一种软骨脱细胞基质的制备方法与流程

本发明涉及自体软骨细胞移植技术领域，尤其涉及一种软骨脱细胞基质的制备方法。

背景技术：

正常关节软骨为透明质软骨，是一种具有很强耐受力且结构单一的组织。由各种不同类型的病因所致的骨关节损伤或软骨缺损为骨伤科常见病，主要表现为关节疼痛、肿胀、僵硬和功能障碍，并可逐渐发生退行性变。其中膝关节软骨损伤为骨关节损伤中的常见病。膝关节软骨损伤在世界范围内是相当普遍的，有外国学者统计，在做膝关节镜检查的患者中，有60％以上存在关节软骨损伤。由于没有神经及血管组织，软骨的营养主要依靠从滑膜分泌的滑液中摄取。但由于蛋白多糖合成受到抑制，胶原纤维受到破坏，使软骨丧失其弹关节软骨损伤机制性，增加了液压渗透性而使软骨细胞承受的压应力增高，导致分解酶增加，滑润作用下降而致关节软骨表面破坏。损伤后的关节软骨细胞因为其代谢缓慢，很难自行修复，即使比较小的软骨损伤也可能产生比较显著的症状，最终导致关节的退行性改变。

关节软骨的修复受患者年龄、受损部位、缺损范围、深度、关节的稳定性、受伤的程度等多方面影响。自体软骨细胞移植适合于急性或慢性创伤导致的仅涉及到软骨面而软骨下骨完整的损伤。该方法对于中小面积软骨损伤患者在缓解疼痛和改善功能方面具有较好疗效。与其他方法如微骨折法相比，自体软骨细胞移植术可以产生较多的透明软骨样修复组织，且具有更好的临床效果，该技术已经成为治疗膝关节软骨病变的最重要的手术方法之一。但此手术涉及到包被和粘缝，增加了手术的复杂性；第三代自体软骨细胞移植具有支架材料，外源材料会出现生物相容性的问题；会出现手术并发症；同时由于自体软骨细胞会贴壁，导致部分软骨细胞的去分化从而生成纤维软骨，但仍未能理想的对软骨缺损区以持续稳定的方式行透明软骨修复，从而无法较好地恢复关节软骨良好的生物力学性能。

并且，自体透明软骨(lhcg)之所以能够治疗膝关节损伤主要是自体透明软骨填充了膝关节软骨缺损，在向动物体内移植时，只有活细胞及其分泌的蛋白多糖钙和ii型胶原。机械强度介于目前产品与天然软骨之间，是一个相对软的、海绵状的状态，能够和周围的软骨组织很好的共同生长，移植动物体内2个月左右时，就可以像真正的软骨一样硬。但是成熟的自体软骨细胞扩增困难，自体软骨组织来源有限，取材不方便，体外培养易发生去分化现象，失去软骨形成能力。且其活性随年龄增长而明显下降，使得细胞扩增受到限制，达不到组织构建的要求。这些问题限制了组织工程产品自体透明软骨(lhcg)很难推广到临床上。

目前，较有前途的之劳关节软骨疾病的方法就是关节腔内大量注射间充质干细胞，因为细胞可以作为营养的生物活性因子启动再生活动导致缺陷的修复。软骨细胞培养条件和移植后的固定问题限制了软骨细胞移植的临床应用。有研究首先将软骨细胞种植于人工合成多聚物和胶原凝胶支架上，成功的在体外再生了软骨组织，用于修复关节软骨缺损，获得了满意的效果。然而在细胞支架复合物移植入体内后，支架将可能引起受者的免疫排斥反应；原有组织和支架材料整合困难，复合物的机械强度较低。

脱细胞基质(acellularmatrix，acm)一般指异体组织经细胞灭活处理后，制备成无活体细胞存在的ecm成分和结构。因其无抗原性，以及有良好的生物相容性，成为组织工程支架材料的选择之一。脱细胞处理的真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小肠粘膜基质、骨、肝脏等作为相应组织的替代物已相继开发成功，显示出良好的应用前景。将软骨组织中的细胞脱除作为细胞支架，可以解决排斥反应的问题，成为具有良好生物相容性的组织工程支架材料。然而由于自体软骨组织来源有限，且细胞的脱除难度较大，故而自体软骨脱除细胞制成的支架材料十分稀缺。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，本发明提供的方法对组织工程软骨进行脱细胞，所获得的脱细胞软骨与自体软骨脱细胞后的性能一致。

本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法，为将组织工程软骨依次经a液、b液处理后，以rnasea和dnasei酶解，然后经c液处理，获得脱细胞软骨；

所述a液为含有蛋白酶抑制剂的tris-hcl缓冲液，其中蛋白酶抑制剂的质量分数为0.01％～1％；

所述b液为含有sds和蛋白酶抑制剂的tris-hcl缓冲液，其中蛋白酶抑制剂的质量分数为0.01％～1％；sds的体积分数为2％；

所述c液为含有tritonx-100的tris-hcl缓冲液，其中tritonx-100的体积分数为1％。

所述a液的tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为1～100mm；ph值为5.0～8。

所述b液的tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为1～100mm；ph值为5.0～8。

所述c液的tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为1～100mm；ph值为5.0～8。

一些实施例中，a液处理的条件为0～4℃，震荡处理48h。

一些实施例中，b液处理的条件为0～4℃，震荡处理48h，然后以蒸馏水冲洗24h。

一些实施例中，rnasea和dnasei酶解酶解中，rnasea的量为1g/l；dnasei的量为500u/ml。

一些实施例中，c液处理的条件为0～4℃，消化24h，然后以蒸馏水冲洗24h。

由于天然组织(自体软骨)结构致密，因此对于自体软骨的脱细胞的方法是将自体软骨破碎成小块之后粘连碎块，破坏了组织的完整性和内部结构；而采用组织工程软骨脱细胞可以在不破坏移植物完整性的前提下彻底地进行。

并且，由于其生物结构已被破坏，且无法恢复，自体软骨脱细胞后，需经将组织碎块进行粘连，以形成的移植物；但这种粘连形成的移植物相较于人工合成材料支架不具有明显优势。而组织工程软骨脱细胞可以保持组织工程软骨原有的生物结构，不需进行粘连，性能也优于人工合成材料。

采用组织工程软骨进行脱细胞处理，可以解决自体软骨来源有限的问题，且由于脱除细胞后，避免了免疫反应的产生，在临床上可实现同种异体甚至异种移植。异体/异种移植可以减少病人的手术次数。目前一般膝关节修复手术需手术两次，第一次手术收集细胞，第二次手术植入同体移植物。异体/异种移植可以将手术减少到一次。同时可以避免供体部位坏死或者继发性感染的问题。

但是常规培养的组织工程软骨与自体软骨存在区别，脱除细胞后作为支架使用效果不佳，故而优选采用本申请提供的组织工程软骨的制备方法。

本发明采用的组织工程软骨为猪源组织工程软骨，其为猪源软骨组织经培养获得。

优选的，组织工程软骨的制备方法为：

步骤1：将自体软骨以ii型胶原酶解后，以cm培养基进行原代培养；

步骤2：原代培养后的细胞以胰蛋白酶消化后，以海藻酸钠溶液重悬；

步骤3：将重悬的细胞接至明胶包被的培养容器，0～4℃放置4min后，添加cacl2溶液，0～4℃放置4min，形成细胞凝胶；

步骤4：将细胞凝胶转移至琼脂糖包被的培养容器，以cc培养基培养15～25天，培养过程中每2～3天更换新鲜培养基；获得组织工程软骨。

自体软骨的原代培养方法为：将软骨组织经消毒后置于cm培养基中，切碎后，弃除cm培养基，以1mg/mlii型胶原酶溶液，37℃，50rpm，消化14h；然后将消化软骨组织的消化液1100rpm离心5min，去除上清；沉淀以cm培养基重悬，37℃，5％co2，饱和湿度培养8天，培养过程中每天更换新鲜cm培养基。更换新鲜培养基前以pbs缓冲液清洗细胞。培养至第8天，软骨细胞融合度达到95％，传代。

所述传代指将原代培养的细胞以胰蛋白酶消化后，转接继续培养的过程。

胰蛋白酶消化具体为：质量分数为0.25％胰蛋白酶，37℃，消化4min。

消化后，以cm培养基种质消化，1100rpm，5min离心细胞，去上清。沉淀为软骨细胞。

将软骨细胞以海藻酸钠溶液重悬。培养容器优选24孔板。以浓度为1％～50％的明胶包被的24孔板；以浓度为0.1％～12％的琼脂糖包被24孔板。

本发明实施例中，海藻酸钠溶液的中海藻酸钠的质量分数为0.1％～20％。

作为优选，海藻酸钠溶液的中海藻酸钠的质量分数为1.5％。

本发明实施例中，重悬至海藻酸钠溶液的中细胞的密度为2×10⁶个细胞/ml。

海藻酸钠重悬细胞后，加入明胶包被的24孔板中，每孔400μl细胞悬液，往培养板孔中间加入，避免产生气泡，旋转培养板，使得细胞悬液铺满孔。

本发明实施例中，cacl2溶液的浓度为200mmol/l；cacl2溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1：1。

cacl2溶液加入方式为在孔壁上轻缓旋转地加入。

提前向包被琼脂糖的24孔板中每孔加入1mlcc培养基。用小勺子将凝固的细胞凝胶块转移到琼脂糖包被的24孔板中培养。每隔2～3天换液，共培养20天，可以得到透明软骨。

采用本发明提供的方法，软骨细胞包裹于海藻酸钠水凝胶中三维培养，培养至第3天，细胞生长不明显，如图2。但当细胞培养至第20天时，可以看到细胞不断增殖以及分泌基质，呈组织样的形态，如图3。

实验表明，采用本发明提供方法制备的基质与未脱细胞的透明质软骨相比，未脱细胞透明质软骨和脱细胞透明质软骨的ii型胶原含量一致，但是脱细胞组中软骨陷窝里面看不到细胞核的存在，而脱细胞组可以明显的看到细胞核的存在，即脱细胞组的透明质软骨细胞被脱掉。另从dna定量和甲苯蓝染色液可看出，细胞脱除的十分完全。

本发明所述制备方法制得的软骨脱细胞基质。

本发明提供的制备方法以组织工程化软骨为原料，进行细胞脱除，所获得的软骨脱细胞基质中无细胞存在，dna含量极低，而胶原蛋白的含量则不受影响。保持了良好的软骨组织的完整性，生物结构良好，作为支架使用能够具有更加良好的的性能。

附图说明

图1示猪源软骨细胞原代培养至第8天100×；

图2示实施例2猪源软骨细胞三维培养至第3天100×；

图3示实施例2猪源软骨细胞三维培养至第20天100×；

图4示组织工程透明质软骨ii型胶原染色200×；

图5示组织工程透明质软骨甲苯胺蓝染色200×；

图6示组织工程透明质软骨he染色200×；

图7示组织工程透明质软骨脱细胞基质ii型胶原染色200×；

图8示组织工程透明质软骨脱细胞基质甲苯胺蓝染色200×；

图9示组织工程透明质软骨脱细胞基质he染色200×；

图10示组织工程软骨、组织工程脱细胞基质、天然软骨脱细胞基质的dna含量测定；

图11示对比例1天然软骨脱细胞基质ii型胶原染色200×；

图12示对比例1天然软骨脱细胞基质甲苯胺蓝染色200×；

图13示对比例1天然软骨脱细胞基质he染色200×；

图14示对比例2常规组织工程软骨i型胶原染色200×；

图15示对比例2常规组织工程软骨ii型胶原染色200×。

具体实施方式

本发明提供了一种软骨脱细胞基质的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1软骨原代培养

用手术刀将新鲜猪软骨划成多个小块，从下往上将一块块软骨撬出来，置于1×双抗的pbs溶液中。称重后迅速转移到超净台中。

将1×双抗的pbs替换成10×双抗的pbs溶液，用力摇晃装有软骨的离心管，持续10s。将软骨转移到转移到100mm的培养皿中。用1ml枪头弃掉溶液，添加新的1×双抗的pbs，用一个干净的手术刀以及镊子将软骨片的内表面刮干净，弃掉pbs。

向处理干净的软骨片中加入10mlcm培养基，将软骨片切成米粒大小的碎片，置于培养箱中待消化。弃掉cm培养基，添加15ml的1mg/mlii型胶原酶溶液。放在孵箱中摇床上，37℃消化14h(50rpm)。

消化结束，用1ml枪头将消化软骨组织的消化液转移至50ml离心管中。细胞计数后，1100rpm离心5min，去除上清，添加cm培养基。接种在培养皿中，置于培养箱中培养。接种的第2天，弃掉软骨细胞培养基，用pbs冲洗一遍，添加培养基继续培养。培养至第8天，软骨细胞融合度达到95％，如图1所示。

实施例2组织工程软骨的制备与检测

一、软骨细胞三维培养

(1)琼脂糖包被培养板

琼脂糖用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存，凝固使用后使用。

(2)明胶基质包被培养皿

明胶基质用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存。凝固后使用。

(3)消化软骨细胞

胰蛋白酶提前置于37℃预热，消化软骨细胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用cm培养基与胰蛋白酶1：1的比例终止消化。细胞用计数板计数，1100rpm，5min离心细胞，去上清。

(4)细胞用海藻酸钠溶液重悬

以2×10⁶个细胞/ml海藻酸钠溶液(质量分数为1.5％，粘稠度为20～500cps)的比例，向细胞中加入海藻酸钠溶液，重悬细胞。

(5)将细胞悬液加入到明胶基质包被的24孔板中，每孔400μl细胞悬液，往培养板孔中间加入，避免产生气泡，旋转培养板，使得细胞悬液铺满孔。置于4℃，4min。

(6)4min后取出培养板，向有细胞的孔壁上轻缓旋转地加入400μl200mmcacl2溶液/每孔。置于4℃，4min。

(7)提前向包被琼脂糖的24孔板中每孔加入1mlcc培养基。用小勺子将凝固的细胞凝胶块转移到琼脂糖包被的24孔板中培养。每隔2～3天换液，共培养20天，可以得到透明软骨。如图2和图3所示。

二、透明软骨的鉴定

①ii型胶原免疫组化检测软骨中细胞核的含量以及ii型胶原的情况：

1.4μm石蜡切片常规脱蜡至水；2.pbs洗3×3min；3.3％h2o2室温20min，pbs洗3×3min；4.消化4％胃蛋白醇60min，pbs洗3×3min；5.一抗1:50，4℃过夜，pbs洗3×3min；6.生物素化猪抗羊igg1:200，37℃，30min；7.pbs洗3×3min；8.streptavidin-hrp，1:20037℃，30min；9.pbs洗3×3min；

10.0.05％dab+0.03％h2o2显色8～12min，水洗；11.苏木素衬染，水洗；12.吹干，树脂封片；13.结果观察：阳性呈棕褐色，背景为紫蓝色。结果如图4。

②甲苯胺蓝染色检测软骨中细胞核的含量以及软骨基质粘多糖(gag)的含量：

1、石蜡切片脱蜡至水；2、蒸馏水浸洗3次；3、0.1％甲苯胺蓝液浸染10min；4、水洗，洗去多余染液；5、各级酒精脱水；6、二甲苯透明，中性树胶封固。结果如图5

③he染色检测软骨中细胞核的含量：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ10min-无水乙醇ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。2、苏木素染细胞核：切片入harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。3、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。4、脱水封片：将切片依次放入95％酒精i5min-95％酒精ii5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。结果如图6。

实施例3脱细胞处理

对软骨行如下处理:①将软骨置入tris-hcl(ph7.4)缓冲液中,缓冲液内含蛋白酶抑制剂(质量分数为0.035％的pmsf),4℃恒温震荡48小时；②2％sds的低渗tris–hcl缓冲溶液(体积/体积)内加蛋白酶抑制剂(质量分数为0.035％的pmsf),4℃恒温震荡48小时后取出，以蒸馏水连续冲洗24小时；③1g/lrnasea、500u/mldnasei混合消化酶液37℃消化4小时；④置入含1％tritonx-100的低渗tris–hcl缓冲溶液中，4℃消化24小时，取出后蒸馏水连续冲洗48小时，完成对软骨的脱细胞处理，即成为软骨脱细胞基质(cartilageacellularmatrix；cacm)。

①ii型胶原免疫组化检测软骨中ii型胶原的情况，方法同实施例2，结果如图7，未脱细胞透明质软骨和脱细胞透明质软骨进行ii型胶原，从实验结果中可以看出，未脱细胞透明质软骨和脱细胞透明质软骨的ii型胶原含量差不多，但是脱细胞组中软骨陷窝里面看不到细胞核的存在，而脱细胞组可以明显的看到细胞核的存在，即脱细胞组的透明质软骨细胞被脱掉。

②甲苯胺蓝染色检测软骨中细胞核的含量，方法同实施例2，结果如图8；从甲苯胺蓝染色可以看出，未脱细胞的透明质软骨比脱细胞组甲苯胺蓝含量要多，但是脱细胞组软骨陷窝里看不到细胞核的存在，即无细胞的存在，代表透明质软骨中的细胞被脱掉。

③he染色检测软骨中细胞核的含量，方法同实施例2，结果如图9；

从he染色可以看出，未脱细胞的透明质软骨陷窝里看能够看到细胞核的存在，而脱细胞的透明质软骨无细胞的存在，代表透明质软骨中的细胞被脱掉。

④将制备的脱细胞透明质软骨基质(ecm)(n＝3)以及未脱细胞的透明质软骨(n＝3)，经50mm柠檬酸钠溶液溶解，2000r/min，离心10min，弃上清，加入乙二胺四乙酸和木瓜蛋白酶在65℃水浴中裂解72小时，10000r/min，5min离心取上清，样本加入等量hoechst33258，以小牛胸腺提取的dna作为标准品，荧光比色定量检测样本中dna的含量，如图10，表1。

对比例1

将猪膝关节软骨进行反复冲洗，并放粉碎机中进行粉碎，然后放入ph7.5、温度为4℃无菌pbs中浸泡，离心5min，速度2000rpm，去除沉淀。将上层软骨碎片再次进行5min离心，速度为8000rpm，筛选出直径在100-154μm的软骨粒，根据改进的courtman改良法进行脱细胞处理。①向获得的软骨粒中加入含浓度为0.25％胰蛋白酶和0.03％edta的pbs，震荡1h，离心3次，速度为7000rpm，采用pbs进行冲洗。②在4℃下加入浓度为1％的tritonx-100及10mm的tris-hcl(ph＝7.5)和浓度为0.035％的pmsf，震荡24-72h，离心后采用pbs冲洗。③在37℃下放入浓度为50u/mldna酶及1u/mlrna酶，消化12h，离心后采用pbs冲洗。④在温度4℃下加入浓度为1％的tritonx-100的10mm的tris-hcl(ph＝7.5)，震荡24h、冲洗后获得白色粉末状沉淀。将其放入磨具中，冷冻、烘干后获得脱细胞基质。

①ii型胶原免疫组化检测软骨中ii型胶原的情况，方法同实施例2，结果如图11，天然软骨脱细胞基质和组织工程软骨脱细胞基质进行ii型胶原检测，从实验结果中可以看出，天然软骨脱细胞基质比组织工程软骨脱细胞的ii型胶原含量要少，且组织工程软骨脱细胞基质中的软骨陷窝里面看不到细胞核的存在，而天然软骨脱细胞基质组可以明显的看到细胞核的存在，即组织工程软骨比透明质软骨更易脱掉细胞。

②甲苯胺蓝染色检测软骨中细胞核的含量

甲苯胺蓝染色检测软骨中细胞核的含量，方法同实施例2，结果如图12；从甲苯胺蓝染色可以看出，组织工程软骨脱细胞基质种的gag含量比天然软骨脱细胞基质中的含量多。且组织工程软骨脱细胞基质中的软骨陷窝里面看不到细胞核的存在，而天然软骨脱细胞基质组可以明显的看到细胞核的存在，即组织工程软骨比透明质软骨更易脱掉细胞。

③he染色检测软骨中细胞核的含量

甲苯胺蓝染色检测软骨中细胞核的含量，方法同实施例2，结果如图13；从he染色结果中看出，组织工程软骨脱细胞基质中的软骨陷窝里面看不到细胞核的存在，而天然软骨脱细胞基质组可以明显的看到细胞核的存在，即进一步说明组织工程软骨比透明质软骨更易脱掉细胞。

④dna含量测定

dna含量测定检测软骨中细胞核(或者dna的含量)的含量，方法同实施例2，结果如图10，表1。从结果中可以看出，与组织工程软骨脱细胞基质相比，天然软骨脱细胞基质中含较多的dna。即天然软骨脱细胞不彻底。

对比例2软骨细胞团块培养法(常规组织工程软骨培养方法)

1、消化软骨细胞

原代猪软骨细胞培养至第8天，软骨细胞融合度达到95％。胰蛋白酶提前置于37℃预热，消化软骨细胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用cm培养基与胰蛋白酶1：1的比例终止消化。细胞用计数板计数，1100rpm，5min离心细胞，去上清。

2、软骨细胞团块培养

取3×10⁵个/团于锥形管中，120g离心，于培养基中培养(开盖，置于培养箱中)。2天后，团块转移到未包被的24孔板中，进一步使其分化。

其中培养基为dmem/f12，1％双抗，1％neaa，1％(its)，1％维生素c，10ng/mltgf-β3。培养至第20天，细胞团块形成组织。

3、脱细胞处理

实验步骤如本实施例3。

试验效果：

表1软骨dna含量的测定

表1中数据来自以实施例2制备的组织工程软骨，经实施例3的脱细胞处理；天然软骨来自实施例1获取的猪天然软骨；常规组织工程软骨来自对比例2中的细胞团块培养方法获得的组织工程软骨。

结果可以看出，未脱细胞组(untreated)的组织工程软骨可以检测到dna(100％，浓度为400ng/mg)。而脱细胞组的组织工程软骨并未检测到dna的存在(0％，浓度为0ng/mg)，即不存在细胞。常规组织工程软骨脱细胞之后检测dna残余37.5％，含量远远大于本实施例2中的组织工程软骨脱细胞基质dna含量。即本实施例2中的组织工程软骨较常规组织工程软骨易于脱细胞处理。

并且，实施例3制备的组织工程软骨组织结构良好，细胞分布均匀。与天然软骨相比，实施例3的组织工程软骨呈现海绵状的疏松状态。能够和周围的软骨组织很好的接触，并且细胞易于脱去；且可以根据需要裁剪成相应规格的软骨；更重要的是，实施例3制得的是透明质软骨，分泌的ii型胶原含量高，即主要形成透明质软骨(成分与天然软骨相似)。而常规组织工程软骨(对比例2)则细胞排列紧密，细胞不易脱去。形状不规则，与周围组织不能形成很好的接触。团块中的i型胶原含量高，即形成了含量较高的纤维软骨。与实施例3比较，以相同细胞接种量、相同的培养时间进行三维培养，对比例2中的细胞生长较慢，形成的团块较小。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。