锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用。

背景技术：

随着世界范围内日益增高的糖尿病患病率，其眼部并发症成为主要致盲原因之一，同时糖尿病患者极易发生眼部各个部位的病变，其中包括角膜病变。有研究表明：47％-64％的糖尿病患者可能会出现原发性角膜病变，其临床特征主要表现为角膜敏感度下降、上皮愈合延迟、神经营养性角膜溃疡等症状。糖尿病患者在进行白内障或视网膜手术后可能出现角膜上皮再生延迟，甚至出现反复剥脱现象。此外，角膜损伤修复延迟有可能导致各种威胁视力的并发症如基质浑浊、表层不规则、细菌性角膜炎等，因此加速角膜损伤修复将降低这些威胁视力并发症的发生率。

角膜上皮损伤后的愈合过程非常复杂，有许多因素参与调节：①源于基底细胞及角膜缘干细胞的不断增殖、分化的上皮细胞的自我更新对上皮细胞损伤后的迅速再上皮化、重建上皮屏障，从而保持角膜的结构完整及正常功能；②许多生长因子如egf、kgf、hgf、tgf、pdgf等通过自分泌和/或旁分泌途径参与调节角膜上皮细胞的增殖及迁移，维持角膜结构和功能的正常；③位于细胞表面的细胞粘附分子(如整合素)以受体-配体的形式发挥作用，在角膜创伤愈合中起重要作用。另外，其他一些因素如氧化损伤因素等也参与调节角膜上皮细胞的屏障功能及创伤愈合。

迄今为止，尽管自体血清、局部应用胰岛素、纳曲酮(阿片类生长因子受体的相关配体)、基因治疗等治疗方法能够修复糖尿病性角膜损伤，但是上述方法治疗周期长、见效慢、疗效差，不能满足人们的需求。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用，锰苯甲酸卟啉能够迅速完整地修复角膜上皮细胞，恢复角膜上皮细胞的屏障功能、促进创伤愈合、保持良好视力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用。

优选的，所述角膜损伤为角膜上皮细胞损伤。

优选的，药物的剂型包括注射剂。

优选的，所述注射剂包括锰苯甲酸卟啉和注射剂可接受的辅料。

优选的，所述注射剂中锰苯甲酸卟啉的摩尔浓度为90～110μmol/l。

优选的，所述注射剂中锰苯甲酸卟啉的摩尔浓度为100μmol/l。

优选的，所述辅料包括质量浓度为0.9％氯化钠溶液。

优选的，所述注射剂用法为7μl/眼，注射时间为每三天一次。

本发明提供了锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用。本发明中，锰苯甲酸卟啉通过发挥抗氧化自由基功能来免除氧化损伤对线粒体dna的损伤，从而起到修复糖尿病性角膜损伤的作用。实验证明锰苯甲酸卟啉(mntbap)能够有效地抑制高糖组tke2细胞ros水平，并且能够有效改善高糖诱导的tke2细胞线粒体功能紊乱。在stz诱导的糖尿病小鼠中，建立角膜上皮刮除损伤模型后，结膜下注射一定剂量的mntbap(例如50mmol/l的试剂7μl，小鼠体重为25g)，能够有效地抑制小鼠角膜上皮ros的聚集并抑制8-ohdg表达，同时能提高糖尿病小鼠角膜上皮抗氧化剂和自由基清除剂gsh水平，并促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复。

附图说明

图1为实施例1中tke2细胞高糖诱导模型中添加mntbap对ros水平及线粒体膜电位的影响；

图2为实施例1中tke2细胞高糖诱导模型与tke2细胞中8-ohdg表达水平；

图3为实施例2中正常c57小鼠和糖尿病小鼠角膜上皮刮除损伤后角膜上皮愈合速度比较照片；

图4为实施例2中c57正常小鼠和糖尿病小鼠中角膜上皮8-ohdg表达的免疫荧光图片；

图5为实施例3中糖尿病小鼠角膜上皮刮除损伤模型中注射mntbap对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响情况；

图6为实施例4中mntbap对stz诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤后氧化损伤程度的影响。

具体实施方式

本发明提供了锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用。

本发明中，所述角膜损伤优选为角膜上皮细胞损伤。

本发明中，药物的剂型优选包括注射剂。

本发明中，所述注射剂优选包括锰苯甲酸卟啉和注射剂可接受的辅料。

本发明中，所述注射剂中锰苯甲酸卟啉的摩尔浓度优选为90～110μmol/l更优选为100μmol/l。

本发明中，所述辅料包括质量浓度优选为0.9％氯化钠溶液。

本发明中，所述注射剂用法为7μl/眼，注射时间为三天一次。

本发明中，所述促进糖尿病性角膜损伤修复的药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的药物制备方法即可。所述锰苯甲酸卟啉的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的锰苯甲酸卟啉即可。

下面结合实施例对本发明提供的锰苯甲酸卟啉在制备促进糖尿病性角膜损伤修复的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

用ksfm培养液(购自invitrogen，美国)常规培养tke2细胞，将1×10⁵个细胞接种至六孔板中，选择一孔作为对照，一孔加入1mol/l的甘露醇30μl/ml细胞液作为渗透压对照组，其余2个孔加入1mol/l的葡萄糖30μl/ml细胞液，并在其中一组葡萄糖处理孔内同时加入50mmol/l的mntbap2μl/ml细胞液，使mntbap的终浓度为100μm，然后于5％co2和37℃的条件下培养，3天后收集50000个细胞并用含5μm荧光探针dchf-da(购自molecularprobes，美国)的培养液37℃孵育细胞20min，而后用酶标仪(型号为spectramaxm2，moleculardevices，美国)测量荧光强度即ros水平。

同样处理的一批细胞用jc-1试剂盒(购自碧云天，中国)结合流式细胞术检测jc-1单体细胞数，考察线粒体受损细胞比例。具体方法如下：收集100000个细胞重悬于0.5ml培养液，加入0.5mljc-1染色液，37℃孵育20min，而后用试剂盒提供的缓冲液洗涤细胞两次，缓冲液重悬细胞用后流式细胞仪(购自bd，美国)检测jc-1单体的表达情况。

测量荧光强度即ros水平的实验结果绘制柱状图图1，图1表明添加100μm的mntbap能抑制高糖诱导的tke2细胞ros的聚集，同时抑制线粒体功能受损。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志事件，是线粒体功能受损的检测指标。当细胞处于健康状态时线粒体膜电位较高，jc-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当细胞凋亡时线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体的基质中，此时jc-1为单体，产生绿色荧光。如图2所示，高糖诱导的tke2细胞线粒体氧化损伤的标志物8-ohdg含量显著高于对照组细胞。

实施例2

链脲佐菌素(stz，购自sigma，美国)诱导的糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复及8-ohdg表达情况。

将6只stz诱导的成年c57bl/6糖尿病鼠和年龄相仿对照鼠(c57bl/6正常小鼠)分别用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，于建模后24、48和72h分别滴加0.25％荧光素钠于角膜，并在裂隙灯下观察照相。

结果如图3所示，上皮缺损区域荧光素钠着染呈绿色，正常小鼠角膜上皮在损伤后72h已经愈合，而糖尿病小鼠角膜上皮未愈合，这说明在正常c57小鼠和stz诱导的糖尿病小鼠中，建立角膜上皮刮除损伤模型后，糖尿病小鼠角膜上皮愈合速度显著低于正常c57小鼠。

将上述各时间点小鼠眼球置于冷冻包埋剂oct中制作冰冻样本，用冰冻切片机制作8μm厚度冰冻切片，并用免疫荧光的方法检测8-ohdg表达情况，具体的，将冰冻切片用冰甲醇固定10分钟，pbs缓冲液清洗后用5％bsa封闭液封闭以减少背景染色，而后用羊抗8-ohdg抗体(购自abcam，美国)4度孵育过夜，pbs清洗后用驴抗羊-fitc(购自life，美国)室温孵育1小时，而后于荧光显微镜下观察8-ohdg结果。

8-ohdg表达情况如图4，不同于c57小鼠角膜上皮8-ohdg的瞬时表达，糖尿病小鼠角膜上皮8-ohdg表达强阳性且持续时间长。

实施例3

mntbap对stz诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响

将12只stz诱导的c57bl/6糖尿病小鼠随机分为对照组(糖尿病鼠)和治疗组(糖尿病鼠+锰苯甲酸卟啉)，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，治疗组小鼠右眼结膜下注射的50mmol/l的mntbap7μl(小鼠体重为25g)，对照组小鼠右眼结膜下注射7μlpbs，于建模后24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况。

各组小鼠的上皮损伤修复的情况如图5所示，荧光素钠着色区为上皮缺损区，可见结膜下注射mntbap能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。

实施例4

mntbap对stz诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤后氧化损伤程度的影响。

取stz诱导的c57bl/6糖尿病小鼠经实施例2第2步处理后72h的小鼠眼球，置于oct中制作冰冻样本。用冰冻切片机制作8μm厚度冰冻切片，冰冻切片用10μm荧光染料dchf-da37度染色30分钟检测ros聚集情况，用50μm荧光染料monochlorobimane(购自sigma，美国)37℃染色30分钟检测抗氧化剂和自由基清除剂gsh的表达，通过免疫荧光方法检测mntbap对线粒体氧化损伤的标志物8-ohdg的影响。

如图6所示，中间空心的地方是细胞核，细胞核外面着色的地方是细胞质，ros、gsh、8-ohdg都在细胞质中表达，越亮表达强度越高，越暗表达强度越弱。荧光显微镜观察发现mntbap显著降低了糖尿病小鼠角膜上皮ros聚集，并且能够上调角膜上皮gsh的表达，同时mntbap能明显降低糖尿病小鼠角膜上皮损伤部位8-ohdg的表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。