本发明属于中药学
技术领域：
，涉及一种药物组合物及其制备方法和在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。
背景技术：
：神经退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)是以神经元进行性变性、死亡为基础的一类慢性中枢神经系统疾病，以影响患者的认知功能或运动功能为主，主要包括阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)、帕金森病(parkinson’sdisease，pd)、亨廷顿病病(huntingtondisease)、脊髓小脑共济失调(spinalcerebellarataxias)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis)及脊髓肌萎缩症(spinalmuscularatrophy)等。这类疾病的临床表现、病变特征虽不尽相同，但它们均有的共同特征是：神经元的进行性变性坏死，神经胶质细胞显著增殖活化，至今无理想的防治药物，患者致残、致死率高。目前该类疾病的发病机制尚不明确，老化、炎症、遗传、环境毒素等多种复合因素是该类疾病的共同致病因素，病理机制均包括神经元、神经胶质细胞功能受损、轴突传递功能障碍、谷氨酸兴奋性毒性、活性氧(ros)水平过高、代谢通路受损、线粒体能量产生减少、错误折叠蛋白质形成增加或降解不充分等。神经退行性疾病严重危害人类健康，给患者、家属和社会带来了极大的心理和经济负担，发展防治神经退行性疾病的药物备受重视。曼地亚红豆杉(taxusmadia)原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种。在我国大部分地区可以栽种，生长快，高度年生长实测40～90cm，最高可60～70cm，是国内红豆杉(中国红豆杉、云南红豆杉等)的300～700％生长量。3～4年生生物量积累为600～800/株·年，5年生时产鲜原料1.5kg以上，可用于提炼紫杉醇。曼地亚红豆杉叶中除含紫杉醇等小分子活性物质外，还发现曼地亚红豆杉叶中含有的活性黄酮成分，目前尚未有曼地亚红豆杉叶中黄酮防治神经退行性疾病的报道。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种药物组合物及其制备方法和在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用，所述药物组合物具有治疗神经退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)的作用，对细胞的毒副作用小，具有广泛的应用前景。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括曼地亚红豆杉叶提取物和药学上可接受的载体，其中，所述曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为0.1-99.9％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、5％、8％、10％、13％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或99.9％。优选地，所述曼地亚红豆杉叶提取物含有黄酮类成分，不含有紫杉烷类成分。本发明中，曼地亚红豆杉叶提取物化学成分众多，主要富含黄酮类成分，几乎无紫杉烷类成分，有着传统中药复方配伍使用的效果，作为一种天然药，相比于单一的药物，毒副作用小。首次发现本发明所述曼地亚红豆杉提取物具有治疗神经退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)的作用。优选地，所述曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为1-90％，优选为20-85％，进一步优选为40-80％。优选地，所述曼地亚红豆杉叶提取物为醇提取物和/或中药浸膏。优选地，所述药学上可接受的载体为甘露醇、山梨醇、山梨酸、山梨酸钾、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素a、维生素c、维生素e、维生素d、氮酮、edta二钠、edta钙钠、一价碱金属的碳酸盐、一价碱金属的醋酸盐、一价碱金属的磷酸盐、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司班-80、蜡、羊毛脂、液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、植物油、磷脂、聚乙二醇磷脂、聚乙二醇磷脂衍生物、油酸、油酸盐、抗氧化剂、或离子络合剂中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述植物油为大豆油、中链油、橄榄油、茶油、棕榈油、当归油、沙棘油、莪术油、川芎油、薏米仁油、红花油、花椒油或大蒜油中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂或人工合成磷脂中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述聚乙二醇磷脂为聚乙二醇-脑磷脂、聚乙二醇-胆固醇、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油酯、聚乙二醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-脂肪胺或聚乙二醇-脂肪醇中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述抗氧化剂为维生素e。优选地，所述药物组合物的剂型为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述曼地亚红豆杉叶提取物的提取方法为醇提、层析、真空提取、超临界流体萃取法、超声提取法、酶法提取、微波提取法、荷电提取法或半仿生提取法中的任意一种或至少两种的组合，优选为醇提与层析组合。优选地，所述曼地亚红豆杉叶提取物的提取方法包括以下步骤：取曼地亚红豆杉叶进行粗粉碎，加醇煎煮，冷却至室温，减压回收至干；对提取物粗品以大孔树脂柱层析，先以水洗脱去除糖类成分，再以乙醇洗脱；利用聚酰胺柱对乙醇洗脱浓缩物进行层析分离，分别以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇的洗脱梯度进行洗脱。取90％乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得所述曼地亚红豆杉叶提取物。优选地，所述加醇煎煮时，曼地亚红豆杉叶与醇的重量比为1:(5-15)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15，优选为1:(9-12)，使用过少的醇对曼地亚红豆杉叶进行提取，不利于有效成分的浸出，而过多的醇也并不能继续显著增加有效成分的浸出，反而可能使得其他成分的浸出量增多，从而影响提取物中各成分的配比关系，进而影响其作用效果。优选地，所述煎煮的次数为2-5次，例如可以是2次、3次、4次或5次，优选为3次。优选地，所述每次煎煮的时间为1-3h，例如可以是1h、1.3h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h或3h，优选为2h，煎煮时间太短会使得有效成分不能浸出，影响提取物的作用效果，而煎煮时间太长会破坏有效成分，也会影响各成分的配比关系，从而影响提取物中各成分之间的君臣佐使的配合关系，进而影响到对于神经退行性疾病的治疗效果。优选地，所述加醇煎煮中醇为甲醇、甲醇水溶液、乙醇或乙醇水溶液中的任意一种或至少两种的混合物，优选甲醇、乙醇、80％甲醇水溶液或70％乙醇水溶液，进一步优选为70％乙醇水溶液；优选地，所述每个洗脱梯度的洗脱体积为3-7倍柱体积，例如可以是3倍柱体积、3.5倍柱体积、4倍柱体积、4.5倍柱体积、5倍柱体积、5.5倍柱体积、6倍柱体积、6.5倍柱体积或7倍柱体积，优选为5倍柱体积。优选地，所述真空干燥的温度为20-80℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、25℃、26℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，优选为30-60℃，进一步优选为50℃。第二方面，本发明提供了如第一方面所述的药物组合物的制备方法，所述制备方法为：将曼地亚红豆杉叶提取物和药学上可接受的载体进行混合，使得所述曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为0.1-99.9％，得到所述药物组合物。在本发明中，可以将所述药物组合物经过本领域已知的制剂工艺制备得到相应的剂型。第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物组合物在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、多发性硬化症、脊髓小脑萎缩症或血管性痴呆病中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明利用曼地亚红豆杉叶提取物与药学上可接受的载体配合得到药物组合物，对神经退行性疾病具有良好的治疗效果，对小胶质细胞活化的活性的抑制率可达50％以上，且对lps引起的神经炎症具有抑制作用，对lps引起的神经损伤具有保护作用。(2)本发明提取的曼地亚红豆杉叶提取物相比于曼地亚红豆杉其他部位的提取物具有特定的防治神经退行性疾病药物的作用，经过特定的提取工艺，使得提取物中有效成分以及其他辅助成分具有较佳的配合关系，使得各成分之间很好地发挥君臣佐使的配合关系，从而达到对神经退行性疾病的良好治疗效果。(3)本发明的药物制备工艺简单，药效显著，显著改善神经退行性疾病模型动物的行为障碍，抑制模型动物中脑多巴胺能神经元的损伤，减轻胶质细胞的活化，具有治疗神经退行性疾病的作用，为神经退行性疾病的临床治疗提供了更多选择，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1在本实施例中，通过以下方法来制备药物组合物：(1)曼地亚红豆杉提取物的提取取曼地亚红豆杉叶粗粉500g，每次加10倍量70％乙醇煎煮，每次1h，煎煮3次。煎煮后，冷却至室温，减压回收至干。对提取物粗品以大孔树脂柱层析，先以5倍柱体积水洗脱去除糖类成分，再以5倍柱体积乙醇洗脱。乙醇洗脱浓缩物再以聚酰胺进行柱层析分离，分别以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇进行洗脱，每个梯度的洗脱体积为5倍柱体积。取90％乙醇洗脱液，减压浓缩，50℃真空干燥，即得所述曼地亚红豆杉叶提取物。(2)将提取得到的曼地亚红豆杉叶提取物与聚乙二醇混合，使得曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为60％，后制作成胶囊剂药物，得到所述药物组合物。实施例2在本实施例中，通过以下方法来制备药物组合物：(1)曼地亚红豆杉提取物的提取取曼地亚红豆杉叶粗粉500g，每次加15倍量80％甲醇煎煮，每次1h，煎煮3次，煎煮后，冷却至室温，减压回收至干。对提取物粗品以大孔树脂柱层析，先以5倍柱体积水洗脱去除糖类成分，再以5倍柱体积乙醇洗脱。乙醇洗脱浓缩物再以聚酰胺进行柱层析分离，分别以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇进行洗脱，每个梯度的洗脱体积为7倍柱体积。取90％乙醇洗脱液，减压浓缩，50℃真空干燥，即得所述曼地亚红豆杉叶提取物。(2)将提取得到的曼地亚红豆杉叶提取物与山梨醇混合，使得曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为80％，而后制作成胶囊剂药物，得到所述药物组合物。实施例3在本实施例中，通过以下方法来制备药物组合物：(1)曼地亚红豆杉提取物的提取取曼地亚红豆杉叶粗粉500g，每次加5倍量70％乙醇煎煮，每次3h，煎煮2次，煎煮后，冷却至室温，减压回收至干。对提取物粗品以大孔树脂柱层析，先以5倍柱体积水洗脱去除糖类成分，再以5倍柱体积乙醇洗脱。乙醇洗脱浓缩物再以聚酰胺进行柱层析分离，分别以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇进行洗脱，每个梯度的洗脱体积为3倍柱体积。取90％乙醇洗脱液，减压浓缩，50℃真空干燥，即得所述曼地亚红豆杉叶提取物。(2)将提取得到的曼地亚红豆杉叶提取物与甘露醇混合，使得曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为90％，而后制作成胶囊剂药物，得到所述药物组合物。实施例4在本实施例中，通过以下方法来制备药物组合物：(1)曼地亚红豆杉提取物的提取取曼地亚红豆杉叶粗粉500g，每次加8倍量70％乙醇煎煮，每次2h，煎煮3次，煎煮后，冷却至室温，减压回收至干。对提取物粗品以大孔树脂柱层析，先以5倍柱体积水洗脱去除糖类成分，再以5倍柱体积乙醇洗脱。乙醇洗脱浓缩物再以聚酰胺进行柱层析分离，分别以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇进行洗脱，每个梯度的洗脱体积为6倍柱体积。取90％乙醇洗脱液，减压浓缩，50℃真空干燥，即得所述曼地亚红豆杉叶提取物。(2)将提取得到的曼地亚红豆杉叶提取物与聚乙二醇磷脂混合，使得曼地亚红豆杉叶提取物的重量百分比为20％，后制作成胶囊剂药物，得到所述药物组合物。实施例5在本实施例中对本发明的药物组合物对小胶质细胞活化的抑制作用进行验证，方法如下：bv2细胞为小鼠小胶质细胞系；griess试剂：以蒸馏水配制0.1％萘乙二胺，以5％磷酸配制1％对氨基苯磺酸，两者在临用前以1:1等体积混合；姜黄素，用dmso配制；脂多糖lps，用无菌pbs配制，终浓度为300ng/ml；实验方法：(1)bv2细胞于含10％新生牛血清的dmem-f12培养基中培养，于37℃，5％co2，95％空气，100％相对湿度下生长；(2)对数生长期的bv2细胞，经消化计数后，以2×104个/孔接种到96孔板中，24小时后加入受试物，1小时后加入lps，终浓度为300ng/ml，继续培养24小时，收集培养基上清液；(3)取细胞培养液上液清100μl，加入等体积griess试剂，室温静置20min，蒸馏水调零，于酶标仪上在540nm处测定od值，同时以硝酸钠为标准品，测定od值，计算待测样品中no2-的浓度反映no的浓度。结果如下表1所示。表1由表中结果可见，给药浓度100μg/ml时，本发明制备的药物组合物表现出了明显的抑制小胶质细胞活化的活性，抑制率>50％。实施例6在本实施例中，对本发明的药物组合物对lps引起的神经炎症和神经元损伤的抑制作用进行考察，方法如下：脂多糖，用无菌pbs配制，终浓度为100ng/ml；姜黄素用dmso配制；实验方法：(1)原代海马神经元/胶质细胞混合培养体系的建立：孕18d的sd大鼠胚胎，在解剖镜下分离海马，用移液管进行吹打，直至看不到组织块为止，过滤后接种于24孔板中；(2)细胞给药处理：上述原代细胞培养7d后，分别与受试物共孵育，3h后加入刺激剂lps100ng/ml，5h后取培养基用elisa试剂盒测il-1β和tnf-α；(3)细胞经药物处理7d后，收集培养基用ldh检测试剂检测ldh。结果如下表2所示。表2受试物剂量il-1β(pg/ml)tnf-α(pg/ml)ldh(pg/ml)实施例1的药物组合物100μg/ml100.9143.1165.2实施例2的药物组合物100μg/ml114.5135.6198.7实施例3的药物组合物100μg/ml88.1156.1201.4实施例4的药物组合物100μg/ml137.6127.5160.2姜黄素10-5m92.4122.3178.7模型组(lps)240.8268.7798.0空白组0046.2表中结果显示，本发明药物可明显抑制在lps刺激下出现的炎症反应，降低培养基中il-1β、tnf-α水平，在100μg/ml浓度下，对炎症的抑制程度与阳性对照药姜黄素(10-5m)相当；海马神经元/胶质细胞混合培养体系在lps的刺激下，ldh的释放量明显增加，神经元出现了明显损伤，本发明药物可明显抑制ldh的释放，对神经元有保护作用，在100μg/ml浓度下，对ldh释放的抑制程度与阳性对照药姜黄素相当。综上所述，本发明的红豆杉叶提取物作为一种天然药物，显著改善神经退行性疾病模型动物的行为障碍，抑制模型动物中脑多巴胺能神经元的损伤，减轻胶质细胞的活化，具有治疗神经退行性疾病的作用，为神经退行性疾病的临床治疗提供了更多选择，具有广阔的应用前景。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的药物组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12