组合物及其应用的制作方法

本发明涉及细胞领域，特别涉及组合物及其应用。
背景技术：
：肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机能障碍和黄疽、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。近些年来，由于肝衰竭死亡的人数逐渐增多，据统计，美国每年约有万人死于肝功能衰竭，而我国每年死于此症的患者约万。急性肝衰竭是一种急性的严重肝功能障碍，其特点是起病急、病情危重、症状表现多样、肝细胞广泛坏死。目前治疗肝衰竭的主要手段为内科治疗、肝移植和细胞治疗等。内科治疗疗效有限，迄今为止尚未有对症的特效药。目前，肝移植虽已成为治疗终末期肝病的重要手段，但供体短缺、手术损伤、免疫排斥以及费用高昂等问题构成了肝移植技术发展的主要障碍。因此，开展具有侵入性小，并发症少等特点的干细胞移植成为最近治疗肝衰的研究热点。干细胞是一种未分化的细胞，有两个基本特征，一是自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞即可以分类为功能一致的全能细胞。第二类是多潜能干细胞，它能分化成为身体中每种细胞类型，但是不能形成胎盘和胎儿发育所必须的支持组织。第三类是成体干细胞是一种将拥有终生自我复制或自我更新能力的干细胞。它分布于不同组织并可养成为各种类型细胞。间充质干细胞，属于成体干细胞，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腿、神经、肝、心肌、胰岛细胞和内皮等多种组织细胞。间充质干细胞由于免疫原性低，成体组织来源丰富广泛存在于人体的骨髓、脂肪组织、新生儿脐带及胎盘等，易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染扩增时培养体系能统一，便于质控可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。目前不少研究证明干细胞在体外进过特殊培养均有分化成为肝细胞的能力。近年来骨髓来源的间充质干细胞，治疗因其有重现性好、低免疫原性、费用低、运作方便、容易等优势，成为继原位肝移植后又一治疗肝衰竭的有效方法。制备过程相对简单、易于收集、生物特性稳定、安全性能稳定、重复性好，病人可以在心理上接受，因此能满足临床应用的需求。增殖能力强，其具有贴壁性有利于细胞的纯化和培养，同时具有较强的分化能力、免疫原性低、避免了胚胎干细胞移植后可能产生畸胎瘤和伦理问题；它可以在异基因移植中长期存活并发挥正常的生理功能，而且自体移植不存在免疫排斥问题，因此新的治疗方法一在治疗有着极大的优势。目前不少研究证明干细胞在体外进过特殊培养均有分化成为肝细胞的能力。证明造血干细胞可以体外培养可以分化成为肝细胞。研究证明骨髓来源的间充质干细胞体外分化培养可以分化成肝细胞。目前大鼠、大鼠和人的有关实验模型，提示骨髓来源细胞可以转化为肝细胞。目前关于不同来源干细胞治疗急性肝衰的报道也有很多。证明单个核骨髓细胞能治疗对乙酞基氨基酚引起的急性肝衰。有人得出结论，肝脏中某些部分损伤可能更适合用骨髓来源的干细胞进行修复。Hwang,S.等人分别使用骨髓间充质干细胞和经HGF体外诱导1周或2周的骨髓间充质干细胞治疗肝衰竭大鼠，通过对肝功能血生化指标的检测，他们认为干细胞向肝干细胞和肝脏细胞分化的早期可能有利于肝细胞的再生和肝功能的重建，而成熟肝细胞移植可能会限制肝功能的恢复。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种组合物及其应用。该组合物对于防止和或治疗由局部缺血、药物如对乙酰氨基酚、病毒、肥胖症非酒精性脂肪性肝炎、以及阻塞胆管阻塞、肿瘤所引起的慢性肝损伤均有效。该组合物还可以预防肝衰竭、减缓慢性肝衰竭进展并去除有害的毒性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种组合物，包括生长因子、白蛋白和骨髓间充质干细胞。在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子选自肝细胞生长因子、前列腺素、胰岛素或胰高血糖素。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中肝细胞生长因子占组合物的含量为30μg/ml～60μg/ml、前列腺素占组合物的含量为4μg/ml～8μg/ml、胰岛素占组合物的含量为20U/ml～40U/ml、胰高血糖素占组合物的含量为3mg/ml～6mg/ml。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述白蛋白占组合物的质量百分含量为15～30％。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述白蛋白占组合物的质量百分含量为20％。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述骨髓间充质干细胞的浓度为1.0～10.0×107/ml。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述骨髓间充质干细胞的浓度为1.5×107/ml。肝再生启动机制复杂，涉及多种细胞、细胞因子及生长因子。其中肝细胞生长因子是促肝再生因子中最重要的生长因子之一，主要由肝脏Kupffer细胞等间质细胞产生，在细胞损伤时具有保护肝细胞、抑制肝细胞的凋亡的作用，也是肝再生启动所必需的信号。研究表明，肝细胞生长因子不但能促进成熟肝细胞增殖，还可以加快肝卵圆细胞的增殖、分化，从成熟肝细胞及肝前体细胞两个方面有效促进肝脏再生。肝细胞大量坏死时,对胰岛素灭活功能减弱,同时肝细胞源性血清胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)表达减少,使肝衰竭患者出现低血糖及糖的氧化利用率下降,转以蛋白质、脂肪分解供能为主。肝衰竭患者在应激状态下利用糖的能力很差,未被及时氧化可能引起或加重肝脏的脂肪变性。胰岛素和胰高血糖素联用不但可以提高机体对血糖的利用率并且具有刺激肝细胞增殖的功能。前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)是花生四烯酸在磷脂酶A2、环氧酶，和PGE2合酶的顺序催化作用下产生的代谢产物，可由多种细胞合成，对多种原因造成的包括胃肠道粘膜、肝脏在内的多种组织器官损伤具有保护作用，在肝脏遭受肝毒性物质时，可以减少肝细胞调亡和破坏。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述生长因子选自重组人肝细胞生长因子、胰岛素、胰高血糖素或前列腺素E2。在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中所述组合物的使用剂量以骨髓间充质干细胞计为1.0～10.0×107/kg动物体重。本发明还提供了所述组合物在制备预防和/或治疗肝脏疾病的药物和/或保健品。所述肝脏疾病选自由局部缺血、药物如对乙酰氨基酚、病毒、肥胖症非酒精性脂肪性肝炎，阻塞胆管阻塞、肿瘤所引起的慢性肝损伤，肝衰竭，或慢性肝衰竭。此外，本发明还提供了一种预防和/或治疗肝脏疾病的药物和/或保健品，其特征在于，包括本发明提供的所述组合物。本发明提供了一种组合物，包括生长因子、白蛋白和骨髓间充质干细胞。该组合物对于防止和或治疗由局部缺血、药物如对乙酰氨基酚、病毒、肥胖症非酒精性脂肪性肝炎、以及阻塞胆管阻塞、肿瘤所引起的慢性肝损伤均有效。该组合物还可以预防肝衰竭、减缓慢性肝衰竭进展并去除有害的毒性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示对照组流式细胞仪检测结果；图2示样本组流式细胞仪检测结果；图3示病理切片显示结果；其中，图3(A)示正常组；图3(B)示对照组；图4示生存期结果。具体实施方式本发明公开了一种组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的组合物及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1骨髓间充质干细胞分离纯化分离：给予大鼠腹腔注射肝素后短颈处死。75％乙醇溶液中浸泡消毒10min。超净台内无菌条件下取大鼠双侧腔骨，用PBS冲洗2次。大鼠股骨的端部被切断，用注射器抽吸培养基反复冲洗骨髓腔，将骨髓腔冲洗干净。将细胞悬浮液通过70μm的细胞过滤网来去除骨碎片和聚集的血液。用离心管收集细胞悬液，用培养基反复洗涤2次，离心。以含10％FBS的DMEM-F12培养基重悬细胞，并调整细胞密度为2×105/ml接种到15cm培养皿，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养。细胞培养24h时半量换液，去除未贴壁细胞，72h后二次全量换液，此后3d换液一次，直到细胞生长至融合度达85％，胰酶消化传代或冻存。此为原代骨髓间充质干细胞。传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用PBS洗涤二次，加入37℃预热的0.25％(2.5g/L)胰蛋白酶(含1mmol/LEDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制)消化2分钟，加入完全培养液终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞再悬浮于培养液中，按2～5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓MSC。骨髓间充质干细胞扩增培养用L-DMEM完全培养液将细胞浓度调整为1×106/mL培养骨髓间充质干细胞细胞。5％CO2培养箱内，每3～4天半量换液1次，每隔2-3天补充所需的细胞因子；10～12d细胞达90％融合时传代，用流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞和台盼蓝计数测试细胞活力。骨髓间充质干细胞的鉴定：取第3代细胞，细胞培养至接近融合时，0.25％胰蛋白酶消化2min，用含有5％FBS的冷PBS冲洗2次，加入1ml0.01mol/L的PBS重悬，反复轻轻吹打细胞，使其成单细胞悬液，加入CD29、CD90、CD11b、CD45单克隆抗体，同时用同型对照，避光孵育1h，PBS洗3次后，上流式检测。加入1ml0.5％多聚甲醛-PBS溶液固定、重悬细胞，上流式细胞仪检测。分离纯化后的大鼠外周血NK细胞经台盼蓝染色，表明其活性可以达到92％～95％，经流式细胞仪检测，CD73、CD90、CD105＞95％，CD19、CD34、CD11b、CD45＜2％，证实分离纯化扩增的骨髓间充质干细胞细胞的纯度可高达95％以上。实施例2构建大鼠慢性肝衰竭模型用腹腔注射四氯化碳诱发大鼠慢性肝衰竭模型，四氯化碳按照4:6溶解于植物油。选取健康周龄成年雄性SD大鼠60只，体重(200士20)g，随机分为4组：正常组(25只)、模型组(25只)、细胞组合物治疗组1(20只)、细胞组合物治疗组2(20只)、细胞组合物治疗组3(20只)及生理盐水组(20只)。模型组、细胞组合物治疗组和生理盐水组采用含有40％CCl4的植物油溶液1ml/kg体重进行腹腔注射，每隔三天注射一次，连续7周，诱发模型组大鼠慢性肝功能衰竭。正常组采用植物油1ml/kg体重进行腹腔注射，每隔三天注射一次，连续7周。模型制作7周后，随机选取正常组和模型组大鼠各5只采用全自动生化分析仪检测血清和水平以观察小鼠肝功能受损情况，显微镜下观察小鼠肝脏的病理变化。造模后，模型组小鼠血清中AST和ALT水平均比正常组明显升高；病理切片显示，模型组小鼠肝组织出现水肿，空泡，大量炎性细胞浸润，并且有细胞变性坏死，与其形态学和生化指标表现相符，则判定慢性肝衰竭模型制作成功。表1造模后大鼠肝功能指标血清ALB、ALT、AST和凝血酶原时间PT水平ASTALTALBPT(s)正常组30.46±15.35175.62±23.7543.52±6.4417.86±5.21模型组276.79±38.70▲648.31±34.65▲16.71±2.67▲37.63±8.19▲▲P＜0.05vs正常组；造模后大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)均明显升高，ALB明显低于对照组(P＜0.05)。实施例3骨髓间充质干细胞组合物的制备经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90％、并且总数达到107的骨髓间充质干细胞，离心去除上清液，加注射用生理盐水清洗1-2遍，400g离心5min，收集细胞；按照30μg/ml肝细胞生长因子、4μg/ml前列腺素、20U/ml胰岛素、3mg/ml胰高血糖素、20％(w/w)白蛋白、1.5×107/kg大鼠体重的骨髓间充质干细胞重悬于注射用生理盐水中制成1ml的骨髓间充质干细胞组合物。实施例4骨髓间充质干细胞组合物的制备经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90％、并且总数达到107的骨髓间充质干细胞，离心去除上清液，加注射用生理盐水清洗1-2遍，400g离心5min，收集细胞；按照40μg/ml肝细胞生长因子、6μg/ml前列腺素、30U/ml胰岛素、5mg/ml胰高血糖素、15％(w/w)白蛋白、10×107/kg大鼠体重的骨髓间充质干细胞重悬于注射用生理盐水中制成1ml的骨髓间充质干细胞组合物。实施例5骨髓间充质干细胞组合物的制备经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90％、并且总数达到107的骨髓间充质干细胞，离心去除上清液，加注射用生理盐水清洗1-2遍，400g离心5min，收集细胞；按照60μg/ml肝细胞生长因子、8μg/ml前列腺素、40U/ml胰岛素、6mg/ml胰高血糖素、30％(w/w)白蛋白、1.0×107/kg大鼠体重的骨髓间充质干细胞重悬于注射用生理盐水中制成1ml的骨髓间充质干细胞组合物。实施例6尾静脉移植造模7周后进行干细胞组合物(实施例3～实施例5制得)移植，在大鼠麻醉后，消毒尾部，经过尾静脉给予干细胞组合物1ml注射移植，15min内注射完毕。生理盐水对照组和正常组用以同体积生理盐水注射尾静脉。每周一次，共8周。实施例7主要药效研究结果一般情况造模后，模型组大鼠逐渐出现食欲下降，行为迟钝及对刺激的反应灵敏度下降等行为学改变。但与模型组相比，经过本发明干细胞组合物治疗后，大鼠的饮食量及行为灵敏度有所提高，上述症状均明显减轻，且本发明干细胞组合物的作用更加明显。更重要的是，在治疗过程中没有发现与干细胞相关的不良反应。生存期如图4所示，经过Kaplan-Meier分析，模型组的平均生存时间为4.65个月，生长因子对照组的平均生存时间为5.15个月，本发明干细胞组(实施例3～5制得)的平均生存时间为5.88个月，同时经过检验提示，本发明干细胞组的累积生存率高于模型组和生长因子组，差异有统计学意义。表2大鼠饮食量的影响(g/天)▲P＜0.05vs空白组；△P＜0.05vs模型组；★P＜0.05vs生长因子组；记录大鼠饮食、活动、对刺激反应、皮毛光泽、脱毛等情况。采用综合评分标准判定如下:活动正常(记3分)为3～5次/min,活动减少(记2分)为1～2次/min,不活动(记1分)为<1次/min。反应灵敏(记3分)为对敲打笼壁声音迅速转向敲击音方向并伴有肢体运动,反应减弱(记2分)为对敲打笼壁声音仅转向敲击音方向,反应迟钝(记1分)为对敲击笼壁声音仅睁眼或抬头。结果：正常组大鼠均灵活，反应敏感、饮食正常，皮毛光亮柔顺。大鼠建模后1个月较正常组及假手术组稍差，术后21d出现活动减少，对外界刺激反应减弱，倦怠，精神萎靡，术后28d则上述表现加重，各大鼠基本不活动，反应迟钝，皮毛凌乱无序、脱落，易并发各种感染病。各组大鼠活动及反应评分情况见表3。表3大鼠活动及反应综合评分比较▲P＜0.05vs空白组；△P＜0.05vs模型组；★P＜0.05vs生长因子组；肝功能和凝血功能治疗结束各组大鼠采尾静脉血,用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALB水平，检测肝功能及凝血功能。正常组：正常组采用生理盐水1ml进行尾静脉注射；模型组：模型组采用生理盐水1ml进行尾静脉注射；生长因子对照组：造模方法同模型组,在造模7周后用含有20％(v/v)白蛋白、150μg/kg肝细胞生长因子、20μg/kg前列腺素E2、0.1U/kg胰岛素、15μg/kg胰高血糖素的生理盐水1ml进行尾静脉注射；治疗组1～治疗组3(干细胞组)：造模方法同模型组，在造模7周后给尾静脉给予实施例3～5制得的组合物1ml进行尾静脉注射。表4慢性肝衰竭小鼠脂肪间充质干细胞移植后肝脏生化指标观察(x±s)▲P＜0.05vs空白组；△P＜0.05vs模型组；★P＜0.05vs生长因子组；如表4所示，腹腔注射CCl4连续7周后，模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL及PT水平显著升高，同时血清ALB、CHE水平显著下降，与空白组比较，差异均有统计学意义。而经过本发明干细胞治疗后，血清ALT、AST、TBIL及PT水平显著下降，同时血清ALB、CHE水平显著上升，与模型组和生理盐水组相比，差异均有统计学意义。肝组织病理评分正常组：正常组采用生理盐水1ml进行尾静脉注射；模型组：模型组采用生理盐水1ml进行尾静脉注射；生长因子对照组：造模方法同模型组,在造模7周后用含有20％(v/v)白蛋白、150μg/kg肝细胞生长因子、20μg/kg前列腺素E2、0.1U/kg胰岛素、15μg/kg胰高血糖素的生理盐水1ml进行尾静脉注射；治疗组1～治疗组3(干细胞组)：造模方法同模型组，在造模7周后给尾静脉给予实施例3～5制得的组合物1ml进行尾静脉注射。方法：取材→脱水→浸蜡→包埋→切片→染色→封固取材：大鼠处死后，分别于肝脏同一部位取材，将肝脏组织用薄刀片切取大小约为10mm×10mm×2mm的组织块，置于10％中性甲醛溶液中浸泡固定48h；固定后按照以下程序进行切片制作：脱水将固定组织块依次浸泡在浓度递增的脱水剂中：75％乙醇浸泡2小时，85％乙醇浸泡2小时，95％乙醇浸泡1小时，95％乙醇浸泡1小时，100％乙醇Ⅰ浸泡1小时，100％乙醇II浸泡1小时；透明二甲苯I浸泡1小时，二甲苯II浸泡1小时浸蜡在不同熔点的石蜡中浸泡：在石蜡I(软蜡(52℃))中浸泡1小时，石蜡II(软蜡(54℃))浸泡1小时，石蜡III(硬蜡(58℃))浸泡1小时；包埋用镊子夹出组织块置于容器中，加入石蜡III，随后放入-20℃冰箱，使其冷凝成蜡块；切片已固定和修好的蜡块固定在切片机夹物台上，切出若干5μm厚度的切片，切好的蜡片置于40℃水浴锅中充分舒展，将蜡片贴附于载玻片上，干燥过夜；脱蜡石蜡切片经过二甲苯II，二甲苯I，100％乙醇II，100％乙醇I，95％乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇，蒸馏水中各浸泡10min；染色苏木素染色5min，自来水冲洗。(吸干水)盐酸乙醇分化30s(提插数下)。自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。(吸干水)置伊红液2min。常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(II)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(II)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min(省略)→二甲苯(I)1min→二甲苯(II)1min→中性树胶封片结果见表5。表5组别n病理损害积分空白组200模型组202.11±0.47*生长因子对照组202.56±0.61*实验组1201.29±0.34*△实验组2201.62±0.77*△实验组3201.56±0.48*△▲P＜0.05vs空白组；△P＜0.05vs模型组；★P＜0.05vs生长因子组；如表5所示，腹腔注射CCl4连续7周后，模型组和生理盐水组大鼠肝组织病理损害积分最高，经本发明干细胞组合物(实施例3～5制得的)治疗后，病理损害积分显著下降，与模型组相比，差异有统计学意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3