一种三唑并吡嗪类化合物的新应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体的涉及一种小分子化合物的医药应用领域

背景技术：

akr1b10属于醛酮还原酶超家族(aldo-ketoreductase，akr)的成员，akr是烟酰胺嘌呤二核苷酸nad(p)(h)依赖的氧化还原酶，主要催化醛或者酮的羰基还原成一级或者二级醇，是体内一级代谢酶。研究发现，akr1b10在多种肿瘤组织和细胞中异常表达：在84％的鳞状细胞肺癌(squamouscellpulmonarycarcinomas)，70％的胰腺癌(pancreaticadenocarcinomas)及54％的有潜在肝硬化和病毒性肝炎的早期肝癌中过表达；另外，在子宫癌、胆管癌、胰腺癌、早期胃癌和食管癌肿瘤组织中，akr1b10的表达水平上调。实验表明，akr1b10表达上调可能会促进肿瘤的发生和发展。从220例乳腺癌患者的25年完整临床病理研究中观察到：akr1b10的表达水平与肿瘤组织大小、淋巴结转移程度是正相关的，而与患者生存期呈现负相关。sirna介导的akr1b10基因沉默可抑制肝癌hcc细胞、大肠癌、肺癌和乳腺癌bt-20细胞的生长，并可抑制乳腺癌雌裸鼠和肝癌移植小鼠的肿瘤生长。akr1b10可以催化多种醛酮类化合物，包括芳香醛(aromaticaldehydes)，甲基乙二醛(methylglyoxal)，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal)，反式-2-己醛(trans-2-hexanal)等化合物。这些羰基类化合物具有高度亲电性，可以与蛋白质、dna等生物大分子结合，形成非特异性共价修饰耦合物，引起蛋白质功能紊乱和dna损伤，导致病理反应。

由于akr1b10在肿瘤组织中异常表达、促进肿瘤发生和发展，同时又具有被分泌到细胞外的特异性分泌机制，被认为是潜在的抗癌靶标和癌症诊断标记物，因此积极寻找和设计新的akr1b10抑制剂的肿瘤药物具有重要的理论意义和实际价值。目前，从天然产物中发现的akr1b10抑制剂如多酚类、五环三萜类和倒捻子素类化合物，以及内源性甾体激素类，胆汁酸及其代谢产物等对akr1b10有较强的抑制能力。甲酸类非甾体抗炎药对akr1b10有一定的抑制能力和明显的akr1b1选择性。基于akr1b10/tolrestat结构的虚拟筛选方法得到的色烯-3-甲酰胺类化合物和2-苯基亚氨基苯并吡喃类是已知活性最高的akr1b10抑制剂(最小ic50值为6nm)，但对akr1b1也有高度抑制活性。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明提供了一种小分子化合物——7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮或其可药用盐在制备用于治疗与akr1b10相关的癌症疾病的药物中的用途，其中所述7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮的结构式如下：

式i化合物或其药学可接受的盐在制备抑制akr1b10活性药物中的应用

本发明所述药学可接受的盐7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮与无机酸或有机酸中的一种或两种以上形成的药学上可接受的盐，该盐为酸加成盐。

本发明所述无机酸优选为盐酸、磷酸和硫酸。

本发明所述有机酸优选为醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。

本发明还提供一种药物，该药物由7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮或其药学可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂组成,所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本发明药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明所述的药物在制备抑制akr1b10活性药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明提供的制备抑制akr1b10活性药物，该药物通过抑制akr1b10活性治疗或预防多种肿瘤。所述肿瘤包括鳞状细胞肺癌、胰腺癌、肝癌、子宫癌、胆管癌、胰腺癌、胃癌和食管癌。

本发明还提供一种akr1b10抑制剂，该抑制剂通过抑制akr1b10活性治疗或预防多种肿瘤。

本发明所述药物还具有治疗或预防，与akr1b10活性相关的肿瘤细胞的增殖和抗凋亡的作用。

本发明所述药物还具有通过抑制akr1b10活性治疗或预防肝硬化和\或病毒性肝炎的作用。

本发明对上述小分子化合物进行了生物学活性测定，发现其对akr1b10具有明显的抑制活性，ic50值达到了5.9μm，此外该分组对akr醛酮还原酶家族中的另一位成员akr1b1具有较弱的抑制活性，ic50值达到了31.47μm，因此该化合物可以作为akr1b10选择性抑制剂。

本发明中的小分子化合物7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮具备akr1b10抑制剂的功能，对与akr1b10相关的癌症疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与akr1b10相关的抗肿瘤药物。也可以用于制备akr1b10相关肝硬化和\或病毒性肝炎的药物。

附图说明

图1：为实施例1中化合物对akr1b10的酶抑制活性曲线。

图2：为实施例2中化合物对akr1b1的酶抑制活性曲线。

图3：为实施例3中化合物对肝癌hcc细胞存活率抑制活性曲线。

具体实施方式

下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。

实施例1：化合物对akr1b10的酶抑制活性实验。

实验原理：根据辅酶nadph随着akr1b10催化醛酮类底物还原反应的进行转化为nadp⁺这一特点设计。由于nadph在340nm处有特征最大紫外吸收峰值，而产物nadp+在此波长处吸收很弱，故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶nadph的消减程度，从而获得酶催化反应的速度。在反应初始阶段，340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级反应)，斜率与反应速度成正比。

当加入化合物后，反应速度降低，证明化合物对akr1b10的催化有抑制作用。

实验试剂的准备：吡啶-3-醛、nadph、nadp⁺购自sigma-aldrich公司。

实验步骤：

1)配置反应液

用pbs-buffer(0.1mpotassiumphosphate,ph7.4)配制浓度0.15mm的nadph反应液；

2)确定酶akr1b10稀释比例

取930μlnadph反应液，加入20μl稀释后akr1b10，30℃恒温5min后，加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。探索不同稀释比例，至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜率数值约为0.2。最终固定酶akr1b10浓度为0.5μμ左右；

3)配置酶反应溶液

按照步骤2所得酶稀释比例，用nadph反应液稀释酶至反应浓度(0.5μμ)，配成酶反应溶液；

4)化合物ic50测定

为了测试化合物对akr1b10酶活性的抑制效应，将浓度为15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.46875、0.234375μm的化合物分别添加到包含重组人类akr1b10的比色皿中。按照酶反应溶液：底物溶液＝950:50体积比混合反应体系，测试过程先将酶反应溶液和化合物混合均匀后在30℃下恒温5min后,加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。采用tecaninfinitem1000酶标仪在340nm波长下进行5min吸光度测试。

实验结果：将浓度为15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.46875、0.234375μm的7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮进行akr1b10的酶抑制活性实验，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度ic50为1.637μm/l(如图1所示)。

实施例2：化合物对akr1b1的酶抑制活性实验。

实验原理：根据辅酶nadph随着akr1b1催化醛酮类底物还原反应的进行转化为nadp⁺这一特点设计。由于nadph在340nm处有特征最大紫外吸收峰值，而产物nadp+在此波长处吸收很弱，故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶nadph的消减程度，从而获得酶催化反应的速度。在反应初始阶段，340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级反应)，斜率与反应速度成正比。

当加入化合物后，反应速度降低，证明化合物对akr1b1的催化有抑制作用。

实验步骤：

1)配置反应液

用pbs-buffer(0.1mpotassiumphosphate,ph7.4)配制浓度0.15mm的nadph反应液；

2)确定稀释比例

取930μlnadph反应液，加入20μl稀释后akr1b1混合均匀后在30℃下恒温5min后，加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。探索不同稀释比例，至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜率数值约为0.2。最终固定酶akr1b1浓度为0.5μμ左右；

3)配置酶反应溶液

按照步骤2所得酶稀释比例，用nadph反应液稀释酶akr1b1至反应浓度0.5μm，配成酶反应溶液；

4)化合物ic50测定

为了测试化合物对akr1b10酶活性的抑制效应，将浓度为1、5、10、25、50和100μm的化合物分别添加到包含重组人类akr1b10的比色皿中。按照酶反应溶液:底物溶液＝950:50体积比混合反应体系。测试过程先将酶反应溶液和化合物混合均匀后在30℃下恒温5min,加50μl底物吡啶-3-醛启动反应。采用tecaninfinitem1000酶标仪在340nm波长下进行5min吸光度测试。

实验结果：实验结果：将浓度为75、37.5、18.75、9.375、4.6875、2.34375、1.171875的7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮进行akr1b1的酶抑制活性实验，发现该化合物有较弱的抑制活性，其半抑制浓度ic50为50.23μm/l(如图2所示)。

实施例3：mtt法检测化合物体外对肝癌肿瘤细胞hcc存活率的影响。

实验原理：mtt，商品名噻唑蓝，全称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide。mtt比色法，是一种检测细胞生存活力的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映存活细胞的数量。在一定范围内，mtt结晶形成的量与细胞存活数成正比。

实验试剂的准备：肝癌肿瘤细胞hcc细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，mtt购自sigma-aldrich公司。

实验步骤：

1)细胞培养

取对数生长期的细胞，按8×10³个/孔接种于96孔板，放置于37℃，含5％co2的细胞培养箱中进行培养。

2)测定化合物对肝癌肿瘤细胞hcc的ic50。

待细胞适应生长12h后，加入100μl含不同浓度化合物的新鲜培养基(化合物的终浓度为150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875、2.34375μm)，每个剂量组至少设3个平行复孔，于37℃培养箱中继续培养24h后，每孔加入10μlmtt溶液(0.5mg/ml,pbs配制)，继续培养4h。2000rmp离心5min，小心弃上清，每孔加入200μldmso溶解甲簪沉淀，微型振荡器振荡10min充分混匀后，用酶标仪在570nm波长下测定光密度值(od)，并计算细胞存活率及ic50值。细胞存活率％＝100％-(od对照组-od药物组)/od对照组×100％。根据计算，能够得在不同浓度的受试化合物作用下细胞的存活率，据此结果绘制曲线，计算该受试化合物诱导50％细胞死亡时的浓度，即为ic50值。

实验结果：将浓度为150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875、2.34375μm的7-(3-氟苯基)-3-((2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-2-羰基乙基)硫代)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8(7h)-酮对肝癌肿瘤细胞hcc进行细胞存活率测试，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度ic50为112.5μm/l(如图3所示)。