本发明属于复合生物材料制备领域，具体涉及一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法。
背景技术：
近年来，具有增殖和分化潜能的干细胞己经成为皮肤组织工程中好的种子细胞。胚胎干细胞在皮肤组织工程中应用研究，为构建组织工程皮肤在皮肤损伤修复的应用提供了理论依据。但是胚胎干细胞在医学应用上存在道德伦理问题和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潜能的多能干细胞一一间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)作为良好的种子细胞，在皮肤组织工程研究中倍受关注。以往的研究主要是集中于骨髓来源的bmscs但bmscs需要通过骨髓穿刺而获得，且数量随年龄增长而下降，这都限制了bmscs的应用，且支架材料的选择和应用一直影响该技术发展的重要难题。
技术实现要素：
根据现有技术中存在问题，本发明采用新生儿娩后“废弃物”的胎盘组织获取cmscs，并选用丝素蛋白作为支架材料，制得胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料。
本发明采用以下技术方案：
一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用pbs冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的iv型胶原酶的低糖基础培养基(l-dmem)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；
步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lomin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)；
步骤三：将2l去离子水烧热至沸腾，加入4g碳酸钠及5g家蚕生丝，煮沸30min后，用去离子水清洗干净并烘干，再用9.3mol/l的libr溶液溶解蚕丝，溶解浓度20wt％，待完全溶解后将溶液装入透析袋，去离子水透析72h，9000r/min离心20min，重复两次，得丝素蛋白溶液；
步骤四：将丝素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然风干后获得丝素蛋白膜；
步骤五：将丝素蛋白膜溶于质量浓度98％甲酸中，然后装入注射器中进行静电纺丝，纺丝针头内径0.9mm，调整纺丝电压在10-15kv，距离在8-15cm，速度为0.1-o.5m/h，获得丝素蛋白纳米纤维膜；
步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)接种于丝素蛋白纳米纤维膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料。
优选的，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2。
优选的，步骤一中所述的pbs中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。
优选的，所述的步骤五还包括：将丝素蛋白纳米纤维膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射co60辐射消毒。
优选的，所述的丝素蛋白溶液中添加有质量浓度20％的丝素蛋白纳米纤维溶液。
优选的，所述的丝素蛋白纳米纤维溶液采用以下方法制备：取丝素蛋白溶液置于60℃恒温箱内浓缩至原体积的一半，再转入通风橱内浓缩至质量分数为20-30％的浓缩液，将浓缩液放入4℃冰箱储存2d后将浓缩液加水稀释到质量分数为0.5％，充分均匀搅拌后放入恒温箱内孵育至形成半透明凝胶状的丝素蛋白纳米纤维溶液。
本发明的有益效果在于：
1)胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)具有较强的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社会伦理等问题的优势，其作为种子细胞在皮肤组织工程中具有极大的运用前景。
2)丝素蛋白生物相容性良好，降解速度缓慢、且降解产物对组织具有低免疫原性，对皮肤、牙周等组织有营养和修复能力，丝素蛋白作为支架材料，为细胞生长、代谢提供场所，为形成新组织提供适宜的环境，此外还能调控和诱导的分化，形成新的具有功能性的组织和器官。
3)本发明制得的敷料，可以加快皮肤修复，具有优良的组织修复的功效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2，过质量浓度75％的酒精，再用含有质量浓度0.1％的青-链霉素的pbs冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的iv型胶原酶的低糖基础培养基(l-dmem)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；
步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lomin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)；
步骤三：将2l去离子水烧热至沸腾，加入4g碳酸钠及5g家蚕生丝，煮沸30min后，用去离子水清洗干净并烘干，再用9.3mol/l的libr溶液溶解蚕丝，溶解浓度20wt％，待完全溶解后将溶液装入透析袋，去离子水透析72h，9000r/min离心20min，重复两次，得丝素蛋白溶液，向丝素蛋白溶液中添加有质量浓度20％的丝素蛋白纳米纤维溶液；
所述的丝素蛋白纳米纤维溶液采用以下方法制备：取丝素蛋白溶液置于60℃恒温箱内浓缩至原体积的一半，再转入通风橱内浓缩至质量分数为20-30％的浓缩液，将浓缩液放入4℃冰箱储存2d后将浓缩液加水稀释到质量分数为0.5％，充分均匀搅拌后放入恒温箱内孵育至形成半透明凝胶状的丝素蛋白纳米纤维溶液；
步骤四：将丝素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然风干后获得丝素蛋白膜；
步骤五：将丝素蛋白膜溶于质量浓度98％甲酸中，然后装入注射器中进行静电纺丝，纺丝针头内径0.9mm，调整纺丝电压在10-15kv，距离在8-15cm，速度为0.1-o.5m/h，获得丝素蛋白纳米纤维膜，将丝素蛋白纳米纤维膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射co60辐射消毒；
步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)接种于消毒后的丝素蛋白纳米纤维膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料。
取200g左右sd大鼠12只，将sd大鼠麻醉后造模处理，背部剃毛消毒灭菌后，剪开5cm直径大小圆形皮肤缺损创面，将实施例制得的胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料植入其中，得实验组；空白对照组在相同创面处，覆盖凡士林纱布。于术后每天观察创面情况，并于30天后进行组织切片he染色，将实验组、空白组进行比较。
实验结果显示，与未加入任何材料的空白对照组相比，本发明制得的胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料能够更好更快的修复大鼠皮肤损伤。手术5天后，实验组大鼠背部创面伤口缝线处己经愈合，创面干燥，无分泌物。lod后，实验组大鼠的创面基本愈合，创口伴有鲜红色的肉芽组织生成，空白对照组创面可见大量脓性分泌物。30天后，实验组的大鼠创面面积缩小，创面完全愈合，创面处己生长毛发，与周围皮肤几乎融为一体；空白对照组创面结痴，暗红色血块，皮肤未修复完成。