一种共载化学抗肿瘤药物和anti‑Fas抗体的纳米载药体系的制备方法与流程

本发明属于制药领域，尤其涉及一种基质金属蛋白酶响应的共载化学抗肿瘤药物和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法，实现免疫治疗-化学药物治疗联合的智能型纳米载药体系的制备工艺。

背景技术：

恶性肿瘤是严重威胁人类的重大疾病，目前的治疗方法主要包括手术治疗、药物治疗、放射治疗，其中药物治疗包括常规化学药物治疗、靶向药物治疗、以及新兴的免疫治疗。作为肿瘤治疗重要的组成部分，常规化学药物治疗在延长生命、改善健康方面发挥了重要的作用。但常规化学药物如阿霉素，在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常细胞造成可逆或不可逆性损伤，表现为一系列的毒副反应，包括消化道反应、骨髓抑制、器官毒性、神经毒性等，严重阻碍了化疗药物在临床上的应用。

纳米技术可以与抗肿瘤药物相结合，包载化疗药物的纳米颗粒肿瘤渗透滞留效应强，可增加常规化疗药物在肿瘤组织中的聚集，即化疗药物“被动靶向性”增强；同时通过在纳米颗粒上连接抗体、肽链等配体介导胞吞作用达到化疗药物“主动靶向性”，进一步减少对正常组织的毒副作用。

基质金属蛋白酶(mmps)是一大类和细胞外基质降解有关的锌指内肽酶。肿瘤细胞通过旁分泌促进基质细胞分泌,并募集mmps到肿瘤细胞周围。由于肿瘤的产生、转移必须首先突破肿瘤原发部位的细胞外基质，因此，可降解基质的mmps在肿瘤的发生发展、特别是侵袭和转移中，扮演了重要的角色。mmps家族中，mmp-2和mmp-9可降解明胶蛋白，ⅳ型、ⅴ、ⅶ和ⅺ型胶原，纤维黏连蛋白、层黏连蛋白等，在肿瘤的生长、侵袭转移等过程中有重要的地位。针对mmp-2和mmp-9的药物设计，对于肿瘤的靶向治疗，进一步提高抗癌药物在肿瘤部位的疗效以及降低其对机体的毒副作用有着重要的意义。

免疫治疗是通过增强免疫系统对肿瘤细胞识别和(或)细胞毒性作用达到治疗目的。fas-fasl通路介导凋亡是免疫系统中及其重要的一种调节机制，细胞毒淋巴细胞(ctl)识别靶细胞后，细胞表面表达高水平fasl与靶细胞表面的fas相互识别，通过fas-fasl通路触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性细胞死亡。fas-fasl通路在肿瘤细胞的凋亡和免疫逃逸的过程发挥重要的作用，可通过fas-fasl通路实现抗肿瘤治疗。目前多采用抗体技术解除t细胞的制动器，或体外对t细胞进行基因修饰增强t细胞表面的fasl表达。这些技术复杂、适用面窄、费用昂贵，临床应用局限。因fas抗原在人体各组织中分布广泛，为非特异性抗原分子，直接采用外源性anti-fas抗体(类内源性fasl)或水溶性fasl(sfasl)将导致体内正常的免疫系统遭受破坏，产生免疫性疾病。

因此，本发明设计了一种新型智能型的纳米药物载体，通过与肿瘤微环境中mmps响应可程序性地在肿瘤组织中释放anti-fas抗体及小分子抗肿瘤药物，增强药物的肿瘤靶向性，同时通过fas-fasl通路及化学抗肿瘤药物联合作用增强抗肿瘤效果。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实现与肿瘤微环境中mmps响应，程序性、持续性地在肿瘤组织中释放anti-fas抗体及小分子抗肿瘤药物，增强药物的肿瘤靶向性及抗肿瘤效果，集纳米载药可控缓释、被动靶向、主动靶向、酶响应性与免疫治疗-化学药物治疗联合等多种优势于一体的一种基质金属蛋白酶响应的共载化学抗肿瘤药物和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基质金属酶响应的anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤：

a.通过开环聚合法制备官能化的聚己内酯pcl-cooh和pcl-nh2；

b.制备甲氧基聚乙二醇肽链(mpeg–pep)，然后将步骤a中制得的官能化的聚己内酯(pcl-nh2)和mpeg-pep、二甲基氨基吡啶(dmap)、二氯乙烷(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合反应，透析，于透析袋中液体冻干,制得mpeg–pep-pcl；

c.将步骤a中制得的pcl-cooh和nhs、edc混合溶于dmf溶液中反应，随后纯水中透析，透析袋中液体冻干，制得pcl-nhs粉末；将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基溶于dmf溶液反应，随后混合液在透析袋中透析，透析袋中液体冻干，制得pcl-peg-cooh粉末；

d.采用纳米沉淀法制备包载小分子抗肿瘤药物的纳米粒,将步骤b制得mpeg–pep-pcl、步骤c制得pcl-peg-cooh和小分子抗肿瘤药物溶解在二氯甲烷(ch2cl2)中,然后将混合溶液逐滴加到纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌4-8分钟形成乳液；通过蒸发除去ch2cl2，制得包载小分子抗肿瘤药物的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型纳米粒子小分子抗肿瘤药物-loadednps；

e.将步骤d制得小分子抗肿瘤药物-loadednps粉末在ph4.5～5.5的n-吗啉乙磺酸溶液中，加入含0.1mol/ledc的mes溶液和含0.1mol/lnhs的mes溶液，活化智能型纳米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基；搅拌将活化后的纳米粒子悬浮液离心，收集纳米粒子；随后将纳米粒子在0.1mol/l磷酸盐缓冲液中重悬；洗去未参与反应的edc和nhs，最终将纳米粒子在1mlpbs溶液中重悬，加入anti-fas抗体反应40-50小时；离心除去未连接抗体，制得基质金属蛋白酶响应的共载小分子抗肿瘤药物和anti-fas抗体的智能型纳米载药体。

所述小分子抗肿瘤药物为蒽环类、生物碱类抗肿瘤药物。

具体的，所述小分子抗肿瘤药物可以为阿霉素、柔红霉素、长春新碱、喜树碱、紫杉醇等。

所述步骤a中,用亮氨酸为引发剂，将ε-己内酯单体、亮氨酸以摩尔比为100-120:1-1.2的比例加入聚合管中，通过开环聚合法制备pcl-cooh；将pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺中，加入乙二胺、二氯乙烷、n-羟基琥珀酰亚胺和二甲基氨基吡啶，反应制得pcl-nh2。

所述步骤b中,将甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺和肽链按摩尔比1.0-1.2:1.2-1.5溶于含有2.5-3.5％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃搅拌反应3-6小时，5500da透析袋中纯水中透析40-50小时，除去未反应的mpeg-nhs和肽链，所得溶液冻干，制得甲氧基聚乙二醇肽链mpeg–pep；将步骤a中pcl-nh2和mpeg-pep、dmap、edc、nhs按照摩尔比1.2:1:1:1:1混合反应制备mpeg–pep-pcl。

所述步骤c中,将nhs、edc和步骤a中制得pcl-cooh按照摩尔比1.2:1:1混合反应制备pcl-nhs粉末；将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基按照摩尔比为1-1.5:1-2反应制得pcl-peg-cooh粉末。

所述步骤d中，将步骤b制得mpeg–pep-pcl、步骤c制得pcl-peg-cooh和小分子抗肿瘤药物以质量比10:2:2溶解在溶剂中；然后将混合溶液逐滴加到20ml40℃纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌4-8分钟形成乳液；蒸发除去溶剂，制得包载小分子抗肿瘤药物的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型纳米粒子。

所述步骤e中，将步骤d制得小分子抗肿瘤药物-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph4.5～5.5的n-吗啉乙磺酸溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液，活化智能型纳米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基，反应温度为18-25℃，反应30-50分钟。

所述步骤a、b、c中pcl-nh2、mpeg–pep-pcl和pcl-peg-cooh的纯化均采用14000da透析袋，纯水透析40-50小时。

本发明还保护采用上述方法制备的基质金属蛋白酶响应的共载小分子抗肿瘤药物和anti-fas抗体的智能型纳米载药体。

本发明公开一种基质金属蛋白酶响应的共载化学抗肿瘤药物和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法，涉及一种共载抗肿瘤药物和模仿毒性t细胞功能激活fas-fasl凋亡通路协同促进肿瘤细胞凋亡(或实现免疫治疗-化学药物治疗联合)的智能型纳米载药体系的制备工艺。首先利用edc/nhs偶联试剂将官能化的聚己内酯(pcl-nh2)分别与甲氧基聚乙二醇肽链(mpeg-pep)、羧化氨基聚乙二醇(nh2-peg-cooh)反应生成mpeg-pep-pcl及peg-pcl-cooh，然后将纳米沉淀法合成的负载小分子抗肿瘤药物纳米粒子与mpeg-pep-pcl及peg-pcl-cooh溶解在二氯甲烷中，搅拌后逐滴加入40℃热水中，超声后室温下搅拌除去二氯甲烷制得基质金属蛋白酶响应的负载小分子抗肿瘤药物智能型纳米颗粒。通过edc/mes和nhs/mes溶液活化纳米粒子表面nh2-peg-cooh羧基后加入anti-fas抗体(fasl)，4℃反应48小时，分离纯化后即制成基质金属蛋白酶响应的共载小分子抗肿瘤药物和anti-fas抗体智能型纳米载药体系。

纳米载体主要具有以下优点：(1)具有较高的药物包载能力，能够包载的药物范围较广，可以是疏水性药物也可以是亲水性药物，并且无论单方药还是复方药均可包载；(2)通过修饰可形成亲水端，从而防止蛋白质的吸附，躲避网状内皮系统的捕捉；(3)粒径小且分布窄，易通过生理屏障，在体内具有独特的分布特征。纳米粒在体内的分布主要取决于粒径的大小和表面形态，与核内包裹的药物性质关系不大；(4)有缓释作用，能够延长药物的作用时间；(5)通过连接靶体，可主动达到靶向部位，如肿瘤组织等；(6)可在保证药效的前提下，减少给药剂量，从而减轻或避免毒副作用。功能化修饰的mmps纳米粒子大小约为100nm左右，作为一种纳米载体在药物的控释以及肿瘤靶向性等方面具有良好的应用价值。聚乙二醇和聚己内酯均具有良好的生物相容性、安全、无毒、低免疫原性、能最大程度的避免蛋白和细胞非特异性吸附，使其避免被内皮网状系统吞噬的最常用高分子聚合物。聚己内酯是一种疏水性很强的半结晶聚合物，结构重复单元上有个非极性亚甲基和一个极性酯基，有良好柔韧性和加工性，可通过开环反应与两亲性聚乙二醇之间插入一段基质金属膜反应的底物多肽。在血液循环中疏水性聚己内酯形成保护层防止内层物质与正常组织细胞接触，保持长循环的特征。在肿瘤微环境中，增强渗透效应的作用下，被动靶向到肿瘤组织附近，受肿瘤微环境中高表达基质金属酶的影响，使得聚己内酯与聚乙二醇之间多肽断裂，暴露出内层anti-fas抗体。anti-fas抗体与肿瘤细胞表面的fas相互识别，通过fas-fasl通路触发靶细胞内部的凋亡程序，同时聚乙二醇包载的小分子抗肿瘤药物通过细胞外持续释放及內吞入细胞发挥抗肿瘤作用，达到程序性、持续性地在肿瘤组织中释放anti-fas抗体及小分子抗肿瘤药物，增强药物的肿瘤靶向性，实现免疫治疗-化学药物治疗联合抗肿瘤作用。实验表明，聚己内酯和聚乙二醇修饰的基质金属蛋白酶响应的纳米颗粒具有良好的分散性和较好的晶体结构。anti-fas抗体通过与修饰后纳米颗粒上羧基连接，负载于纳米颗粒中层，使整个纳米载药体系成为类三明治结构：包含mmps响应性的长链peg外层，anti-fas抗体连接的中间层和包载小分子抗肿瘤药物的聚己内酯核。实验表明该类新型的基质金属蛋白酶响应的共载小分子抗肿瘤药物和anti-fas抗体智能型纳米载药体系具有较高的载药率和药物包封率，能够显著增强药物靶向性，增加肿瘤细胞内的药物浓度，联合激活fas-fasl通路增强抗肿瘤效果。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明以聚己内酯、聚乙二醇为主要材料，采用表面工程化技术修饰后的基质金属蛋白酶响应的有fasl生物功能的anti-fas单抗的智能免疫纳米载药体，可防止蛋白质的吸附，躲避内皮网状系统的吞噬，并且具有良好的分散性、较高的包封率和包载率。

2)本发明制备的新型智能型纳米载药体系利用用载体对肿瘤微环境中基质金属蛋白酶的响应、anti-fas抗体和肿瘤细胞的相互作用，显著增强肿瘤靶向性，提高药物的药效和利用率，降低对正常组织、细胞的损害，从而减轻毒副作用，提高化疗效果。

3)该纳米载药体系设计了一种具有三明治结构、表面修饰具有fasl生物功能的anti-fas单抗的智能免疫纳米药物，联合化学抗肿瘤药物，实现了纳米技术、免疫治疗、化学药物治疗的联合，极大增强了抗肿瘤效果。

4)该纳米载药体系具有缓释特征，能在较长时间内稳定维持化疗药物在病灶部位的浓度，延长化疗药物在细胞内的作用时间，增强抗肿瘤作用。

附图说明

图1：扫描电子显微镜对基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体智能型纳米载药体进行直观的表征。

图2：红外吸收光谱分析图a。

图3：红外吸收光谱分析图b。

图4：核磁共振波谱图a。

图5：核磁共振波谱图b。

图6：智能型纳米载药体和明胶酶反应后的透射电镜图像。

图7：基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体智能型纳米载药体的体外释放曲线。

图8：用纳米粒度及动电位测定仪测定基质金属蛋白酶响应的负载anti-fas抗体智能型纳米载药体的水合动力学半径。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体的智能型纳米载药体的制备：

(1)通过开环聚合法制备官能化的聚己内酯(pcl-nh2)。用亮氨酸(leu)为引发剂，将ε-己内酯(ε-cl)单体、亮氨酸以摩尔比为100-120:1-1.2的比例加入聚合管中，双排管抽真空、充高纯氮气三次，除去体系中的空气和水，按体积比1000:1加入无水甲苯配制浓度为0.1mmol/ml的甲苯辛酸亚锡溶液。减压除去溶解催化剂的溶剂甲苯。酒精喷灯真空封管，160℃油浴中反应24小时。反应结束后聚合管冷却至18-25℃，加入二氯甲烷(ch2cl2)完全溶解反应产物后冷乙醚沉淀，重复三次抽滤沉淀。25℃下真空干燥至恒重，制得白色固体pcl-cooh。将pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩尔量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反应18个小时，加入乙醇，中速滤纸过滤，重复3次，最后用去离子水冲洗滤渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)将甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺(mpeg-nhs)和肽链，按照摩尔比1.0-1.2:1.2-1.5溶于含有3％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃搅拌反应3-6小时，5500da透析袋中纯水中透析40-50小时，除去未反应的mpeg-nhs和肽链，所得溶液冻干，制得甲氧基聚乙二醇肽链(mpeg–pep)，1-8℃冰箱中备用。将mpeg-pep、步骤(1)中pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩尔比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18-25℃反应18-28小时，随后混合液在14000da透析袋中透析40-50小时，透析袋中液体冻干，制得mpeg–pep-pcl，4℃冰箱中储存备用。

(3)nhs、edc和步骤(1)中制得pcl-cooh按照摩尔比1.2:1:1混合，溶于dmf溶液中，18-25℃反应12小时，随后纯水中透析40-50小时，透析袋中液体冻干，制得pcl-nhs粉末，4℃冰箱储存备用。将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩尔比为1:1.2溶于dmf溶液，18-25℃反应18-28小时，随后混合液在14000da透析袋中透析40-50小时，透析袋中液体冻干，制得pcl-peg-cooh粉末，1-8℃冰箱中储存备用。

(4)采用纳米沉淀法制备包载阿霉素的纳米粒子。将10mg步骤(2)制得mpeg–pep-pcl、2mg步骤(3)制得pcl-peg-cooh和2mg阿霉素(dox)溶解在2mlch2cl2中。然后将混合溶液逐滴加到20ml40℃纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌4-8分钟形成乳液。通过蒸发除去ch2cl2，制得包载dox的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型纳米粒子(dox-loadednps)

(5)将步骤(4)制得dox-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝4.5-5.5n-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液活化智能型纳米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基。18-25℃搅拌30-50分钟，将活化后的纳米粒子悬浮液1-8℃12000r/min离心10分钟，收集纳米粒子。随后将纳米粒子在0.1mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)中重悬，通过悬浮-离心法3-5次，使用pbs溶液洗去未参与反应的edc和nhs，最终将纳米粒子在1mlpbs溶液中重悬，加入10μganti-fas抗体，1-8℃反应40-50小时。1-8℃15000r/min10分钟离心除去未连接抗体，制得基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体的智能型纳米载药体(dox-loadedanti-fasnps)。

以下结合附图1～8进行说明对实施例1所制备产物的检测：

图1是实施例扫描电子显微镜对基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体智能型纳米载药体进行直观的表征。其平均粒径为140nm左右，球形结构，表明该量子点具有良好的分散性和较好的晶体结构，可在内里具有长循环。图2、3是红外吸收光谱分析，图2中2850cm-1-3000cm-1处的峰代表-ch2-，1180cm-1代表羰基，聚己内酯的吸收峰和1650cm-1处的酰胺键说明成功地合成了mpeg-pep-pcl。图3中3321cm-1和1550cm-1处是胺的典型吸收峰，1652cm-1处的酰胺键吸收峰，说明peg被成功地修饰到了pcl-nhs上。图4、5是核磁共振波谱图，图中c、b、a和d是聚己内酯重复单元的峰，核磁谱图上没有其它核磁质子峰出现，证明得到了纯净的目标产物，图中可见各自的特征峰。图6是此智能型纳米载药体和明胶酶反应后的透射电镜图像，纳米粒子在明胶酶存在的环境下，表面修饰的peg从聚己内酯核上脱离，纳米粒子发生聚集，平均粒径大于500nm，说明对基质金属蛋白酶响应的智能型纳米载药体可在基质金属蛋白酶的作用下滞留在肿瘤周围。图7是基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体智能型纳米载药体的体外释放曲线，说明该纳米载药体系具有药物缓释功能，同时在明胶酶存在情况下，长链peg会从纳米粒子上脱离，使得包载在聚己内酯核中的阿霉素更容易扩散出来，具有酶响应性释放作用。图8是用纳米粒度及动电位测定仪测定基质金属蛋白酶响应的负载anti-fas抗体智能型纳米载药体的水合动力学半径。空白载药体其平均水合半径为140nm，包载阿霉素后载药体其平均水合半径为170nm。

实施例2

一种基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法：

(1)用亮氨酸为引发剂，将ε-己内酯单体、亮氨酸以摩尔比为100:1的比例加入聚合管中，通过开环聚合法制备官能化的聚己内酯(pcl-nh2)。

(2)将甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺和肽链，按照摩尔比1.0:1.2溶于含有3％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃搅拌反应4小时，5500da透析袋中纯水中透析48小时，制得甲氧基聚乙二醇肽链。将mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩尔比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18-25℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析48小时制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和pcl-cooh按照摩尔比1.2:1:1混合，25℃反应12小时，纯水中透析48小时，制得pcl-nhs粉末。将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基按照摩尔比为1:1.2溶于dmf溶液，25℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析48小时，制得pcl-peg-cooh。

(4)采用纳米沉淀法制备包载阿霉素(dox)的纳米粒子。将10mgmpeg–pep-pcl、2mgpcl-peg-cooh和2mg阿霉素溶解在2mlch2cl2中。然后将混合溶液逐滴加到20ml40℃纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌5分钟形成乳液。蒸发除去ch2cl2，制得包载dox的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型纳米粒子。

(5)将dox-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.0n-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。25℃搅拌40分钟，将活化后的纳米粒子悬浮液4℃12000r/min离心10分钟。pbs重悬，通过悬浮-离心法3次，洗去未参与反应的edc和nhs，最终将纳米粒子在1mlpbs溶液中重悬，加入10μganti-fas抗体，4℃反应48小时。4℃15000r/min10分钟离心除去未连接抗体，制得基质金属蛋白酶响应的共载阿霉素和anti-fas抗体的智能型纳米载药体。

实施例3

一种基质金属蛋白酶响应的共载喜树碱和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法：

(1)用亮氨酸(leu)为引发剂，将ε-己内酯(ε-cl)单体、亮氨酸以摩尔比为120:1.0的比例加入聚合管中，双排管抽真空、充高纯氮气三次，按体积比1000:1加入无水甲苯配制浓度为0.1mmol/ml的甲苯辛酸亚锡溶液。150℃油浴中反应24小时。反应结束后聚合管冷却至22℃，加入二氯甲烷完全溶解反应产物后冷乙醚沉淀，重复三次抽滤沉淀。制得pcl-cooh。将pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩尔量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反应18个小时，加入乙醇，中速滤纸过滤，重复3次，最后用去离子水冲洗滤渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)将甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺(mpeg-nhs)和肽链，按照摩尔比1.0:1.2溶于含有2.5％的三乙胺的dmf溶液中，22℃搅拌反应4小时，5500da透析袋中纯水中透析48小时，制得甲氧基聚乙二醇肽链(mpeg–pep)。将mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩尔比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中22℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析48小时，制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和pcl-cooh按照摩尔比1.2:1:1混合，22℃反应12小时，随后纯水中透析48小时，制得pcl-nhs粉末。将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩尔比为1:1.2溶于dmf溶液，22℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析50小时，制得pcl-peg-cooh。

(4)采用纳米沉淀法制备包载喜树碱的纳米粒子。将20mgmpeg–pep-pcl、4mgpcl-peg-cooh和4mg喜树碱溶解在4mlch2cl2中。然后将混合溶液逐滴加到20ml40℃纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌5分钟形成乳液。通过蒸发除去ch2cl2，制得包载喜树碱的智能型纳米粒子(cpt-loadednps)。

(5)将cpt-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.5n-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。22℃搅拌30分钟，将活化后的纳米粒子悬浮液4℃12000r/min离心10分钟。随后磷酸盐缓冲液(pbs)中重悬，通过悬浮-离心法5次，洗去未参与反应的edc和nhs，最终将纳米粒子在1mlpbs溶液中重悬，加入12μganti-fas抗体，4℃反应47小时。4℃15000r/min10分钟离心除去未连接抗体，制得基质金属蛋白酶响应的共载喜树碱和anti-fas抗体的智能型纳米载药体。

实施例4

一种基质金属蛋白酶响应的共载长春新碱和anti-fas抗体智能型纳米载药体系的制备方法：

(1)将ε-己内酯(ε-cl)单体、亮氨酸以摩尔比为110:1的比例加入聚合管中，双排管抽真空、充高纯氮气三次，除去体系中的空气和水，按体积比1000:1加入无水甲苯配制浓度为0.1mmol/ml的甲苯辛酸亚锡溶液。酒精喷灯真空封管，170℃油浴中反应24小时。反应结束后聚合管冷却至25℃，加入二氯甲烷(ch2cl2)完全溶解反应产物后冷乙醚沉淀，重复三次抽滤沉淀制得pcl-cooh。将pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩尔量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反应20个小时，加入乙醇，中速滤纸过滤，重复3次，最后用去离子水冲洗滤渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)将甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺(mpeg-nhs)和肽链，按照摩尔比1.0:1.5溶于含有3.5％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃搅拌反应4小时，5500da透析袋中纯水中透析48小时，除去未反应的mpeg-nhs和肽链，制得甲氧基聚乙二醇肽链(mpeg–pep)。将mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩尔比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析50小时，透析袋中液体冻干，制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和步骤(1)中制得pcl-cooh按照摩尔比1.2:1:1混合，溶于dmf溶液中，20℃反应12小时，随后纯水中透析48小时，透析袋中液体冻干，制得pcl-nhs粉末。将pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩尔比为1.1:1.2溶于dmf溶液，20℃反应24小时，随后混合液在14000da透析袋中透析48小时，制得pcl-peg-cooh粉末。

(4)采用纳米沉淀法制备包载长春新碱(vcr)的纳米粒子。将5mgmpeg–pep-pcl、1mgpcl-peg-cooh和1mg长春新碱溶解在2mlch2cl2中。然后将混合溶液逐滴加到20ml40℃纯水中，随后将混合溶液超声、搅拌5分钟形成乳液。蒸发除去ch2cl2，制得包载长春新碱的智能型纳米粒子(vcr-loadednps)。

(5)将vcr-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.0n-吗啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。20℃搅拌30分钟，将活化后的纳米粒子悬浮液4℃12000r/min离心10分钟，收集纳米粒子。将纳米粒子磷酸盐缓冲液(pbs)中重悬，通过悬浮-离心法3次洗去未参与反应的edc和nhs，将纳米粒子在1mlpbs溶液中重悬，加入10μganti-fas抗体，4℃反应50小时。4℃15000r/min10分钟离心除去未连接抗体，制得基质金属蛋白酶响应的共载长春新碱和anti-fas抗体的智能型纳米载药体。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。