4％的凝胶化的毛发角蛋白稀一些。

实施例5

一种角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，该敷料的成分以及各种成分的质量按以下质量百分比添加：角蛋白：5％；羧甲基纤维素钠：0.8％；壳聚糖：0.6％；甘油：7％；水86.6％。

其中，角蛋白为由人头发制备的浓度为2％的凝胶化的角蛋白，该凝胶化的角蛋白的制备方法为：取由人头发制备的颗粒状的角蛋白100mg加入5ml的水中，充分混匀，放置于温箱中在37℃下孵育，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为2％，该浓度的凝胶化毛发角蛋白比图6所示的浓度是4％的凝胶化的毛发角蛋白稀一些。

对于实施例1～实施例5中任一个实施例所述的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料，其成分还包括CaCl₂和NaOH。

实施例6

一种所述的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料的制备方法，具体步骤如下：

S1：制备角蛋白；

S2：然后将5kg的角蛋白和0.8kg的羧甲基纤维素钠加入86.4kg的水中，记为初溶液；

S3：将0.8kg的壳聚糖和7kg的甘油加入至步骤S2的初溶液中，混合均匀后，倒入培养皿中，在-20℃下进行第一次冷冻干燥，冷冻干燥2h左右，即冷冻干燥至含水量为20％左右为止；

S4：将经过步骤S3中第一次冷冻干燥后的物料放入浓度为0.5％的CaCl₂溶液中浸泡2h，从CaCl₂溶液中拿出物料以后再放入浓度为1％的NaOH溶液中浸泡3h，浸泡完毕，在-30℃下进行第二次冷冻干燥，冷冻干燥5h左右，即冷冻干燥至含水量为10％左右为止；

S5：经过步骤S4的第二次冷冻干燥后再将物料放入浓度为20％的甘油水溶液中浸泡2h，浸泡完毕，在-50℃下进行第三次冷冻干燥，冷冻干燥12h左右，即冷冻干燥至含水量为3％为止，即得到角蛋白、壳聚糖复合医用敷料。

步骤S1中，角蛋白为颗粒状的角蛋白，颗粒状的角蛋白的具体制备步骤如下：

①：脱脂：称取5g人头发，放在1000ml烧杯中。加入99.7％无水乙醇浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，流水冲洗；

②：软化：将清洗后的头发放置于≥10％(质量体积比)次氯酸钠10ml和蒸馏水90ml配置的溶液中，常温浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，流水冲洗；

③：脱色：按5g头发的重量，称取99％焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)(质量体积比)4g，99.5％过硫酸钾(K₂S₂O₈)(质量体积比)1.5g，30％双氧水(H₂O₂)80ml(体积百分比v/v)，25％浓氨水27.5ml(体积百分比v/v)，蒸馏水400ml，配制成脱色溶液，将软化的头发置于此溶液中，放置于37℃的恒温水槽中，每隔20分钟用玻璃棒搅拌1次，观察头发颜色至浅黄色，这一过程用时一般2-3个小时，比传统方法短很多；将脱色后的头发放置在筛网上，流水冲洗，直至洗掉脱色溶液。

④：清洗、烘干：取去离子水浸泡上述脱色后的头发12小时以上，去除残留试剂；去离子水冲洗，过滤后放置在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜；

⑤：研磨：将烘干后的头发用剪刀剪碎后放在陶瓷研钵中，加入液氮冷冻研磨，至头发成1mm长，得到头发粗粉；

⑥：球磨：称取头发粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml，460转/min，球磨2小时，倒置电子显微镜下观察粒径的大小，再加入生理盐水5ml继续研磨1.5个小时，直至形成粒径约70μm的人头发角蛋白颗粒匀浆；上述的玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径6mm玛瑙珠100颗；

⑦：装管：在上述匀浆中加入生理盐水30ml，将球磨罐中的液体清洗转移至50ml离心管中；

⑧：纯化：将离心管放在离心机的离心杯中，离心速度3000转/min，离心20min，弃去上清液，用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，加生理盐水40ml混匀，继续离心一次，弃去上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层(钥匙也可以替换成一些类似玻璃棒或玻璃片等均可，只要把上下两部分刮去便可，实操中很容易完成)，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，再加生理盐水40ml混匀，再次离心，弃上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，得到高纯度的颗粒状的毛发角蛋白，由于粒径小，因此看上去为角蛋白泥；暂时放置在4℃保存备用；

⑨：灭菌：将得到的高纯度的颗粒状的毛发角蛋白装于塑料袋中，密封好，用纸箱包装后送到辐射中心进行Co⁶⁰照射灭菌，剂量12Kg，放置在4℃冰箱，待用；

将制备好的高纯度的颗粒状的毛发角蛋白在光镜观察(×20)下观察，其保持了毛发原有稳定的束状结构，如图1所示。

图2～5为该颗粒状的毛发角蛋白电镜图，图2为人发横断面SEM(1.69×10³)，图3为人发表面SEM(1.25×10³)，图4为人发TEM(1×10⁵)，图5为人发皮质TEM(2×10⁵)。

由扫描电镜(SEM)可见，经本发明方法处理的毛发材料表面比较光滑，无正常黑发的鳞片结构，呈浅凹凸斑片状；横断面毛皮质仍呈无结构均质状。由透射电镜(TEM)可见毛发角蛋白颗粒材料中黑色素都已崩解。

需要说明的是，本实施例所使用的人头发可换成羊毛，相关的参数、步骤等均同采用人头发制备角蛋白一致。

实施例7

一种所述的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料的制备方法，具体步骤如下：

S1：制备角蛋白；

S2：然后将3kg的角蛋白和0.7kg的羧甲基纤维素钠加入88.9kg的水中，记为初溶液；

S3：将0.9kg的壳聚糖和6.5kg的甘油加入至步骤S2的初溶液中，混合均匀后，倒入培养皿中，在-23℃下进行第一次冷冻干燥，冷冻干燥3h左右，即冷冻干燥至含水量为20％为止；

S4：将经过步骤S3中第一次冷冻干燥后的物料放入浓度为0.85％的CaCl₂溶液中浸泡3h，从CaCl₂溶液中拿出物料以后再放入浓度为1.75％的NaOH溶液中浸泡2h，浸泡完毕再在-35℃下进行第二次冷冻干燥，冷冻干燥4h左右，即冷冻干燥至含水量为12％为止；

S5：经过步骤S4的第二次冷冻干燥后再将物料放入浓度为30％的甘油水溶液中浸泡4h，浸泡完毕再在-50℃下进行第三次冷冻干燥，冷冻干燥10h，冷冻干燥至含水量为5％为止，即得到角蛋白、壳聚糖复合医用敷料。

步骤S1中，角蛋白为凝胶化的角蛋白，凝胶化的角蛋白的具体制备步骤如下：

(1)制备颗粒状的角蛋白，制备方法同实施例6中步骤①～⑨中颗粒状的角蛋白的制备方法，这里就不再重复说明；

(2)取步骤(1)中所得到的高纯度的颗粒状的角蛋白200mg中加入5ml的水中，充分混匀，放置于温箱中在37℃下孵育，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为4％，图6为浓度是4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状。

需要说明的是，本实施例所使用的人头发可换成羊毛，相关的参数、步骤等均同采用人头发制备角蛋白一致。

实施例8

一种所述的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料的制备方法，具体步骤如下：

S1：制备角蛋白；

S2：然后将7kg的角蛋白和0.9kg的羧甲基纤维素钠加入84.1kg的水中，记为初溶液；

S3：将0.5kg的壳聚糖和7.5kg的甘油加入至步骤S2的初溶液中，混合均匀后，倒入培养皿中，在-15℃下进行第一次冷冻干燥，冷冻干燥3h左右，即冷冻干燥至含水量为18％为止；

S4：将经过步骤S3中第一次冷冻干燥后的物料放入浓度为0.75％的CaCl₂溶液中浸泡3h，从CaCl₂溶液中拿出物料以后再放入浓度为1.5％的NaOH溶液中浸泡2h，浸泡完毕再在-35℃下进行第二次冷冻干燥，冷冻干燥4h左右，即冷冻干燥至含水量为12％为止；

S5：经过步骤S4的第二次冷冻干燥后再将物料放入浓度为25％的甘油水溶液中浸泡4h，浸泡完毕再在-55℃下进行第三次冷冻干燥，冷冻干燥15h左右，即冷冻干燥至含水量为2％为止，即得到角蛋白、壳聚糖复合医用敷料。

步骤S1中，角蛋白为凝胶化的角蛋白，凝胶化的角蛋白的具体制备步骤如下：

S1：称取10g羊毛，放入装有180ml无水乙醇和20ml蒸馏水的混合溶液的三口烧瓶中，加热15分钟后升温至75℃，溶液开始回流；然后，边回流边滴加2ml的NaOH溶液，至氧化角蛋白的pH值为7，回流与滴加同时结束，时间持续90分钟；滴加和回流结束后，在25℃继续搅拌5小时，使反应完全，得到成盐毛发角蛋白。

S2：将成盐毛发角蛋白滤出，并用洗液冲洗，该洗液为无水乙醇与等量蒸馏水混合，除去未反应的NaOH，用pH试纸检测是否呈碱性，洗涤至不呈碱性，放入60℃鼓风干燥箱中干燥6小时，得到干燥的毛发角蛋白磺酸盐；

S3：经过上述处理而得到的毛发角蛋白磺酸盐呈脆性，在流星式球磨罐中，放入玛瑙珠，460转/min的条件下研磨，直至粉碎为50μm左右的毛发角蛋白磺酸盐粉末为止，冻干；玛瑙珠的数量可为：直径1cm玛瑙珠80颗，直径6mm玛瑙珠300颗；

S4：凝胶化的毛发角蛋白：在超净台里操作，取100mg步骤S3中得到的冻干后的毛发角蛋白磺酸盐粉中加入5ml无菌水，先采用搅拌器手工混匀材料，再用斡旋混匀机充分混匀，放置于37℃温箱孵育约3小时，则得到颜色和性状较为均一的毛发角蛋白凝胶，然后，采用钴60辐照法灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为2％，该凝胶化的毛发角蛋白比图6所示的凝胶化的毛发角蛋白稀一些。

需要说明的是，本实施例所使用的羊毛可换成人头发，相关的参数、步骤等均同采用人头发制备角蛋白一致。

实施例9

生物相容性和毒性：

实验组：①100％浓度的本发明所制备的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料PBS/生理盐水浸提液；②将100％浓度的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料PBS/生理盐水浸提液和DMEM培养基1:1体积混合稀释为50％浓度；③将100％浓度的角蛋白、壳聚糖复合医用敷料PBS/生理盐水浸提液和DMEM培养基1:3体积混合稀释为25％浓度；

对照组：PBS/生理盐水。

方法：收集对数期L-929细胞，以5×10⁴个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl，分为4组(3个浓度组+对照组)，每组重复8孔。置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时，弃去原液，每孔换入100μl新培养液，实验组每组各孔再分别加入100μl上述的100％、50％、25％的相应受试液，对照组加同量的生理盐水。置37℃，5％CO₂培养箱培养，于培养的第3天，第5天和第7天分别取出一块96孔板，弃去每孔上清110μl，加入10μl MTT(0.5％MTT,3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，即噻唑蓝)，置箱中培养4小时，取板，小心吸去孔内上清，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)150μl，再放入37℃，5％CO₂培养箱中孵育15分钟，尽快测定光度值(OD值)，测定波长为490nm，参考波长为540nm。

按公式(RGR＝材料各浓度组吸光度/阴性对照组吸光度×100％)计算细胞相对增殖度(RGR)，并依据细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系转换成细胞毒性分级。结果表明，不同浓度的本申请的医用敷料在三个时间点测得的细胞相对增殖率均达80％以上，细胞毒性分级为一级，说明具有良好的细胞相容性，无细胞毒性。如表1所示。

表1：MTT结果统计分析

实施例10

取健康SD大鼠，戊巴比妥麻醉(30mg/kg)，在其背部脊柱一侧旁开1cm，利刀全层切除皮肤，形成一个直径1.8cm、面积2.54cm²的圆形全层皮肤切除创面，对侧对称部位皮肤作为正常自身对照。将本发明制备的敷料贴合于创面，使敷料的角蛋白层与创面紧密贴合，如图8所示。

观察：大鼠创面覆盖敷料之后10分钟左右，出血逐渐停止，实验组动物伤后3d创面有所缩小，可见新生肉芽组织生成。伤后21d时，90％以上的创面愈合，如图9所示。

需要说明的是，HE染色组织切片观察：测真皮层增厚，4周时平均厚度约0.58mm，可见大量的角蛋白颗粒真皮下聚集，角蛋白之间有细胞及纤维组织生长，有少量多核巨细胞，内吞噬有角蛋白颗粒。

免疫组织化学染色观察：切片中鼠真皮成纤维细胞大量分泌Ⅰ型胶原蛋白，胶原纤维排列紧密，染色呈褐色，Ⅰ型胶原蛋白与组织细胞交错分布；第8周后填充部位皮肤免疫组织化学染色观察图如图7所示，图7是鼠真皮成纤维细胞的染色显示Ⅰ型胶原蛋白分泌情况，由此可知，显示皮肤组织愈合良好，即鼠皮肤创面恢复状况良好。

细菌感染观察：在受伤至痊愈后未见明显细菌感染情况。

结论：本发明的复合医用敷料效果非常显著，在没有任何用药的情况下，未出现明显发炎，且伤后21d，绝大部分创面愈合，12周时角蛋白凝胶可基本降解。

具体地，本发明中的复合医用敷料具有利于细胞渗入、粘附和增殖的多孔支架结构，在细胞粘附和增殖方面具有明显优于其他材料的特性，同时具有神经诱导性，在止血方面也显示出很好的效果；也说明了本发明通过将毛发角蛋白与壳聚糖等协同应用的效果极其显著。

注：上述研究均在伦理委员会和受试者知情同意的情况下进行。

具体实施时，本发明中，对于实施例1～5中的任一实施例，如果要加CaCl₂和NaOH，则对于CaCl₂和NaOH的量没有特别要求，CaCl₂和NaOH的量只要加入至和其他成分不再反应为止。

本发明所使用的百分含量均为市场常规的百分含量。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。