在水生物种中增强的免疫应答的制作方法

文档序号：15753049发布日期：2018-10-26 18:08阅读：220来源：国知局

本发明总体涉及通过激活先天免疫在对象中引发免疫应答的方法。特别地，应用免疫调节剂组合物刺激水生物种的成员中的先天免疫。

发明概述

本发明涉及应用免疫刺激性质粒来调节水生物种对象中的先天免疫的方法。所述免疫刺激性质粒可以包含与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或其组合的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含与seqidno:4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含seqidno:1的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含seqidno:4的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含seqidno:2的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含seqidno:3的序列。

在其它方面，所述免疫刺激性质粒可以由与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或其组合的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由与seqidno:4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由seqidno:1的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由seqidno:4的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由seqidno:2的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由seqidno:3的序列组成。

在一些方面，所述免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在其它方面，所述免疫刺激性质粒包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记物的核酸序列。

本发明还涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列中的任一种以及药学上可接受的载体的药物制剂。

本发明还涉及包含阳离子脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列中的任一种的免疫调节剂组合物。

在一些方面，本发明涉及使用本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列的方法。合适的使用方法包括对水生物种的对象的治疗性施用。此类治疗性施用包括一个或多个对象的预防性治疗、整体预防性治疗和感染后治疗。

本发明涉及刺激或引发对象中的免疫应答的方法。在一些方面，所述方法包括通过向对象施用本文所述的免疫调节剂组合物而刺激该对象中的免疫应答。在一些方面，所述方法包括通过向对象施用本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列而刺激该对象中的免疫应答。

其它目标和特征将是一部分显而易见的，且一部分在下文中指出。

附图简述

以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述而更好地理解。

图1显示pmb75.6质粒的图谱(seqidno:2)；

图2显示pgcmb75.6质粒的图谱(seqidno:1)；

图3显示placz75.6质粒的图谱(seqidno:4)；

图4图示说明对于鱼槽m5的攻击后每日死亡率百分数。

图5图示说明对于鱼槽m6的攻击后每日死亡率百分数。

图6显示对于来自疫苗研究的每一组的组合死亡率的kaplan-meier存活曲线。纵轴是在具体时间dpc(横轴)处的存活概率。曲线末端处的交叉代表删失数据(censoreddata)(超过27dpc存活的鱼)。dpc：攻击后天数。

图7描绘来自疫苗研究的12组鱼之间的配对比较，连接的组(由通过绿色圆圈显示的节点表示)显示在它们之间没有显著差异(α=0.05)。

图8图示说明与葡萄糖（dextrose）5%处理的对照组相比，对于疫苗研究组的存活相对百分数。比较在实验末端的累积死亡率之间进行(rpsend)。葡萄糖5%组和其它处理之间的显著累积死亡率差异(α=0.05)用*表示。

发明详述

根据本发明，已经发现了能够引发受体对象中的免疫应答的组合物，以及使用方法。具体而言，本发明涉及核酸组合物或免疫调节剂组合物及其用途。已经发现，此类免疫调节剂组合物可以用于调节水生物种成员的免疫系统。本发明尤其可用于治疗和预防由微生物引起的感染性疾病，所述微生物诸如，但不限于，病毒、细菌、霉菌、真菌、酵母、寄生虫和本领域中已知的其它微生物。下面更详细讨论了所述免疫调节剂组合物的组成及使用方法。

i.组合物

可用于本发明中的组合物，诸如本文所述的那些，通常能够用作针对感染性疾病的预防性疗法、整体预防性疗法或治疗疗法。此类组合物在本文中被称为免疫调节剂组合物。所述免疫调节剂组合物至少包含能够诱导受体对象中的免疫应答的免疫刺激性质粒或免疫刺激性dna序列。在一些方面，所述免疫应答是先天免疫应答。在一些方面，所述免疫应答是先天免疫应答和获得性免疫应答的组合。在一些方面，所述免疫调节剂组合物也可以包含脂质体递送媒介物。

a.核酸

在一些方面，本发明涉及可用于治疗或预防感染性疾病致病剂的核酸分子。本文所述的核酸分子可以以线性双链或单链dna、氨基酸序列、核糖核酸(rna)或其组合包含在免疫刺激性质粒中。在一些方面，本发明涉及含有免疫刺激性质粒或免疫刺激性dna序列的核酸分子、载体和宿主细胞(体外、体内或离体)。

本文描述的核酸分子富含cpg基序。该cpg基序可以通过免疫监视受体诱导免疫刺激，所述受体包括特异性toll样受体如tlr9和tlr21。此外，本文描述的核酸分子也包含非cpg免疫刺激性基序。在一些方面，所述核酸分子包含超过在随机核酸序列中期望的cpg基序的频率约2-20%的cpg基序。在一些方面，所述核酸分子包含超过在随机核酸序列中期望的cpg基序的频率约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40%或更多的cpg基序。在一些方面，所述核酸分子包含超过在随机核酸序列中期望的cpg基序的频率约10%的cpg基序。在一些方面，与脊椎动物dna相比，观察到多于10倍的cpg基序的富集。在一些方面，与脊椎动物dna相比，所述核酸分子包含约2至50倍或更多的cpg基序。在一些方面，与脊椎动物dna相比，所述核酸分子包含约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55倍或更多的cpg基序。

在一些方面，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或dna序列。所述质粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。例如，本文所述的pgcmb75.6质粒不包含任何全长或功能性可选择或可筛选的标记基因。pgcmb75.6的序列提供于seqidno:1中。

在一些方面，本文所述的免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒不包含抗生素抗性基因。例如，所述质粒不包含卡那霉素抗性基因。在一些方面，本文所述的质粒优选不编码免疫原。

在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因的核酸序列。例如，本文所述的placzmb75.6质粒包含lacz基因作为可筛选的标记物。placzmb75.6的图谱提供于图3中，并且placzmb75.6的核苷酸序列提供为seqidno:4。如图3中所示，placzmb75.6类似于pgcmb75.6，但含有lacz可筛选的标记物。

应当理解的是，可以在不显著不利影响其免疫刺激性特性的特定程度上改变pmb75.6(seqidno:2或seqidno:3(pmb75.6，带有ascl限制位点))、pgcmb75.6(seqidno:1)或placzmb75.6(seqidno:4)质粒的核苷酸序列。在一些方面，本发明涉及包含与pgcmb75.6(seqidno:1)的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与pgcmb75.6(seqidno:1)的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pgcmb75.6(seqidno:1)的序列。

在一些方面，本发明涉及包含与placzmb75.6(seqidno:4)的序列具有至少84%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与placzmb75.6(seqidno:4)的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含placzmb75.6(seqidno:4)的序列。

在一些方面，本发明涉及包含与seqidno:2的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与seqidno:2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含seqidno:2的序列。

在一些方面，本发明涉及包含与seqidno:3的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与seqidno:3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含seqidno:3的序列。

在一些方面，本发明涉及由与pgcmb75.6(seqidno:1)的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与pgcmb75.6(seqidno:1)的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pgcmb75.6(seqidno:1)的序列组成。

在一些方面，本发明涉及由与placzmb75.6(seqidno:4)的序列具有至少84%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与placzmb75.6(seqidno:4)的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由placzmb75.6(seqidno:4)的序列组成。

在一些方面，本发明涉及由与seqidno:2的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与seqidno:2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由seqidno:2的序列组成。

在一些方面，本发明涉及由与seqidno:3的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与seqidno:3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由seqidno:3的序列组成。

本发明的另一个重要方面提供了能够刺激免疫应答的免疫刺激性dna序列或免疫刺激性质粒，其包括在高严格条件下与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4杂交的核酸序列。合适的核酸序列包括与本发明的核酸同源、基本上类似或相同的那些。在一些方面，同源的核酸序列将与seqidno:1或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其它方面，同源的核酸序列将与seqidno:4或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其它方面，同源的核酸序列将与seqidno:2或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其它方面，同源的核酸序列将与seqidno:3或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。可以使用本领域中已知的许多算法，诸如altschul,s.f.,等人,j.mol.biol.215:403-10,1990中描述的blast，计算序列相似性。所述核酸可以由于遗传密码的简并性而与上述核酸在序列上不同。通常，参考序列将为18个核苷酸，更通常为30或更多个核苷酸，并且可以包含组合物的整个核酸序列用于比较目的。

本文设想了可以与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4杂交的核苷酸序列。严格杂交条件包括条件诸如在50℃或更高以及0.1xssc(15mm氯化钠/1.5mm柠檬酸钠)下的杂交。另一个实例是在42℃在50%甲酰胺、5xssc(150mmnacl,15mm柠檬酸三钠)、50mm磷酸钠(ph7.6)、5xdenhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20µg/ml变性、剪切的鲑鱼精dna的溶液中温育过夜，随后在0.1xssc中在约65℃下洗涤。示例性严格杂交条件是严格性为上述特定条件的至少约80%、85%、90%或95%的杂交条件。其它严格杂交条件是本领域中已知的，并且也可以用于鉴定本发明的核酸的同源物(currentprotocolsinmolecularbiology,unit6,pub.johnwiley&sons,n.y.1989)。

可以使用本文所述的dna分子的突变体核苷酸，只要突变体包含维持刺激如本文所述的先天免疫应答的能力的核酸序列。此类突变的dna序列通常相差一个或多个核苷酸或氨基酸。序列变化可以是置换、插入、缺失或其组合。用于诱变克隆的基因的技术是本领域中已知的。用于位点特异性诱变的方法可见于gustin等人,biotechniques14:22,1993;barany,gene37:111-23,1985;colicelli等人,mol.gen.genet.199:537-9,1985;和sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,cshpress1989,pp.15.3-15.108，并且所有都通过引用并入本文。总之，本发明涉及能够刺激对象中的先天免疫应答的核酸序列及其变体或突变体。本发明也涵盖了由所述核酸序列编码的中间rna，以及编码的任何所得氨基酸序列。

在一些方面，当免疫刺激性质粒的核苷酸序列与seqidno1、2、3和4中提供的序列不同时，所述质粒中的cpg二核苷酸优选保持完整。或者，如果改变质粒的核苷酸序列、使得cpg二核苷酸被消除，则可以在另一位置改变质粒的序列，使得质粒中的cpg二核苷酸的总数保持相同。除了pgcmb75.6或placzmb75.6的核苷酸序列中已经存在的那些以外，另外的cpg二核苷酸也可以被引入质粒中。因此，例如，本文所述的免疫刺激性质粒优选包含至少约200、至少约220、至少约240、至少约260、至少约270、至少约275、至少约280、至少约283、至少约285或至少约288个cpg二核苷酸。例如，所述免疫刺激性质粒可以包含283个cpg二核苷酸。

在一些方面，当免疫刺激性质粒的核苷酸序列与本文中提供的序列不同时，所述质粒中的cpg基序类型被改变，以调节得到的胞质dna监视分子的激活。例如，可以增加免疫刺激性cpg基序的数目，以增加响应于免疫刺激性质粒/dna的特定阈的特异性胞质dna监视分子的激活。通过更多实施例的方式，可以增加非免疫刺激性cpg基序的数目，以减少特异性胞质dna监视分子的激活和/或增加其它dna监视分子的激活。

具体而言，本发明涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列中的任一种以及药学上可接受的载体的药物制剂。

b.免疫调节剂

用于随本文所述的免疫刺激性质粒使用的合适的免疫调节剂组合物描述于美国专利申请公开号2012/0064151a1和2013/0295167a1，其两者的内容以其整体通过引用并入本文。

所述免疫调节剂组合物包含脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列中的至少一种。

合适的脂质体递送媒介物包含能够将核酸分子递送至被治疗对象的组织的脂质组合物。脂质体递送媒介物优选能够在对象中保持足够长时间的稳定以递送核酸分子和/或生物制剂。例如，所述脂质体递送媒介物在受体对象中稳定至少约五分钟、至少约1小时或至少约24小时。

本发明的脂质体递送媒介物包含能够与细胞的质膜融合以便将核酸分子递送入细胞的脂质组合物。当核酸分子编码一种或多种蛋白时，核酸∶脂质体复合物优选具有至少约1皮克(pg)表达的蛋白/毫克(mg)总组织蛋白/微克(μg)递送的核酸的转染效率。例如，核酸∶脂质体复合物的转染效率可以是至少约10pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸；或者至少约50pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸。复合物的转染效率可以低至1毫微微克(fg)表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸，上述量是更优选的。

本发明优选的脂质体递送媒介物直径为约100至500纳米(nm)。例如，所述脂质体递送媒介物的直径可以为约150至450nm或者约200至400nm。

合适的脂质体包括任何脂质体，诸如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因递送方法中的那些脂质体。优选的脂质体递送媒介物包含多层囊泡(multilamellarvesicle，mlv)脂质和挤出脂质。用于制备mlv的方法是本领域熟知的。更优选的脂质体递送媒介物包含具有聚阳离子脂质组合物的脂质体(即阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固醇主链的脂质体。示例性阳离子脂质体组合物包含但不限于n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)和胆固醇、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)和胆固醇、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(dotim)和胆固醇、二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)和胆固醇以及其组合。用作递送媒介物的最优选的脂质体组合物包含dotim和胆固醇。

合适的核酸分子包括本文所述的免疫刺激性质粒中的任一。编码核酸序列编码蛋白或肽的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肽的任何部分。根据本发明，“非编码”核酸可以包含转录单元的调节区，诸如启动子区。术语“空载体”可以与术语“非编码”互换使用，并且具体是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，诸如没有基因插入物的质粒载体。由本文所述的质粒编码的蛋白的表达不是诱导免疫应答所必需的；因此所述质粒不需要含有可操作连接至转录控制序列的任何编码序列。然而，可以通过在组合物中包含编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列(dna或rna)而获得另外的优点(即抗原特异的和增强的免疫)。此类编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列可以包含于本文所述的免疫刺激性质粒中，或者可以包含于所述组合物中的单独的核酸(例如，单独的质粒)中。

可以使用本领域标准的方法或美国专利号6,693,086(其内容以其整体通过引用并入本文)描述的方法实现脂质体与本文所述的免疫刺激性质粒或免疫刺激性dna序列的复合。添加至脂质体的质粒的合适浓度包括将足够量的质粒有效地递送至对象内、使得引发全身性免疫应答的浓度。例如，约0.1μg至约10μg质粒可以与约8nmol脂质体组合，约0.5μg至约5μg质粒可以与约8nmol脂质体组合，或者约1.0μg质粒可以与约8nmol脂质体组合。组合物中的质粒与脂质的比率(μg质粒:nmol脂质)可以为以重量计至少约1:1质粒:脂质(例如，1μg质粒:1nmol脂质)。例如，质粒与脂质的比例可以为至少约1:5，至少约1:10，或至少约1:20。本文表述的比率基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。本发明的组合物中核酸与脂质的比率合适地为以重量计约1:1至约1:80质粒:脂质；以重量计约1:2至约1:40质粒:脂质；以重量计约1:3至约1:30质粒:脂质；或者以重量计约1:6至约1:15质粒:脂质。

c.生物制剂

除了本文所述的脂质体递送媒介物和至少一种质粒以外，本文所述的任何免疫调节剂组合物还可以包含至少一种生物制剂。

合适的生物制剂是有效预防或治疗疾病的制剂。此类生物制剂包括免疫增强剂蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。合适的免疫增强剂蛋白是已知增强免疫的那些蛋白。作为非限制性实例，细胞因子（其包括一个蛋白家族），是已知增强免疫的蛋白家族。合适的免疫原是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，使得向对象施用免疫原获得针对在对象的组织内遇到的相同或类似蛋白的免疫原特异性免疫应答。免疫原可以包括由细菌、病毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括源自在对象中引起感染性疾病的生物体的抗原。根据本发明，免疫原可以是天然存在或合成来源的蛋白的任何部分，其引发体液和/或细胞免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可以是小至约5-12个氨基酸，并且大至全长蛋白，包括这两者之间的任何大小。所述抗原可以是多聚体蛋白或融合蛋白。所述抗原可以是纯化的抗原。或者，所述免疫增强剂蛋白或免疫原可以由所述免疫调节剂组合物中所包含的免疫刺激性质粒或另一种核酸编码。当免疫增强剂蛋白或免疫原由免疫调节剂组合物中的核酸分子编码时，编码免疫增强剂蛋白或免疫原的核酸序列可操作连接至转录控制序列，使得在对象的组织中表达免疫原，由此在对象中引发除非特异性免疫应答之外的免疫原特异性免疫应答。筛选免疫原性诸如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括各种体外和体内测定法。

当生物制剂是疫苗时，所述疫苗可以包括活的感染性的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗或者杀死的灭活的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗、或亚单位疫苗或本领域已知的任何疫苗。一种或多种疫苗可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。合适的疫苗包括本领域中已知的用于水生物种的那些。

所述生物制剂可以是抗微生物剂。合适的抗微生物剂包括：喹诺酮类，优选氟喹诺酮类、β内酰胺类和大环内酯-林可酰胺类-链阳性菌素(mls)抗生素。

合适的喹诺酮类包括培诺沙星、宾氟沙星（binfioxacin）、西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星（danofioxacin）、二氟沙星（difioxacin）、依诺沙星、恩诺沙星（enrofioxacin）、氟罗沙星（fieroxacin）、吉米沙星、依巴沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星（orbifioxacin）、帕珠沙星、普多沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司巴沙星、替马沙星和托氟沙星（tosufioxacin）。优选的氟喹诺酮类包括环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星和普多沙星。合适的萘啶酮类包括萘啶酮酸。

合适的β内酰胺类包括青霉素(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、苄星青霉素、苄青霉素、羧苄青霉素、氯唑西林、可拉维酸[即阿莫西林/克拉维酸]、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苯氧甲基青霉素、哌拉西林、普鲁卡因青霉素、替莫西林和替卡西林)；头孢菌素类(例如，头孢克洛、头孢洛宁、头孢孟多、头孢匹林、头孢唑林、头孢吡肟、头孢克肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢喹肟、头孢他啶、头孢噻呋、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩和头孢替坦)；碳青霉烯类和青霉烯类(例如，多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南和美罗培南)；单环β内酰胺类(例如，氨曲南、诺卡霉素a、烟草毒素-β-内酰胺和替吉莫南)；和β内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦)。优选的β-内酰胺类包括头孢菌素类，特别是头孢唑啉。

优选的mls抗生素包括克林霉素、林可霉素、吡利霉素和任何大环内酯抗生素。优选的林可酰胺抗生素是吡利霉素。

其它抗微生物剂包括氨基糖苷类、氯羟吡啶、迪美唑类、红霉素、弗氏菌丝素、呋喃唑酮、卤夫酮、2-吡啶酮、氯苯胍、磺胺类、四环素类、甲氧苄啶、各种截短侧耳素(例如，泰妙菌素和沃尼妙林)和各种链霉素(例如，莫能菌素、甲基盐霉素和盐霉素)。

ii.方法

本发明的目标是提供刺激免疫和提供对未感染的对象的保护性免疫、对感染的对象的保护性免疫、对未感染的对象的增强免疫、对感染的对象的增强免疫、对感染的对象的治疗性免疫或其组合的免疫调节剂组合物、免疫刺激性质粒(或dna序列)和方法。因此，本发明的组合物可用于预防性免疫对象或用于治疗对象。本文所述的方法包括向对象施用本文所述的免疫刺激性质粒或dna序列和刺激所述对象中的免疫系统。

a.刺激对象的免疫系统的方法

本发明涉及刺激或增强受体对象中的免疫系统的方法。所述方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，所述免疫调节剂组合物刺激受体对象中的免疫应答，并且所述免疫应答帮助击败感染。在一些方面，所述免疫调节剂组合物激活胞质dna监视分子。在一些方面，当在此类疫苗之前施用、与疫苗共同施用、疫苗接种后施用或与疫苗混合时，所述免疫调节剂组合物增强至少一种生物制剂（诸如疫苗）的作用。在一些方面，所述方法提供了用于保护受体对象免于感染性疾病并且治疗患有感染性疾病的群体的新的治疗策略。在一些方面，当免疫调节剂与疫苗组合使用时，相比使用没有所述免疫调节剂组合物的疫苗，所述方法提供了针对疾病的更快速、更长并且更好的保护。

可以通过施用有效量的免疫调节剂组合物而在受体对象中激活免疫应答，所述免疫调节剂组合物包含本文所述的任何脂质体递送媒介物、本文所述的任何免疫刺激性质粒(或dna序列)和任选地本文所述的任何生物制剂。设想了生物制剂可以与免疫调节剂混合或共同施用，或者其独立施用。独立施用可以在施用免疫调节剂之前或之后。还设想了可以多于一次施用免疫调节剂或生物制剂。此外，多于一种生物制剂可以与免疫调节剂共同施用、在免疫调节剂之前施用、在免疫调节剂施用之后施用或者与免疫调节剂同时施用。

b.改善对象的存活力的方法

本发明涉及改善水生物种的成员的存活力的方法。改善存活力的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供受体对象的改善的存活力。

c.改善生产的方法

本发明涉及改善在水产养殖（aquaculture）中饲养的水生物种的成员的生产的方法。改善生产的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供受体对象的改善的生产。评估改善的生产的方法是本领域公知的。技术人员会认识到，在接受免疫调节剂组合物的对象和未接受免疫调节剂组合物的那些对象之间比较健康状况、重量、大小、肉质和其它参数，可以测量改善的生产。

d.改善饲料利用的方法

本发明涉及改善在水产养殖中饲养的水生物种的成员的饲料利用的方法。改善饲料利用的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供受体对象的改善的饲料利用。评估饲料利用的方法是本领域公知的。技术人员会认识到，在接受免疫调节剂组合物的对象和未接受免疫调节剂组合物的那些对象之间比较健康状况、重量、大小、肉质和其它参数，可以测量改善的饲料利用。

e.改善存活率的方法

本发明涉及改善在水产养殖中饲养的水生物种的成员的存活率的方法。改善存活率的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供受体对象的改善的存活率。评估改善的存活率的方法是本领域公知的。技术人员会认识到，在接受免疫调节剂组合物的对象和未接受免疫调节剂组合物的那些对象之间比较健康状况、重量、大小、肉质和其它参数，可以测量改善的存活率。

可以向对象施用有效量的本文所述的任何免疫调节剂组合物。所述有效量足以激活受体对象中的免疫应答。测量所述激活的方法是本领域中熟知的。此外，技术人员将认识到，有效量将取决于年龄、重量、对象的物种和感染的阶段以及本领域中已知的其它因素。合适的有效量的范围可以为每个对象约0.1μg至1,000μg。在一些方面，所述有效量的范围可以为约0.1μg至约10μg、约0.1μg至约5μg、约0.5μg至约5μg、约0.25μg至约5μg、约0.05μg至约10μg、约5μg至约15μg、约10μg至约15μg、约10μg至约20μg、约20μg至约30μg、约30μg至约40μg、约40μg至约50μg、约50μg至约70μg、约70μg至约90μg、约50μg至约100μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约450μg至约500μg、约500μg至约550μg、约550μg至约600μg、约600μg至约650μg、约650μg至约700μg、约700μg至约750μg、约750μg至约800μg、约800μg至约850μg、约850μg至约900μg、约900μg至约950μg、约950μg至约1000μg。优选地，在一些方面，所述有效量范围为约0.5μg至约10μg。

f.使用条件

本发明的方法在对象中激活免疫应答，使得对象被保护免于易受引发免疫应答治疗的疾病。如本文所使用，短语“保护免于疾病”是指减轻疾病的症状；减少疾病的发生；减轻疾病的临床或病理严重性；或者减少引起疾病的病原体的脱落。保护对象可以指本发明的治疗组合物当向对象施用时其预防疾病发生、治疗和/或减缓或减轻疾病症状、临床体征、病理学或病因的能力。因此，保护对象免于疾病包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病的对象(治疗性治疗)。术语“疾病”是指对象的正常健康的任何偏离，并且包括当存在疾病症状时的状态以及其中已发生偏离(例如感染、基因突变、遗传缺陷等)、但症状仍未显现的状况。

本发明的方法可以用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减缓疾病和预防由原发性疾病的发生导致的继发性疾病。

在一些方面，相比于仅仅施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本文所述的方法可以用于改善对象的先天免疫应答。在一些方面，相比于仅仅施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本文所述的方法可以用于改善对象的获得性免疫应答。由于需要时间来刺激获得性免疫，因此通常疫苗施用一次不立即保护对象。术语“改善”在本发明中是指在对象中引发先天免疫应答，直到疫苗开始保护对象和/或通过由疫苗给予的获得性免疫来延长保护期间。

在一些方面，本发明的方法包括施用组合物来针对广泛种类病原体的感染进行保护。施用的组合物可以包含或可以不包含引发特异性应答的特异性抗原。设想了本发明的方法将保护受体对象免于由感染性微生物病原体导致的疾病，所述感染性微生物病原体包括而不限于病毒、细菌、真菌和寄生虫。技术人员将认识和理解，本文所述的免疫调节剂组合物针对许多感染病原体(其太多而无法列举)是有效的。本文提供的感染病原体是出于示例性目的而提供，并且不限制使用范围而提供。

g.施用

多种施用途径是可用的。选择的具体模式当然将取决于选择的具体生物制剂、对象的年龄和总体健康状态、所治疗的具体状况和治疗效力所需的剂量。本发明的方法可以使用任何施用模式来实施，其产生有效水平的免疫应答的激活而不引起临床上不可接受的副作用。所述组合物可以方便地以单位剂型提供，并且可以通过本领域熟知的任何方法制备。

所述免疫调节剂组合物可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、卵内、口服、眼内、气管内、鼻内、通过浸入（immersion）、经皮肤或鳃在缸盆期间摄取、或通过本领域中已知的其它方法来施用。在一个方面，皮下施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以肌内施用所述免疫调节剂。在另一个方面，作为喷雾施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以口服施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以皮下施用所述免疫调节剂。

在一个方面，可以在攻击(或感染)之前向对象单独施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以在攻击(或感染)之后向对象单独施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以在攻击(或感染)的同时向对象单独施用所述免疫调节剂。

在一些方面，可以在攻击之前，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，可以在攻击(或感染)的同时，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，共同施用可以包括在对象的相同惯用位置上在彼此相邻的两个不同部位(即在对象的颈部彼此相邻地注射)、在对象的相同惯用位置的相对侧(即颈部每一侧上各一次)、或在相同对象的不同位置上施用疫苗和免疫调节剂。在一些方面，可以在疫苗接种和攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，可以在疫苗接种之后、但在攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。可以在攻击之后向已在攻击(或感染)之前疫苗接种的对象施用所述免疫调节剂组合物。

技术人员将认识到，施用途径可以根据对象和对象的健康或状态而变化。出于示例性目的提供了施用途径，并且不加限制。

可以在任何年龄进行疫苗接种。可以皮下、通过喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内、卵内、通过浸入或通过本领域中已知的其它方法施用疫苗。口服疫苗可以在饲料或水中施用。另外，设想了可以基于常规疫苗接种方案来使用本发明的方法。

也可以皮下、通过眼内、气管内、鼻内、卵内或通过本领域中已知的其它方法施用所述免疫调节剂组合物。例如，可以卵内施用所述免疫调节剂组合物。或者，可以作为喷雾施用所述免疫调节剂组合物。

向蛋的施用可以在攻击(或感染)之前或攻击之后。

可以在攻击之前约1至约14天或者在攻击之后约1至约14天向对象施用所述免疫调节剂。例如，可以在攻击之前约1至约7天或者在攻击之后约1至约7天施用所述免疫调节剂。在攻击之前1、2、3、4、5、6、7天或攻击之后1、2、3、4、5、6、7天合适地施用所述免疫调节剂。

其它递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放的递送系统。此类系统可以避免组合物的反复施用，从而提高便利性。许多类型的释放递送系统是可用的，并且为本领域普通技术人员所知。它们包括基于聚合物的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚正酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊在例如美国专利号5,075,109中描述。

递送系统也包括非聚合物系统，其为脂质，包括甾醇诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪诸如单、双和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡质包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于侵蚀系统(本发明的制剂以基质内形式包含其中，诸如描述于美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中的那些)和扩散系统(其中活性成分以受控速率从聚合物渗出，诸如描述于美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686)。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适于植入。

因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述组合物、产品和方法进行多种变化，所以预期上文描述和下文给出的实施例中包含的所有事项均应被解释为说明性而非限制性的涵义。

定义

术语“有效量”是指必需或足以实现期望的生物效应的量。例如，用于治疗或预防感染性疾病的免疫调节剂的有效量是暴露于微生物后引起免疫应答的发生所必需的量，因而引起对象内微生物量的降低并且优选微生物的根除。对于任何具体应用的有效量可以根据这些因素诸如所治疗的疾病或状况、对象的大小或疾病或状况的严重性而变化。本领域普通技术人员无需过度实验，通过经验就可以确定免疫调节剂的有效量。

术语“细胞因子”是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子(即调节细胞、特别是吞噬细胞的迁移和活化的蛋白)。示例性细胞因子包括而不限于白介素-2(il-2)、白介素-12(il12)、白介素-15(il-15)、白介素-18(il-18)、干扰素-α(ifnα)和干扰素-γ(ifnγ)。

术语“引发”可以与术语活化、刺激、产生或上调互换使用。

术语在对象中“引发免疫应答”是指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且可以包括活化免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和/或改变免疫应答(诸如通过引发一类免疫应答，其进而将对象中免疫应答的优势类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性的类型)。

术语“可操作连接”是指以这样的方式将核酸分子连接至转录控制序列，所述方式使得当被转染(即转化、转导或转染)入宿主细胞时能够表达所述分子。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，诸如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括在禽类、鱼、哺乳动物、细菌、病毒、植物和昆虫细胞中发挥功能的那些。尽管本发明可以使用任何转录控制序列，但所述序列可包括天然存在的转录控制序列，其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然缔合。

术语“核酸分子”和“核酸序列”可以互换使用，并且包括dna、rna、或dna或rna的衍生物。该术语还包括寡核苷酸和更大的序列，诸如质粒，诸如本文所述的免疫刺激性质粒，且包括编码蛋白或其片段的核酸分子以及包含调节区、内含子或其它非编码dna或rna的核酸分子。通常，寡核苷酸具有长度为约1到约500个核苷酸的核酸序列，并且更通常，长度为至少约5个核苷酸。核酸分子可以源自任何来源，包括哺乳动物、鱼、细菌、昆虫、病毒、植物、合成来源或其组合。核酸分子可以通过本领域通常已知的方法来产生，诸如重组dna技术(例如，聚合酶链式反应(pcr)、扩增、克隆)或化学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子，其中已经以这样的方式插入、缺失、置换或倒置核苷酸，使得此类修饰基本上不干扰核酸分子引发可用于本发明的方法的免疫应答的能力。核酸同源物可以使用本领域技术人员已知的许多方法来产生(参见，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlabspress,1989)，其通过引用并入本文。

术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物保护其中表达所述基因的生物体免于通常会杀死该生物体或抑制其生长的选择剂(例如，抗生素)或状况。可选择的标记基因是最常用的抗生素抗性基因(例如，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等)。因此，例如，当大肠杆菌细胞经受转化程序以引入编码卡那霉素抗性基因的质粒，然后在含有卡那霉素的培养基上或其中生长时，只有已经成功摄取质粒并表达卡那霉素抗性基因的大肠杆菌细胞才将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括编码参与对于生物体的生长所必需的化合物的合成的酶的基因。当被引入到不能合成必需化合物的营养缺陷型生物体时，此类基因允许生物体在已经补充有必需化合物的培养基中生长。例如，由于参与赖氨酸生物合成的酶中的突变或不存在所述酶而对于氨基酸赖氨酸营养缺陷的细菌细胞通常无法在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长。当此类细菌经受转化程序以引入编码参与赖氨酸生物合成的酶的质粒时，已经成功摄取所述质粒并表达所述酶的细菌当在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长时将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括允许毒物/解毒剂选择的基因。例如，ccdb基因编码结合dna促旋酶(对于细胞分裂所必需的酶)的蛋白。结合dna促旋酶之后，ccdb基因产物损害基因复制并诱导细胞死亡。因此，表达ccdb基因产物的细菌不能存活。ccda基因编码充当ccdb基因产物的天然抑制剂的蛋白(“解毒剂”)。因此，当在其细菌基因组中具有ccdb基因的细菌经受转化程序以引入编码ccda基因产物的质粒时，只有成功摄取所述质粒并表达ccda基因的细胞才将存活。

术语“可筛选的标记物”和“可筛选的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物允许观察者区分表达可筛选的标记基因的细胞和不表达可筛选的标记基因的细胞。可筛选的标记基因系统是本领域中熟知的，并且包括，例如，lacz基因和编码荧光蛋白的基因，所述荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或青色荧光蛋白(cfp)。

如本文所用，术语“改善生产”指在接受免疫调节剂组合物的对象和未接受免疫调节剂组合物的那些对象之间诸如健康状况、重量、大小、肉质或其它参数的测量中的改善。

如本文所用，术语“改善存活力”指与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，受体对象的改善的存活。

如本文所用，术语“对象”是指水生物种的成员，包括相当多样水生物种中的任一。对象可以是水生物种的任何成员，无论是驯养的还是野生的，并且可以进行商业饲养用于繁殖、产肉或产蛋。示例性水生物种包括，但不限于，生活在淡水或咸水中的鱼、甲壳类动物、软体动物的任何物种。代表性物种包括但不限于鱼，包括脊索动物门（phylumchordata）、子脊椎动物门（subphylumvertebrata）和鱼总纲（superclasspisces）的任何成员。通过进一步的实例而非限制，该鱼包括鲶鱼（catfish）、斑点叉尾鮰（channelcatfish）、黑鮰（blackbullhead）、黄鮰（yellowbullhead）、云斑鮰（brownbullhead）、鲤鱼（carp）、鲫鱼（cruciancarp）、鳟鱼（trout）、虹鳟鱼（rainbowtrout）、褐鳟（browntrout）、溪斑鳟（speckledbrooktrout）、鲑鱼（salmon）、大西洋鲑（atlanticsalmon）、银鲑（cohosalmon）、奇努克鲑或帝王鲑（chinookorkingsalmon）、丁鲷（tench）、拟鲤（roach）、狗鱼（pike）、梭鲈（pike-perch）、多佛鳎（doversole）、大菱鲆（turbot）、黄尾鱼（yellowtail）、鲈鱼（bass）、小嘴鲈鱼（smallmouthbass）、大嘴鲈鱼（largemouthbass）、条纹鲈（stripedbass）、银花鲈（stripers）、虱目鱼（milkfish）、罗非鱼（tilapia）、鲻鱼（graymullet）、鳗鱼（eels）、鳕鱼（cod），并且本发明可以用其实施的任何其它品种或水生物种对于本领域技术人员将是显然的。在一些方面，对象可以被诊断为患有感染性疾病、可以具有感染性疾病的风险或者可以正在经历感染性疾病。对象可以是任何年龄的，包括在卵内的、新生的、青春期的、成年的、中年的或老年的。

表1：质粒dna序列

实施例

提供了以下非限制性实施例以进一步举例说明本发明。

实施例1.应用ipnv共栖攻击与灭活的ipnv抗原配制时，接受dna免疫调节剂的大西洋鲑的评价

本研究的目的是确定在ipnv共栖之前施用于鲑鱼的dna免疫调节剂的效力。

免疫调节剂

本研究中应用的dna免疫调节剂是包含cpg二核苷酸序列的质粒dna脂质体复合物。质粒dna是由seqidno:2表示的pmb75.6质粒。质粒dna脂质体复合物在5%葡萄糖溶液中配制。

本研究中应用的montanide油(montanideisa763a)是可代谢的油，其为i型佐剂，提供强的和长期的免疫应答。由seppic供应的montanideisa763avg包含可注射的可代谢的油(不包含矿物油)和得自植物来源的甘露醇和纯化油酸的极其精炼的乳化剂。

ipnv抗原

ipnv(传染性胰腺坏死病毒)在chse-214细胞系中增殖，直至达到100%细胞病理效应(cpe)。抗原被福尔马林灭活，然后在各种处理中以恒定浓度与上面列出的免疫调节剂中的任一组合配制。

alphaject®2-2

该可商购的疫苗用作对照。该疫苗是油乳剂，其用于预防归于疖点病（furunculose）和ipnv感染的鱼中的死亡率。

ipnv抗原疫苗制剂

ipnv抗原配制为单价疫苗，以3个不同浓度/比例与dna免疫调节剂或montanide油组合。处理组合物概要示于表2。

表2.疫苗制剂

研究动物

大西洋鲑(salmosalar)不经接种而获得，并且免疫状态由供应商记录。从研究中排除性成熟的、受损伤的或畸形的鱼。将鱼分为在3个槽中各30条鱼的12个处理组(处理组a至l)，每槽总共360条处理鱼。在3个槽中的每一个中，由72条鱼组成的另一组用作散播者（shedders）或积极散播ipnv的鱼。在疫苗施用之前，将实验鱼麻醉并通过在处理日之前2周注射pit-标签进行标记。

研究设计

在疫苗施用之前，使鱼饥饿最少48小时。在处理日，对处理组施用上面表2中描述的不同剂量的疫苗或对照物。根据表2腹膜内施用疫苗或对照物。研究在3个槽中进行。每一槽具有各30条鱼的12个实验组。2个槽用作副本用于攻击实验(槽1和2，表3)。第3个槽用于在免疫调节研究期间采样(槽3，表3)。

表3.研究设计。dna免疫调节剂在此表中缩写成dna。

在接种和光周期操纵后约6周，在最少600度日（degreedays）之后，攻击实验有关转移至海水而实施。在攻击之前，使鱼饥饿最少25小时。所有槽同时攻击。散播者腹膜内注射以培养的病毒并通过在攻击时切割脂鳍标记。在注射和标记之后，引入散播者。将来自槽1和2的鱼分配给槽m5和m6，并且将来自槽3的鱼转移至槽m2。

采样

对于每一时间点，对鱼进行宰杀并且获得组织例如头-肾、肝和脾样品用于免疫制图。也收集血液用于血清学和/或转录物组分析。在每一时间点，对每一处理5条鱼进行宰杀和采样。在接种前，对来自总群体的10条鱼采样。在接种后，在接种后24和48小时收集来自槽3的样品。在攻击后，取得来自槽1和2的样品用于标准确认损失(10%的死亡率)。在攻击后3和7天收集来自槽3的样品。在攻击期末端，对存活的鱼进行宰杀和采样。

对来自ipnv攻击槽(槽1和2)的代表性选择的死鱼进行肾采样并在ipnvagelisa中测试。选择在死亡率的起始、中间和结束进行，直至总共10%的鱼(30/槽)。

对在攻击期间代表性选择的死鱼(实验中包含的鱼总数的约10%)进行细菌学检查。

结果

在引入散播者之后，使攻击研究进行，直至死亡率趋于平缓或在阴性对照组中达到100%。在槽1和2中在感染后22至28天达到死亡率的高地(图4和图5)。

应用ipnvagelisa和细菌学分析对死去的鱼进行采样。ipnvagelisa测试揭示，75.5%的来自槽m6的鱼对于ipnv为阳性，62.5%的槽m5中的鱼和仅仅35.2%的槽m2中的鱼对于ipnv为阳性(表4)。取自10%死亡率的样品提交用于细菌学分析。取自各槽中鱼的无细菌生长的样品的百分数对于槽m5、m6和m2分别为77.5%、64.9%和98.1%(表5)。随后记录的大多数死亡率对于细菌生长是阴性的。

表4.ipnvagelisa结果

表5.来自槽m5、m6和m2的细菌学结果

测定组合数据的kaplan-meier存活曲线，以便理解和比较来自每一处理组(组a至l)的存活时间。如图6中观察的，存活概率在两个不同群体中被隔开。具有较低存活概率的群体由用葡萄糖(a)或无抗原的3个不同剂量的dna免疫调节剂(b、c和d)处理的鱼组成，而显示较高存活概率的群体由用仅ipnv抗原(e)、用dna免疫调节剂(f、g和h)或用montanide油(i、j和k)配制的ipnv抗原、和商购疫苗(l)处理的组组成。当整体比较时，在存活曲线中在12个不同处理之间发现统计学显著差异(卡方=110.6df=11；p值(<0.0001)=2.2x10-16)。

处理在2个不同簇中划分(图7)。一个簇包含葡萄糖-处理(a)以及所有无抗原dna免疫调节剂处理(b、c、d)。另一簇由用仅ipnv抗原(e)、dna免疫调节剂配制疫苗(f、g、h)、montanide配制抗原(i、j、k)和商购疫苗(l)处理的鱼组成。

2个簇之间的显著差异是明显的，因此证明与阴性对照组相比鱼存活通过接种显著改善，但是在不同疫苗制剂之间没有见到差别。

在实验的末端(rpsend)在所有处理组中计算相对存活百分数(图8)。在5%葡萄糖阴性对照组和所有配制疫苗之间测量到显著差异。

应用斯皮尔伯格量表（speilbergscale）评估用于配制疫苗的佐剂的可能副作用。没有观察到特别的继发效应。组织损害几乎不存在，仅有偶尔的水平2(低)评分（对于商购产品中的粘连和色素沉着）和水平1评分（对于dna免疫调节剂）(表6)。在任何采样的鱼中都检测不到疫苗残留。

表6.对槽m5和m6的斯皮尔伯格评分

结论

在该研究中，评估在大西洋鲑中用灭活ipnv作为疫苗配制的dna免疫调节剂的效力。当dna免疫调节剂单独施用(处理b、c和d)时，其给出最少的保护，死亡率范围是93.3至100%，存活概率与仅葡萄糖对照组相比没有显著差异。这预期是因为由dna免疫调节剂引发的先天免疫应答将最有可能通过攻击时间点消除(588度日或约接种后7周)，尽管这在本研究中没有评估。

如图8中描绘的，与5%葡萄糖组相比，单独的ipnv灭活抗原的存在足以显著增加接种的鱼的存活概率，rpsend是21.4%。用dna免疫调节剂的佐剂化制剂(f=28.7%,g=42.9%,h=41.1%)和montanide的佐剂化制剂(1=42.9%,j=39.3%,k=23.2%)，保护进一步增加。在安全性方面，没有问题被记录，并且dna免疫调节剂被认为对于在鱼中应用是安全的。

该研究显示dna免疫调节剂作为鱼疫苗佐剂的潜在应用，其帮助诱导大西洋鲑中免疫应答的能力，以及其以10μg或更低施用时的安全性概况。

当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一(a,an)”、“该(the)”和“所述(said)”意指存在所述要素中的一者或多者。术语“包含(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”旨在是包括性的，并且意指可以存在除了列出的要素以外的另外的要素。

鉴于上述内容，将看到，实现了本发明的若干个目标，并且得到了其它有利的结果。

因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述产品、组合物和方法进行多种变化，所以预期上文描述中含有和附图中显示的所有事项均应被解释为说明性而非限制性的涵义。

sequencelisting

<110>

<120>在水生物种中增强的免疫应答

<130>bayr

<160>17

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

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<220>

<223>质粒pgcmb75.6的核苷酸序列

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