一种基于纳米材料的自噬阻断系统及其制备方法，以及在砷剂药物治疗实体瘤中的应用与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种基于纳米材料的自噬阻断系统及其制备方法，以及在砷剂药物治疗实体瘤中的应用。

背景技术：

三氧化二砷(ato)是我国的一种传统中药，陈竺和王振义教授使用该药物治疗急性早幼粒细胞白血病(apl)，首次攻克了apl，临床结果显示病人的治愈率高达95％以上。除了apl细胞，ato对多种实体瘤细胞也有一定的杀伤效应，但是其效果却远不如apl细胞。自噬是实体瘤细胞对抗化疗的普遍反应之一。细胞处于自噬状态会降低促进细胞死亡所需的相关酶的活性，从而大大降低化疗效果。ato能诱导多种实体瘤细胞发生自噬，从而增加肿瘤细胞对其的抗性，降低治疗效果。因此，需要发展新的治疗策略来提高实体瘤细胞对ato的敏感性，从而拓展传统中药在恶性肿瘤治疗中的应用。

化疗药结合自噬阻断剂的联合给药策略是当前治疗实体瘤的常用方法之一。例如，阿霉素联合自噬阻断药物氯喹(cq)可以有效杀伤乳腺癌细胞。但是，用于阻断细胞自噬的化学药物多伴有或多或少的毒副作用。例如，cq给药后可能引起白细胞减少、角膜及视网膜变性、剥脱性皮炎等，严重时甚至可导致急性心源性脑缺氧综合征。因此，现阶段需要发展新的联合治疗策略来调控ato引发的实体瘤细胞的自噬行为，提高ato对实体瘤的治疗效果，同时降低化疗对正常组织的毒副作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于纳米材料的自噬阻断系统及其制备方法，以及在砷剂药物治疗实体瘤中的应用，从而解决现有技术中砷剂药物对实体瘤治疗效果不理想的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于纳米材料的自噬阻断系统的制备方法，包括以下步骤：1)将三氧化二砷溶解于naoh溶液中，调节ph为8～8.5，制得三氧化二砷溶液；2)将纳米材料分散于水、生理盐水或缓冲体系中，制成纳米材料混悬液；以及3)将所述三氧化二砷溶液与所述纳米材料混悬液混匀，制得所述基于纳米材料的自噬阻断系统。

根据本发明所提供的方法，其工作原理为：纳米材料和三氧化二砷(ato)混合制成混悬液，给药后，和实体瘤细胞发生相互作用，纳米材料阻断ato诱导的实体瘤细胞自噬，从而提高实体瘤细胞对ato的敏感性，实现ato在实体瘤治疗中的应用。

其中，所述三氧化二砷的分子量为97.84，纯度为99.95～99.995％，最佳纯度为99.995％，市售可得。

所述将三氧化二砷溶解于naoh为常规方法，较佳地为：将三氧化二砷溶解在0.1～1m的naoh溶液中，用0.5～1mhcl调节ph值至8～8.5。其中，naoh溶液的浓度最佳为0.1m。

其中，所述纳米材料为具有自噬阻断效应的常规纳米颗粒。

优选地，所述纳米材料为：纳米金刚石(nds)、纳米金(aunps)或四氧化三铁(fe3o4)，均为本领域的常规纳米材料，市售可得。应当理解，上述三种纳米材料仅作为优选实施例举例说明，并非用于限制，实际上，具有自噬阻断效应的常规纳米颗粒均适用于本发明。

其中最优选地是纳米金刚石，所述纳米金刚石的纯度较佳地为>99％，单颗粒直径较佳地为2～10nm。所述纳米金刚石的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为爆炸法合成。

其次优选地是纳米金和四氧化三铁，其单颗粒直径较佳地为5～30nm，更佳地为10～20nm。

其中，所述步骤2)中的缓冲体系包括：磷酸缓冲盐溶液(pbs)，或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris-hcl)。

其中，所述步骤3)中的混匀为本领域的常规技术手段。所述混匀的方法较佳地为超声混匀或者搅拌混匀，优选地为超声混匀。

根据本发明的第二方面，还提供一种根据上述制备方法制得的基于纳米材料的自噬阻断系统。

其中，所述基于纳米材料的自噬阻断系统优选为纳米金刚石-三氧化二砷混合物，纳米金-三氧化二砷混合物，或四氧化三铁-三氧化二砷混合物。应当理解，上述三种自噬阻断系统仅作为优选实施例用于说明本发明，并非用于限制，实际上，根据纳米材料选择的不同，还可以提供其他自噬阻断系统。

根据本发明所提供的基于纳米材料的自噬阻断系统，细胞实验结果显示上述三种纳米材料的加入使肿瘤细胞的存活率均显著降低，而三种纳米材料本身对细胞均不显示毒性效应，其中对肿瘤细胞存活率的降低效果nds>aunps>fe3o4。

也就是说，根据本发明所提供的基于纳米材料的自噬阻断系统，最优选地为纳米金刚石-三氧化二砷混合物，其次为纳米金-三氧化二砷混合物，再次为四氧化三铁-三氧化二砷混合物。

根据本发明的第三方面，还提供一种基于纳米材料的自噬阻断系统在砷剂药物治疗实体瘤中的应用。

所述应用包括在治疗肝癌、肾癌、结肠癌等各种实体瘤中的应用。应当理解，本发明所提供的自噬阻断系统并不局限于上述三种肿瘤的治疗，实际上可用于多种类似的实体瘤治疗。

在具体应用中，所述自噬阻断系统中三氧化二砷用于体外细胞实验时终浓度为2～8μm，用于体内小鼠实验时终浓度为1.5～3mg/kg；纳米材料用于体外细胞实验时终浓度为50～150μg/ml，用于体内小鼠实验时终浓度为5～10mg/kg。

首先，本发明首次证明了纳米金刚石(nds)与自噬阻断剂cq类似，能有效阻断实体瘤细胞自噬，但是同时又能避免cq引发的毒副作用，从而发现包括纳米金刚石在内的这一类纳米材料均能够阻断砷剂药物在治疗实体瘤时引发的细胞自噬。其次，本发明也是首次应用纳米材料对细胞的自噬阻断效应来增强细胞对化疗药物的敏感性，而现有技术在此之前也从未有过类似的报道。

因此，发明人预期基于nds等纳米材料的自噬阻断系统能联合ato在实体肿瘤的治疗中发挥良好的效果，从而得以提供一种基于纳米材料的自噬阻断系统，并将其应用于砷剂药物对实体瘤的治疗，因此，对于本领域技术人员来说，本发明相对现有技术均是非显而易见的。

本发明相对现有技术的积极进步效果还在于：

本发明制备的基于纳米材料的自噬阻断系统能有效阻断ato诱导的实体瘤细胞自噬，从而显著提高其对实体瘤细胞的杀伤效应，使ato能在低浓度下对实体瘤产生很好的治疗效果，同时又减少对正常组织的毒副作用，改善砷剂药物对实体瘤的治疗效果。在实际应用中，最优地，该基于纳米材料的自噬阻断系统把ato对实体瘤的治疗效果从抑瘤率28％提高到91％，彻底解决了现有技术中存在的砷剂药物治疗实体瘤效果不理想的问题。

总之，本发明提供了一种能显著提高ato在实体肿瘤中治疗效果的方法，具有良好的医学应用前景。

附图说明

图1是不同浓度的ato与nb4、hepg2细胞分别共孵育48h后的存活率图；

图2是cq、ato或cq+ato混合物与hepg2细胞孵育48h，自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图；

图3是cq、ato或cq+ato混合物与hepg2细胞共孵育48h的存活率图；

图4是nds或cq与hepg2细胞共孵育48h，自噬信号通路相关蛋白表达的免疫印迹结果图；

图5是nds或cq与hepg2细胞共孵育48h的透射电镜成像图；

图6是不同浓度的nds、cq与hepg2细胞共孵育48h的存活率图；

图7是nds、ato、nds+ato混合物与hepg2细胞共孵育48h，自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图；

图8是nds、ato、nds+ato混合物与hepg2细胞共孵育48h的存活率图；

图9是nds、ato、nds+ato混合物与hepg2细胞共孵育48h，细胞内的as元素的硬x-射线荧光显微成像图(zn元素指示细胞轮廓)；

图10是nds、ato、nds+ato混合物与hepg2细胞孵育48h，细胞内as含量的icp-oes定量分析图；

图11是尾静脉注射生理盐水、nds、ato、nds+ato混合物(每周连续5天)，三个月后，肿瘤生长抑制效果评估图；

图12是尾静脉注射生理盐水、nds、ato、nds+ato混合物(每周连续5天)，三个月后，肿瘤组织自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图；

图13是nds、ato、nds+ato混合物分别与786-0、ls-1747和hepg2细胞共孵育48h，自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图；

图14是ato、nds+ato混合物分别与786-0、ls-1747和hepg2细胞共孵育48h的存活率图；

图15是nds、fe3o4、aunps分别与hepg2细胞共孵育48h，自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图(cq作为正对照)；

图16是ato、nds+ato混合物、fe3o4+ato混合物、aunps+ato混合物分别与hepg2细胞共孵育48h，自噬相关蛋白表达的免疫印迹结果图(cq作为正对照)；

图17是nds、fe3o4、aunps、ato以及nds+ato混合物、fe3o4+ato混合物、aunps+ato混合物与hepg2细胞共孵育48h的存活率图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例一：ato对急性早幼粒细胞白血病细胞nb4与人肝癌细胞hepg2的药效比较

ato购自sigma(货号：202673)，溶解于0.1mnaoh溶液中，用1mhcl调ph值至8，过滤除菌。

人肝癌细胞hepg2购自中科院上海细胞库，培养于含10％胎牛血清的1640培养基(gibco)中。37℃，5％co2，饱和湿度培养。细胞以7×10⁴/孔密度接种于24孔板中，贴壁过夜。分别加入浓度为2、4、8、16、32μmato，以不做任何处理的细胞为对照，每组三个复孔，孵育48h后mtt(sigma)染色4h，加入10％酸性sds溶解生成的甲瓚结晶，于od570nm处测定每孔的紫外吸收值，细胞存活率以od(处理组)/od(对照组)的百分比表示。

人apl细胞株nb4购自中科院上海细胞库，培养于含10％胎牛血清的1640培养基(gibco)中。37℃，5％co2，饱和湿度培养。细胞以8×10⁴/孔密度接种于24孔板。分别加入浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μmato，以不做任何处理的细胞为对照，每组三个复孔，孵育48h后细胞存活率测定方法与上述hepg2细胞存活率测定方法相同。

结果：存活率比较结果显示，ato对人肝癌细胞hepg2的有效浓度是人apl细胞株nb4的十倍，说明nb4细胞对ato敏感，而实体瘤hepg2细胞对ato不敏感，这也验证了正如本发明背景技术部分所提到的那样，ato对实体瘤的治疗效果较人apl细胞株nb4更差的现象。结果见图1。

实施例二：ato联合自噬阻断药物cq对肿瘤细胞的疗效评估。

cq购自sigma(货号：c6628)，无菌水溶解。

蛋白免疫印迹实验中，hepg2细胞以7×10⁴/孔的密度接种于24孔板，贴壁过夜。设置以下实验组，每组三个复孔：cq(12.5μg/ml)，ato(2μm和4μm各一组)，cq+ato混合物(12.5μg/mlcq+2μmato和12.5μg/mlcq+4μmato各一组)，以不做任何处理的细胞为对照，孵育48h。pbs洗两遍，1×sds上样缓冲液裂解细胞，95℃变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转到pvdf膜上。pvdf膜用溶于pbst(0.1％tween20)的6％脱脂奶粉封闭1h，pbst清洗3次，加入1:1000的一抗。涉及的一抗如下：anti-lc3(novus)，p62(abcam)和gapdh(abcam)。4℃孵育过夜。pbst清洗，加入1:10000稀释的辣根过氧化酶连接的羊抗兔二抗(kpl)，室温孵育1h，pbst清洗，加入eclplus显影液显色，g:box.chem.xl1.4凝胶成像仪(基因公司，美国)观察。

细胞存活率实验中，hepg2细胞的处理与本实施例中蛋白免疫印迹实验相同，孵育结束后，细胞存活率测定方法与实施例一相同。

结果：蛋白免疫印迹实验结果显示，ato和细胞孵育后，自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达上升，自噬底物蛋白p62表达下降，说明ato诱导肿瘤细胞发生自噬。加入自噬阻断剂cq后，阻断了ato诱导的p62的降解，同时，细胞内lc3-ⅱ的表达也进一步上升，结果见图2；细胞存活率实验结果显示，与单独三氧化二砷组相比，cq的加入使细胞存活率显著降低，说明阻断ato诱导的细胞自噬能显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效果，结果见图3。

实施例三：纳米金刚石对细胞的自噬调控效应。

纳米金刚石(nds，甘肃金石纳米材料有限公司)，所述纳米金刚石纯度>99％，单颗粒直径约2～10nm，在溶液中形成250nm左右的团簇结构。紫外照射30min，分散于无菌水中。

蛋白免疫印迹实验中，hepg2细胞以7×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，贴壁过夜。分别加入50μg/mlnds和12.5μg/mlcq，以不做任何处理的细胞为对照，每组三个复孔，孵育48h。细胞裂解、蛋白电泳、转膜方法与实施例二相同。本实施例涉及的一抗如下：anti-lc3(novus)，p62(abcam)和gapdh(abcam)，mtor(cellsignalingtechnology)，p-mtor(cellsignalingtechnology)，p70s6k(cellsignalingtechnology)和p-p70s6k(cellsignalingtechnology)，加一抗、二抗和显色成像方法与实施例二相同。

透射电镜观察实验中，hepg2细胞以6×10⁵/孔的密度接种于60×15mm细胞培养盘中，贴壁过夜。分别加入50μg/mlnds和12.5μg/mlcq，孵育48h。pbs洗两遍，加入少许2.5％戊二醛进行预固定，细胞刮收集细胞，2000rpm离心10min，弃上清，加入2.5％戊二醛固定2h以上。pbs洗涤，梯度乙醇脱水，epon618包埋。超薄切片，透射电镜(tem,jeol-1230；jeol)观察。

结果：蛋白免疫印迹结果显示，nds与自噬阻断剂cq类似，引发自噬标志蛋白lc3-ⅱ的上调，自噬底物蛋白p62下调。m-tor通路上p-mtor以及下游蛋白p-p70s6k的上调，蛋白免疫印迹结果见图4。另外，透射电镜结果显示，cq处理的细胞内可以观察到大量的自噬溶酶体，同样，用nds处理的细胞内也能观察到大量自噬溶酶体，并且溶酶体内部包裹了nds，电镜结果见图5。上述结果充分说明nds能够有效地阻断细胞自噬。

实施例四：纳米金刚石和cq安全性比较。

细胞存活率实验中，hepg2细胞以7×10⁴/孔密度接种于24孔板，贴壁过夜。分别加入nds和cq，浓度均为12.5、25、50和100μg/ml，以不做任何处理的细胞为对照，每组三个复孔，孵育48h。细胞存活率测定方法与实施例一相同。

结果：在25μg/ml浓度下，cq即显示显著的细胞毒性，而即使浓度达到100μg/ml，nds仍然对细胞不显示任何毒性效应，结果见图6，表明与cq相比，nds具有更好的生物相容性。

实施例五：ato联合自噬阻断纳米颗粒nds对肝脏肿瘤细胞的疗效评估

将一定量的ato溶液与nds混悬液混合，超声混匀，制备出基于nds的自噬阻断系统用于细胞实验。

蛋白免疫印迹实验中，hepg2细胞以7×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，贴壁过夜。设置以下实验组，每组三个复孔：nds(50μg/ml)，ato(2μm和4μm各一组)，nds+ato混合物(50μg/mlnds+2μmato和50μg/mlnds+4μmato各一组)，以不做任何处理的细胞为对照，孵育48h。细胞裂解、蛋白电泳、转膜、加一抗二抗和显色成像方法与实施例二相同。

细胞存活率实验中，hepg2细胞的处理与本实施例中蛋白免疫印迹实验相同，孵育结束后，细胞存活率测定方法与实施例一相同。

结果：蛋白免疫印迹实验结果显示，加入自噬阻断纳米颗粒nds后，阻断了ato诱导的自噬底物蛋白p62的降解，同时，细胞内自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达进一步上升，结果见图7；细胞存活率实验结果显示，与单独三氧化二砷组相比，nds的加入使细胞存活率显著降低，而nds本身对细胞不显示毒性效应，结果见图8，说明nds可以有效阻断ato诱导的细胞自噬，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效果。

实施例六：ato-nds联合给药对肿瘤细胞摄取ato的影响

硬x-射线荧光显微技术对细胞内元素成像实验中，将氮化硅窗放入24孔板，紫外杀菌，pbs漂洗3遍。hepg2细胞以3×10⁴/孔的密度接种，贴壁过夜。分别加入50μg/mlnds，4μmato，nds+ato混合物，以不做任何处理的细胞为对照，孵育48h。pbs洗涤3遍，4％多聚甲醛固定2h，梯度乙醇脱水。上海光源bl15u1硬x射线微聚焦线站荧光显微成像技术对细胞内元素进行成像。线站使用si(111)单色器将x射线单色化，选用12kev作为入射x射线能量，激发样品中p到as元素的k边x射线荧光。应用k-b聚焦镜将x射线聚焦为2.5×2.5μm大小，样品扫描步长为2×2μm，每个点的数据采集时间为2s，使用pymca4.0.9软件对荧光数据进行批量拟合处理，从而获得细胞样品中所需元素的x射线荧光成像图。

细胞内as含量的定量分析实验中，hepg2细胞以2×10⁵/孔的密度，接种于35×10mm细胞培养盘中，贴壁过夜。分别加入50μg/mlnds，4μmato，nds+ato混合物，以不做任何处理的细胞为对照，每组三个复孔，孵育48h。pbs洗涤5遍，胰酶消化细胞，收集细胞于pbs缓冲液中，2000rpm离心，pbs重悬洗涤3次，收集最终的细胞沉淀，pbs吹打均匀，取100μl细胞用于计数，其余用探针超声破碎，12000rpm离心10min，取上清用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes,spectroarcossop,spectro,gemany)测定细胞内砷的含量。

结果：硬x-射线荧光显微成像和细胞中as含量的icp-oes测定结果均显示，和ato处理的细胞相比，加入nds后细胞内as的含量和分布没有显著变化。结果见图9，10。说明ato-nds联合给药不增加细胞对ato的摄取。

实施例七：ato联合自噬阻断纳米颗粒nds在原位肝肿瘤治疗中的应用

nds分散于生理盐水中，将一定量的ato溶液与nds混悬液混合，超声混匀，制备出基于nds的自噬阻断系统用于动物实验。

裸鼠，雄性，18～22g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。肿瘤生长抑制效果评估实验中，首先建立皮下瘤作为原位瘤的瘤源。方法如下：收集hepg2细胞，重悬于生理盐水，以2×10⁶个/ml密度注射200μl于裸鼠腋窝处，2～3周后即得。原位肝肿瘤裸鼠模型建立方法如下：选择活力好的近皮下瘤边缘组织切成约1mm³小块，放入生理盐水备用，瘤块离体后1h内植入裸鼠。裸鼠腹腔麻醉，左上腹肋缘下斜切口长约6～8mm暴露肝脏左叶。用尖镊子在肝左叶最厚实的区域刺破肝被膜，棉签轻压刺破口，再用尖镊子准确送入准备好的瘤组织。全层关腹，5-0带锦纶线缝合针(上海金环医疗)缝合。裸鼠苏醒后，随机分为四组，每组8只。一周后，分别给予下列制剂：生理盐水组(200μl生理盐水)，nds组(100μg/20g)，ato组(30μg/20g)，nds+ato组。每周连续注射5天。三个月后处死小鼠，取瘤块称重，肿瘤生长抑制效果以肿瘤重量(给药组)/肿瘤重量(生理盐水组)的百分比表示。

蛋白免疫印迹实验中，将每组裸鼠的肿瘤随机取3个，取30mg瘤块组织剪碎，加入含complete蛋白酶抑制剂混合片(罗氏)的ripa裂解液(碧云天)500μl(每10mlripa裂解液溶解一片complete蛋白酶抑制剂混合片)，超声破碎，加入5μl苯甲基磺酰氟(pmsf，碧云天)，4℃静置1h，14000rpm离心20min去除沉淀。上清采用bca法将蛋白定量至2mg/ml,1:1加2×sds蛋白上样缓冲液，95℃变性10min。lc3、p62和gapdh蛋白的免疫印迹实验方法与实施例二相同。

结果：肿瘤生长抑制效果评估结果显示，与生理盐水组相比，单独ato处理使肿瘤重量下降了28％，nds的加入使肿瘤重量下降了91％，而nds本身对肿瘤生长无抑制效果，结果如图11所示。蛋白免疫印迹结果显示，ato处理后，肿瘤组织自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达上升，自噬底物蛋白p62表达下降，说明ato诱导肿瘤发生自噬。nds处理后，肿瘤组织自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达上升，自噬底物蛋白p62表达上升，说明nds阻断了肿瘤细胞的自噬。nds和ato联合给药后，nds的加入阻断了ato诱导的自噬底物p62的降解，同时，细胞内自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达也进一步上升，结果见图12。说明nds在小鼠体内能有效阻断ato诱导的实体瘤细胞自噬，显著提高其对实体瘤细胞的杀伤效应，从而对实体瘤的生长产生很好的抑制效果。

实施例八：ato联合自噬阻断纳米颗粒nds对多种实体瘤细胞的疗效评估

786-0肾癌细胞购自中科院上海细胞库，ls-174t结肠癌细胞购自中国生命科学院上海生命研究所，均培养于含10％胎牛血清的培养基(gibco)rpmi1640中，37℃，5％co2，饱和湿度培养。每种细胞均以7×10⁴/孔的密度分别接种于24孔板中，贴壁过夜。分别加入50μg/mlnds，4μmato，nds+ato混合物，以不做任何处理的细胞分别作为对照，每组三个复孔，孵育48h。

蛋白免疫印迹实验中，各肿瘤细胞的处理与本实施例中存活率测定实验相同，孵育结束后，蛋白免疫印迹实验方法与实施例二相同。

结果：蛋白免疫印迹实验结果显示，在三种细胞中，加入自噬阻断纳米颗粒nds后，均阻断了ato诱导的自噬底物蛋白p62的降解，同时，细胞内自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达进一步上升，结果见图13。细胞存活率结果显示与单独ato组相比，nds的加入使三种细胞的存活率均显著降低，而nds本身对三种细胞均不显示毒性效应，结果见图14。说明nds可以有效阻断ato诱导的多种实体瘤细胞的自噬，从而显著提高其对多种实体瘤细胞的杀伤效果。

实施例九：ato联合其他自噬阻断纳米颗粒对肝脏肿瘤细胞的疗效评估

纳米金(aunps)购自杭州纳晶科技有限公司，直径20nm(货号：a03)。四氧化三铁(fe3o4)购自杭州纳晶科技有限公司，直径20nm(货号：ow)。基于aunps、fe3o4纳米颗粒的自噬阻断系统的制备方法同实施例五。

hepg2细胞以7×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，贴壁过夜。

蛋白免疫印迹实验中，设置以下实验组：cq(12.5μg/ml)，nds(50μg/ml)，aunps(50μg/ml)，fe3o4(50μg/ml)，ato(4μm)，nds+ato混合组、aunps+ato混合组、fe3o4+ato混合组，以不做任何处理的细胞为对照，每组设3个复孔，孵育48h。蛋白免疫印迹实验方法与实施例二相同。

细胞存活率实验中，设置以下实验组：nds(50μg/ml)、aunps(50μg/ml)、fe3o4纳米颗粒(50μg/ml)，ato(4μm)，nds+ato混合组、aunps+ato混合组、fe3o4+ato混合组，以不做任何处理的细胞为对照，每组3个复孔，孵育48h，细胞存活率测定方法与实施例一相同。

结果：蛋白免疫印迹结果显示，三种纳米颗粒均能有效阻断细胞自噬，与ato混合后，均有效阻断了ato诱导的自噬底物蛋白p62的降解，同时，细胞内自噬标志蛋白lc3-ⅱ的表达进一步上升，其中nds的阻断效果最强，结果见图15，16。细胞存活率结果显示，与单独ato组相比，三种纳米材料的加入使细胞的存活率均显著降低，而三种纳米材料本身对细胞均不显示毒性效应，其中对肿瘤细胞存活率的降低效果nds>aunps>fe3o4，结果如图17所示。说明多种具有自噬阻断效应的纳米颗粒均可以有效阻断ato诱导的实体瘤细胞的自噬，从而显著提高其对实体瘤细胞的杀伤效果。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。