CD44‑shRNA/PEG‑MZF‑NPs复合物及其制备方法与流程

本发明属于医学及基因工程技术领域，具体涉及一种cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

卵巢癌是女性生殖系统中最常见的肿瘤之一，恶性程度很高，死亡率占妇科肿瘤的首位。由于卵巢癌在早期症状往往不明显，不易早期发现，超过70％的患者就诊时已为中晚期，5年生存率仅为25％。目前对卵巢癌的早期诊断尚缺乏特异有效的方法或手段。卵巢癌的治疗目前主要以手术治疗后辅以化疗，但是常规化疗副作用较大，且手术后复发率和转移率较高。因此，探索卵巢癌新型高效的早期诊断手段和治疗方法意义重大。将多种手段有机结合对卵巢癌进行联合靶向诊疗已成为重要的研究方向。基因治疗已成为继肿瘤传统手术、放疗、化疗后又一种新的治疗手段，在肿瘤治疗领域显示了较好的应用前景。肿瘤热疗是通过热能杀死肿瘤细胞，不仅可以独立应用，还可以增强放化疗的敏感性。随着纳米技术的发展，将纳米技术应用于肿瘤的治疗也日益受到关注。若能以磁性纳米材料为载体，将基因治疗与热疗有机结合，互补协同，有可能形成一种新的肿瘤联合治疗方法。

粘附分子cd44是细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，作为一种重要的透明质酸受体(ha)，与细胞粘附、增殖、分化和迁移有关。cd44的异常表达在肿瘤的发生、发展、转移以及预后的评估中扮演着重要角色，尤其是卵巢癌组织，cd44表达率高达96.92％。研究表明：cd44表达高的卵巢癌患者，其临床表现较重且tnm分期亦较高。高水平的cd44表达与卵巢癌患者的预后不良有关。cd44可作为卵巢癌患者病理诊断和预后预测的有效指标。因此，cd44有可能成为治疗卵巢癌的新靶点。

基因治疗是将外源性基因或者基因片段转运至靶细胞中，对靶基因进行干预的治疗方法。目前基因治疗方法被相继运用于多种肿瘤治疗研究中，其中rnai(rnainterferencerna干扰)技术在肿瘤治疗领域显示了较好的应用前景，该技术是利用双链rna在细胞内dicer内切酶的识别、结合、酶切下产生有活性的长度为21-23bp的小干扰rna(sirna)高效特异性地降解细胞内同源mrna，阻断目标基因，从而产生基因沉默效应，抑制目标基因活性。采用rnai进行卵巢癌靶向治疗，获得了较好的治疗效果。

高效、稳定地进行基因转移是进行基因治疗的关键。伴随着纳米技术的发展，以纳米颗粒为基因转移载体得到广泛研究。纳米颗粒较易被修饰，具有良好的生物相容性和较少的免疫应答，很容易进入组织与细胞表面特异性受体结合，或者被靶细胞吞噬进入细胞内，实现基因的转运，并在细胞内释放，具有较高的基因转移效率。因此，纳米载体成为极具应用前景的新型载体系统。

磁性纳米颗粒作为纳米材料的一种，除了具有一般纳米载体的功能外，由于其具有特殊的磁学性质，可被应用于磁共振成像。磁性纳米材料在外加磁场的作用下产生和周围组织不同的磁场敏感性，使t1和t2磁共振成像的弛豫时间发生变化。磁性纳米颗粒在交变磁场的作用下能够产生热效应，热能不仅能增加化疗药物的功能，还可以对肿瘤细胞进行靶向热疗。其中金属氧化物颗粒fe3o4是应用较多的磁性纳米粒子。在纳米氧化铁结构中加入锰、锌等金属元素可以制备成各种铁氧体，其中mn0.6zn0.4fe2o4不仅具有载体、热疗的功能，还具有自动控温和恒温的特征。

基于卵巢癌cd44基因高表达的特性，以及磁性纳米粒靶向基因治疗、单纯磁流体热疗在肿瘤治疗研究方面都显示了良好的效果，前景广泛，但作用仍显单一，在肿瘤联合治疗原则的指导下，本研究设想：以mn0.6zn0.4fe2o4纳米粒作为基因转移载体，利用其优良的磁响应性和有效升温控温的效果，将cd44-shrna基因治疗磁流体热疗有机结合，优势互补，有可能形成一种联合靶向诊疗卵巢癌的新方法。

技术实现要素：

为了解决现有基因治疗存在的问题，本发明提供一种以peg修饰的mn0.6zn0.4fe2o4纳米粒(peg-mzf-nps)为载体的携载cd44-shrna抗肿瘤基因的复合物及其制备方法，该复合物在外加磁场作用下，可以将cd44-shrna基因治疗与磁流体热疗有机结合，优势互补，对肿瘤进行靶向治疗，有效解决了现有技术的问题。

一种cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物,是以peg-mzf-nps纳米磁粒为载体，负载质粒cd44-shrna。

本发明还公开了所述cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物的制备方法，包括以下步骤：

分别用无血清培养基稀释peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒，室温放置5分钟以上，然后将二者混合混匀，室温放置30分钟以上，反应物即为cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物。

进一步地，peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒质量比优选40:1。

本发明中为探讨能否用peg-mzf-nps作为cd44-shrna基因转移载体，将cd44-shrna转染至肿瘤细胞，检测了peg-mzf-nps与cd44-shrna结合的生物学特性。琼脂糖凝胶电泳图谱显示：当纳米磁粒(peg-mzf-nps)与cd44-shrna质粒的质量比为40:1时，peg-mzf-nps可以结合体系中的所有质粒，该比例为最佳结合比，为后面的基因转染时载体与质粒量的配比提供了依据。

细胞外的核酸酶和细胞内溶酶能够降解外源性dna。安全、高效、可控的基因转移方法是进行基因治疗的关键。本实验采用dnase-i消化实验来观察磁性纳米基因复合体的稳定性。结果显示：时间在1-60min内的peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒复合物，其电泳图谱中的条带亮度没有明显改变，保持稳定，裸露的cd44-shrna质粒加入dnase-i消化后，约1min后几乎完全消化，表明复合物稳定性较好，peg-mzf-nps可以保护cd44-shrna免受核酸酶的消化。

基因治疗中，基因转移载体的选择至关重要，作为基因载体，不仅要具有较好的组织相容性，在运输过程中能够保护基因片段不被降解，到达靶细胞后还能够有效地释放。在本次纳米磁粒(peg-mzf-nps)与cd44-shrna质粒复合物的体外释放实验中显示，在1h、4h、8h、12h、24h、2d内，dna释放量增多，第3、第4天无明显区别，表明peg-mzf-nps不仅能够保护质粒免于降解，在适当的条件下还能有效地释放dna。

以peg-mzf-nps为载体将cd44-shrna质粒转染至卵巢癌细胞后，cd44基因表达明显下降，其转染效率为55.46±4.50％，提示peg-mzf-nps可以作为基因转移载体应用于基因治疗。

本次实验用不同方法对卵巢癌ho8910细胞进行干预，实验分为三组,分别为：阴性对照组；mfh组；cd44-shrna/mfh组，分别计算各组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率。结果显示cd44-shrna/mfh组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于mfh组。表明磁热疗和cd44-shrna基因治疗二者联合能够有效地抑制卵巢癌细胞增殖,并诱导其凋亡，效果明显优于单一磁流体热疗。

本发明采用的peg-mzf-nps(mn0.6zn0.4fe2o4)磁性纳米材料体外磁感应升温实验中，在外加235khz、4kw、35a的高频交变磁场条件下，不同浓度的peg-mzf-nps均能迅速升温，0～20min升温急剧，20～60min内升温平缓，并保持一定的恒温，说明该材料有良好的升温恒温能力。其中浓度为60μg/ml的peg-mzf-nps在20min内达到42℃～43℃，该温度为肿瘤热疗的理想温度，提示peg-mzf-nps可用于肿瘤的热疗研究；体外磁共振扫描显示其具有作为磁共振t2弛豫造影剂的应用潜能，有可能实现靶向诊断与治疗一体化的目标。

peg-mzf-nps与cd44-shrna结合，具有良好的生物学特性，peg-mzf-nps可以保护dna免受核酸酶的消化，并能在恰当的条件下有效地释放dna。细胞转染实验证实，peg-mzf-nps将cd44-shrna成功转染至卵巢癌细胞，并有效地抑制了cd44基因的表达，显示了peg-mzf-nps可作为基因转移载体的可行性。

在外加交变磁场作用下，cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物对卵巢癌细胞有较好的增殖抑制和凋亡诱导作用，效果明显优于单一的磁流体热疗。

附图说明

图1为peg-mzf-nps在交变磁场中升温曲线图

图2peg-mzf-nps的体外mri成像

图3不同浓度的peg-mzf-nps的t2横向弛豫时间r2

图4为不同质量比的peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒结合后的电泳图谱；

泳道1：0:1(即100ng质粒dna，未加peg-mzf-nps)；泳道2：5:1；泳道3：10:1；泳道4：20:1；泳道5：40:1；泳道6：80:1；marker：(takara，dl5000，从上至下标准带依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图5为peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒复合物的消化保护实验电泳图谱

泳道1：100ng原始质粒dnalane；泳道2：1小时；泳道3：4小时；泳道4：8小时；泳道5：12小时；泳道6：24小时；泳道7：48小时；泳道8：72小时；泳道8：96小时mark：dnamarker(takara，dl5000，从上至下标准带依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)

图6为peg-mzf-nps磁性纳米材料与cd44-shrna质粒复合物的释放实验电泳图谱

lane1：100ng原始质粒dna、lane2：复合物1分钟、lane3：复合物10分钟、lane4：复合物30分钟、lane5：复合物45分钟、lane6：复合物1小时

图7卵巢癌8910细胞转染cd44-shrna质粒后cd44基因mrna的表达

图8卵巢癌8910细胞转染cd44-shrna质粒后cd44蛋白的表达

具体实施方式

为了理好地理解本发明，下面结合附图、具体材料对本发明进一步说明，不应理解为对本发明的具体限定。本发明中所采用的材料如下：

cd44-shrna购于碧云天生物

cd44-shrna-egfp购于碧云天生物

纳米材料：peg-mzf-nps购于南京东纳生物科技有限公司。

实施例：

1.1peg-mzf-nps在交变磁场中的升温实验

配制浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的peg-mzf-nps磁流体，分别取500μl置于平底试管中，将温度计直接插入试管中(避免接触到试管壁)，启动交变磁场，参数设置为235khz、4kw、35a，磁感应线圈直径为3cm，试管底部距磁感应线圈约0.5cm，每隔5min记录一次温度，以时间为横坐标，温度为纵坐标，绘制peg-mzf-nps磁性纳米材料的升温曲线。peg-mzf-nps在交变磁场中的升温特性见图1，60μg/ml的磁流体在20min内能升温至43℃左右，并保持稳定，可用于肿瘤的热疗。

1.2peg-mzf-nps的体外磁共振成像(mri)研究

将浓度为0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml的peg-mzf-nps置于含1％琼脂糖的ependoff管中，对照组为加入去离子水的琼脂糖。采用7.0tmicro-mr扫描仪，内径3.0cm的体线圈，set2w1序列，参数设置如下：重复时间tr2500ms，回波时间te36ms，层厚1.0mm，fov4cmx3.5cm，矩阵256×256。读取各样本相应的t2值，之后在origin下作r2曲线(r2＝1/t2)，由此得出各浓度样品的r2弛豫率。

从磁共振成像(图2)上可以观察到，随着peg-mzf-nps浓度增加，其t2w1信号明显降低，测量出各浓度材料的t2值，由此得出peg-mzf-nps材料的弛豫率r2＝6.06(μg/ml^-1s^-1)，见图3,提示peg-mzf-nps具有作为磁共振t2弛豫造影剂的应用潜能。

1.3peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒结合实验

将peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒按照质量比0:1、5:1、10:1、20:1、40:1、80:1进行混合(质粒dna的终浓度为20ng/μl，用超纯水补足总体积20μl)，室温放置30分钟，以充分反应形成复合物。分别取5μl复合物进行琼脂糖凝胶电泳(即100ng/泳道)，查看结合情况，并筛选出纳米磁粒与质粒dna的最佳结合比例。

纳米磁粒(peg-mzf-nps)与cd44-shrna质粒结合实验的琼脂糖凝胶电泳图谱显示，按0:1、5:1、10:1、20:1、40:1加入质粒，泳道可见清晰的条带；从电泳图可见，当纳米磁粒与cd44-shrna的质量比为40:1时，基本可以结合体系中所有的质粒，提示质量比为40:1是纳米磁粒与cd44-shrna结合的最佳比例，见图4。

1.4peg-mzf-nps对cd44-shrna质粒的dnase-i消化保护实验

将peg-mzf-nps与质粒cd44-shrna按照质量比40:1混合形成复合物，加入tangobuffer(thermo)及dnase-i酶，37℃水浴，分别消化1分钟、10分钟、30分钟、45分钟、1小时，迅速用等体积的100mmol/l的edta溶液终止反应。用sds将复合物中的质粒洗脱下来，苯酚、氯仿抽提、无水乙醇沉淀、75％的乙醇洗涤干燥后，溶于适量的超纯水中，取等体积的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。裸露的质粒dna同样方法处理，作为对照。

经dnase-i酶消化1-60min的peg-mzf-nps与cd44-shrna复合物，其电泳图谱中的条带亮度没有明显改变，保持稳定；裸露的cd44-shrna质粒加入dnase-i酶消化后，约1min后几乎完全消化，泳道上已经看不到条带，提示peg-mzf-nps可以有效保护该质粒免受dnase-i酶的消化，见图5。

1.5peg-mzf-nps/cd44-shrna的dna释放实验

将磁性纳米材料peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒按照质量比40:1混合形成复合物，质粒的量(10μg)用te溶液混至500ul，至37℃恒温摇床200rpm振荡。分别于1小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取样8μl，最终各5μl/孔进行琼脂糖凝胶电泳。

结果显示，在1h、4h、8h、12h、24h、2d内，dna释放量增多，第3天、第4天无明显区别，peg-mzf-nps不仅能够保护质粒免于降解，而且在适当的条件下能有效地释放dna，见图6。

1.6cd44-shrna质粒经peg-mzf-nps转染卵巢癌ho8910细胞后cd44基因表达的检测

1.6.1peg-mzf-nps转染法将cd44-shrna-egfp质粒转染至ho8910细胞。

peg-mzf-nps转染：转染前一天，将细胞用含10％fbs无抗生素的培养液，按照(1-4)×10⁵/孔密度接种于孔板中，以保证转染时细胞密度达80％左右；转染时，将同样量的表达质粒(cd44-shrna)和空载psilencer3.1-h1neo质粒稀释于100μl无抗生素无血清的培养液中；将peg-mzf-nps稀释于100μl无抗生素无血清的培养液中，室温静置20min；将稀释后的cd44-shrna-egfp和peg-mzf-nps混合(peg-mzf-nps和dna质量比为40:1)，室温静置30min，使之形成cd44-shrna-egfp/peg-mzf-nps复合物。其间，将待转染的细胞培养液换成新鲜的含10％fbs无抗生素培养液，400μl/孔；每孔加入cd44-shrna-egfp/peg-mzf-nps复合物200μl；充分混匀后，置于细胞培养箱中继续6h之后，弃上清，用pbs洗细胞1次，加入新鲜含10％fbs的培养液继续培养。

流式细胞仪检测peg-mzf-nps的转染效率。结果显示，peg-mzf-nps转染法将cd44-shrna-egfp质粒转染至卵巢癌细胞的转染效率为(55.46±4.50)％，证实了peg-mzf-nps作为基因转移载体的可行性

1.6.2cd44-shrna干预ho8910细胞后cd44基因表达检测

卵巢癌ho8910细胞中经peg-mzf-nps转染空载质粒和cd44-shrna质粒24h后，real-timepcr方法检测显示转染cd44-shrna质粒后，能有效抑制ho8910细胞中cd44的mrna的表达水平(图7)。westernblot方法检测显示cd44-shrna干预治疗后，ho8910细胞中cd44的蛋白表达水平显著降低(图8)，进一步证实了peg-mzf-nps能将cd44-shrna转移到卵巢癌细胞，并抑制cd44基因的表达。

2.peg-mzf-nps/cd44-shrna复合物的制备

分别用无血清培养基稀释peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒，室温放置5分钟以上，然后将二者混合混匀(peg-mzf-nps与cd44-shrna质粒质量比40:1)，室温放置30分钟以上，反应物即为cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物。

2.1cd44-shrna/peg-mzf-nps纳米脂质体对ho8910细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

将ho8910细胞接种于含10％胎牛血清的imem培养液中，置于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱中培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞实验。实验分组：a组为阴性对照组；b组为mfh组；c组为cd44-shrna/mfh组。a组加入生理盐水，b组加入peg-mzf-nps磁流体；c组加入peg-mzf-nps/cd44-shrna(质量比40:1)复合物；mfh组(b、c组)细胞放入spg-10a-ii高频磁感应加热仪平板线圈上加热1h，阴性对照组(a组)室温放置1h，然后将各组细胞在培养箱中继续培养48h，mtt方法检测各组细胞增殖的抑制率，细胞增殖抑制率＝(1-实验组od值/对照组od值)×100，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

结果显示，cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物磁感应加热组(cd44-shrna/mfh组)细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于单纯的磁流体热疗组(见表1和表2)，显示了cd44-shrna、磁热联合治疗的明显优势。

表1cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物磁感应加热对卵巢癌细胞ho8910增殖抑制作用

^ap＜0.001与阴性对照组对比；^bmfh组对比；^ep＜0.001与cd44-shrna/mfh组对比

表2cd44-shrna/peg-mzf-nps复合物磁感应加热对卵巢癌细胞ho8910的凋亡诱导作用

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