本发明通常涉及可用于癌症和其它免疫紊乱的靶向治疗的通用免疫疗法组合物。
相关申请
本申请主张2016年2月16日提交的美国临时专利申请US62/295,867的优先权和权益，该临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
政府权益
本发明在美国国家癌症研究所(CA185151-02)和国家卫生研究院(DK105602-01)支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
临床试验已经证实，癌症免疫疗法可在罹患晚期癌症的患者体内诱发持久应答。最成功的癌症免疫疗法之一是使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞来治疗B细胞来源白血病和淋巴瘤。被用来对抗这些癌症的嵌合体是单链抗体，对于融合至CD28(一种T细胞共刺激蛋白)并随后融合至CD3ζ(Τ细胞受体(TCR)信号传导蛋白)的CD19为特异性。表达这一构造的T细胞接收初级和二级信号，且生成对抗包括正常化B细胞在内的所有表达CD19的细胞的强健的免疫应答。迄今为止，CAR T细胞疗法仅在对抗部分实体肿瘤中取得适度的成功，这是因为该疗法非常难以鉴别被独特地表达在肿瘤上而非未转换细胞上的抗原。尽管我们能够以肿瘤抗原为唯一靶向，但对于每一位患者，绝大多数突变是个体化且独特的。因此，生成识别每一患者的肿瘤新抗原的TCR或抗体将会是困难的且花费巨大。本发明解决这一问题。
技术实现要素：
在多种态样下，本发明提供具有肿瘤抗原特异性的结合分子，其中，该结合分子包括链接至保护域的识别域。该识别域特异性地结合至次级结合分子。在一些态样下，该次级结合分子位于细胞上。该细胞是，例如，嵌合抗原受体T细胞(CART)、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞或天然杀手细胞。
该结合分子是抗体、亲合体、适配体或T-细胞受体(TCR)多聚体。该抗体是Fab或scFV。该TCR多聚体是四聚体。
在一些态样下，该保护域包括链接至蛋白酶易感肽的承载域。该蛋白酶易感肽是肿瘤蛋白酶特异的。或者，该保护域是pH敏感的。该识别域被链接至该保护域，因此，当该保护域与蛋白酶接触或处于特定pH时，该识别域暴露。
该承载域是聚合物，如PEG-二丙烯酸酯。
该识别域是小分子。在一些态样下，该识别域是多聚体。例如，该识别域是天然出现的无机或有机化合物、合成的无机或有机化合物、生物分子。该生物分子是药物、毒素、激素、金属、细胞因子、肽或核酸。例示性的识别域包括苯丙胺、苯二氮平、苯甲酰爱康宁、丁丙诺啡、阿片样物质、大麻酚类化合物、苯环己哌啶、三环抗抑郁药物、右美沙芬、芬太尼、眠尔通、美沙酮、甲基苯丙胺、氧可酮、THC、曲马多、唑吡坦、氯胺酮、LSD、MDMA、甲喹酮、丙氧芬或诺克替明(norketimine)。
其它态样下，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞内信号传导域、跨膜域和能结合识别域的胞外域。该胞外域是抗体，如Fab或scFV。该跨膜域进一步包含位于该胞外域与该跨膜域之间的柄区。该跨膜域包括CD28。
该CAR进一步包括一个或多个位于该跨膜域与该细胞内信号传导域之间的额外的共刺激分子。该共刺激分子是，例如，CD28、4-1BB、4-1BBL、ICOS、或OX40。
多种态样下，该细胞内信号传导域包含CD3ζ链。
还提供一种编码根据本发明的CAR的核酸、包括该核酸的载体和含有该载体的细胞。该细胞是T细胞，例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞、调节T细胞(Treg)或卵泡调节T细胞(TFR)。
其它态样下，本发明提供一种经基因工程加工的细胞，其将根据本发明的嵌合抗原受体表达并荷载在细胞表面膜上。该细胞是T细胞，例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞、调节T细胞(Treg)或卵泡调节T细胞(TFR)。
其它态样下，本发明提供一种药物组合物，其含有根据本发明的经基因工程加工的细胞群。
又一态样下，本发明提供一种包括具有肿瘤抗原特异性的结合分子以及嵌合抗原受体(CAR)的系统，其中，该结合分子具有链接至保护域的识别域，且该CAR具有细胞内信号传导域、跨膜域、和能特异性结合至该识别域的胞外域。一些态样下，该CAR被表达在细胞上。该细胞是T细胞，例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞、调节T细胞(Treg)或卵泡调节T细胞(TFR)。
其它态样下，本发明提供一种包括具有肿瘤抗原特异性的结合分子以及嵌合抗原受体(CAR)的系统，其中，该结合分子包含(i)抑制该结合分子结合至该肿瘤抗原的可裂解的掩蔽部分和(ii)识别域；且该嵌合抗原受体(CAR)具有细胞内信号传导域、跨膜域、和能特异性结合至该识别域的胞外域。
高结合分子是抗体、亲合体、适配体或T细胞受体(TCR)多聚体。该抗体是Fab或scFV。该TCR多聚体是四聚体。
该可裂解的掩蔽部分是蛋白酶易感肽。
再其它态样下，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包含在第一时期向该受试者给药根据本发明的结合分子，以及在第二时期向该受试者给药根据本发明的CAR。
另一态样下，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，该方法包括在第一时期向该受试者给药具有肿瘤抗原特异性的结合分子，其中，该结合分子包含(i)抑制该结合分子结合至该肿瘤抗原的可裂解的掩蔽部分和(ii)识别域；以及，在第二时期向该受试者给药嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含细胞内信号传导域、跨膜域、和能特异性结合至该识别域的胞外域。
除非另作界定，本文中使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员一般理解者相同的意义。尽管可使用与本文中揭示者类似的方法和材料来实践本发明，适当的方法和材料如下文所述。本文中提及的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入本文。若有冲突，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，本文中揭示的材料、方法和实施例仅用于例示性说明，而非试图限制。
本发明的其它特征和优势将通过下述说明书和权利要求书获知并为该说明书和权利要求书所涵盖。
附图说明
图1举例说明用以诱导肿瘤特异性T细胞应答的蛋白酶特异性暴露策略。
图2举例说明指向被暴露的抗原的用于肿瘤靶向免疫疗法的通用CAR T细胞。
图3举例说明抗原的pH依赖性暴露。
图4举例说明用以界定肿瘤的蛋白酶分泌的试验。
图5举例说明用以界定肿瘤的蛋白酶分泌的试验。
图6是BAT-CAR策略的示意图呈现。BAT-CAR具有对于合成抗原的特异性，其与肿瘤靶向抗体偶合。通过含有蛋白酶敏感位点的“掩体”，保护该合成抗原不被T细胞识别。当该肿瘤靶向抗体结合至肿瘤时，肿瘤来源的蛋白质降解该掩体。因此，该合成抗原变得容易通过该BAT-CAR T细胞识别，之后被激活以引导对抗该肿瘤的免疫应答。使用可从http://wmv.servier.com/Powerpoint-image-bank自由获得的图示模板生成图6、图7、图8和图10。
图7是本专利中使用的BAT-CAR T细胞和CAR模块实例的示意图呈现。
图8是以抗FITC或抗AQ CAR模块转导的S8C细胞群的激活。FACS分析，CD69过表达作为读数。
图9是可裂解的肽结构、偶合至BAT-CAR平台的策略、及携带蒽醌-2-酯分子(CP(AQ))的该可裂解的肽和携带相同分子(pCP(AQ))的裂解后的肽的化学结构的示意图呈现。
图10是用以核实CU结合至TTU的不同CU/TTU组合的示意图呈现。
图11是通过Alexa fluor 647标记的TTU进行的HER2+细胞染色。FACS分析，在冰上孵化30分钟后的Alexa fluor 647信号作为读数。
图12上图为以CU*FITC-PEG2-C(AQ)-PEG24*A647±未标记的TTU进行的HER2+细胞染色。FACS分析，FITC读数。下图为以相同的CU*FITC-PEG2-C(AQ)-PEG24*A647±未标记的TTU染色的两个不同的HER2+细胞群的信号强度的比较。FACS分析，FITC信号作为读数，两个时间点：在冰上孵化30分钟(红色)和在37℃/5％CO2孵化8小时。
图13是携带蒽醌(AQ)小分子的肽、裂解后的肽(pCP(AQ))和可裂解的肽(CP(AQ))的序列。
具体实施方式
本发明涉及通用的治疗癌症和其它免疫紊乱如自体免疫疾病和移植物抗宿主疾病的免疫疗法系统、组合物、以及方法。
癌症免疫疗法的最大障碍之一，是鉴别被独特地表达在肿瘤组织上而非表达在正常的健康组织上的抗原。本发明通过利用若干技术创新来创造有效且通用的CAR T细胞疗法系统而克服这些挑战。具体而言，本发明提供可检测肿瘤上的任何抗体且可生成对抗该肿瘤的免疫反应性而没有脱靶组织效果的系统试剂。
简而言之，在多种态样下，本发明由三个基本部分组成：(1)肿瘤靶向结合分子、(2)被掩蔽的小分子、和(3)对该小分子为特异性的CAR T细胞。该掩体对于该肿瘤分泌的生物分子(如，蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶)敏感或对造成该小分子“暴露”的pH敏感。
总体测量以示意图呈现在图1中。一系列二项事件决定CAR T细胞是否被该合成小分子激活。这些使用嵌合抗原受体(BAT-CAR)进行二项激活的T细胞在该小分子不存在时应为完全惰性，且仅在该小分子被暴露处被激活。可调整本发明的系统和组合物，以引导T细胞应答以患者特异性方式对抗任何实体肿瘤。
本发明的另一情形为，任何嵌合细胞内抗体可经工程化以受到给药小分子的刺激。换言之，单链抗体与任何细胞内受体的融合可产生新颖的嵌合受体。因此，给药被该单链抗体识别的小分子可刺激靶点细胞内的下游效应，而该效应是以其天然配体刺激该受体所特有的。本发明中，可通过给药小分子令T细胞受体信号传导成为可能。换言之，给药被该融合至T细胞信号传导分子(例如CD28和CD3ζ，但不是唯一)的单链抗体识别的小分子，导致作为T细胞受体信号传导代表的T细胞中的标识变化。通过制作结合单链抗体的小分子与任何细胞受体的嵌合体，可通过给药被该单链抗体识别的小分子诱导特异性的生物学后果。
根据本发明的试剂在不具有新抗原先验信息的肿瘤内特异性地生成T细胞导向的免疫应答。通过用于抗原的结合分子以肿瘤为靶点，该抗原是肿瘤所富集的但无需是肿瘤独有的。这一结合分子将偶合至药理学惰性的小分子。该小分子用作使用细胞外结合域工程化的通用CAR T细胞的靶点，且该细胞外结合域对于该小分子是特异性的。本文中指代为“使用嵌合抗原受体二项激活的T细胞(binary activated t cells using chimeric antigen receptors,BAT-CAR)”的这一通用CAR T细胞，在该小分子不存在时为完全惰性。使用缀合有结合分子的被掩蔽的小分子对患者进行全身性治疗，将输送该小分子至该肿瘤，创建用于该BAT-CARS的独特靶点。为了防止该BAT-CAR T细胞的脱靶激活，使用“触发”聚合物(如，酶敏感的聚合物或pH敏感的聚合物)掩蔽该小分子。当完整时，该聚合物防止该小分子结合并激活该BAT-CAR T细胞。但是，肿瘤局部地分泌蛋白酶，而该蛋白酶消化蛋白酶敏感的“触发”聚合物，从而仅仅暴露处于该肿瘤位点处的该小分子。在pH敏感性肿瘤的情况下，与生理学pH相比，该肿瘤的微酸性pH微环境消化pH敏感的“触发”聚合物，从而仅仅暴露处于该肿瘤位点处的该小分子。
一种替代途径中，将使用触发聚合物掩蔽该结合分子的结合位点，因此抑制该结合分子结合至肿瘤抗原。与使用被掩蔽的小分子的情形相同，肿瘤特异性的蛋白酶或pH将消化该除非聚合物，从而令该结合分子结合至该肿瘤。该小分子结合并激活BAT-CAR T细胞。
结合分子
根据本发明的结合分子具有对于肿瘤抗原的结合特异性。本文中，结合分子也称为“肿瘤靶向单元”。结合分子能结合至生物学整体如膜组分、细胞表面受体、抗原等或以其它方式与之关联。该结合分子的特异性允许该集合分子变为定位在特定的靶向位点，例如，肿瘤、疾病部位、组织、器官、细胞类型等。
本文中，术语“结合(bind)”或“结合(binding)”指的是，典型由于特异性或非特异性结合或相互作用而展现相互亲和性或结合能力的相应成对分子或其部分之间的相互作用，包括但不限于，生物化学、生理学、及/或化学相互作用。“生物结合”定义一种出现在成对分子之间的相互作用类型，该分子包括蛋白质、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素等。术语“结合配偶体”指的是可与特定分子进行结合的分子。“特异性结合”指的是分子，该分子结合至或识别结合配偶体(或有限数量的结合配偶体)的结合或识别程度是指上高于另一相似的生物学整体。
结合分子包括但不限于，抗体分子、受体配体、肽、半抗原、适配体、亲和体、T细胞受体四聚体和该领域技术人员已知的其它靶向分子。例如，预期该结合分子可包括核酸、多肽、糖蛋白、碳水化合物、或脂质。
结合分子可以是抗体，该术语倾向于包括抗体片段。例如，抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段、合成的稳定化Fv片段，如单链Fv片段(scFv)、二硫化物稳定化的Fv片段(dsFv)、单可变区结构域(dAbs)微抗体、组合抗体和多价抗体如双体抗体和多-scFv、来自骆驼科动物或工程化人类等价物的单结构域。通过传统免疫法(如，多克隆血清和杂交瘤)制作抗体；或将抗体制作为重组片段，在从噬菌体展示库或核糖体展示库中选择之后，一般表达在大肠杆菌中。或者，可在从产生双体抗体的细菌菌落创建的基质模板中生成包含VH域与VL域的非共价关联的“组合抗体”。术语“抗体”还包括任何具有结合域的蛋白质，且该结合域与免疫球蛋白结合域是同源的或大部分同源的。这些蛋白可源自天然来源，或部分或全部为合成生成。
例如，该结合分子是亲和体。亲和体是被工程化以展示肽环圈的小的、高度稳定的蛋白质，其向特异性靶点蛋白提供高亲和性结合表面。它是源自胱蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的低分子量蛋白质，分子量为12至14kDa。亲和体蛋白由支架构成，它是基于胱抑素蛋白质折叠的稳定蛋白质。它们显示两个肽环圈和N端序列，可任意排列，从而以类似于抗体的高亲和性和特异性结合不同靶点蛋白。当该蛋白支架约束该肽可能采取的构象时，该肽被稳定化，由此比游离肽增加结合亲和性和特异性。
例如，结合分子可以是结合至细胞类型特异性标记物的核酸结合分子(如，适配体)。通常，适配体是结合至特定靶点如多肽的寡核苷酸(如，DNA、RNA、或其类似物或衍生物)。适配体是短的合成单链寡核苷酸，其特异性结合至多种分子靶点如小分子、蛋白质、核酸、甚至细胞及组织。这些小的核酸分子可形成能特异性结合蛋白或其它细胞靶点的二级结构和三级结构，且本质上是抗体的化学等价物。适配体的特异性高，尺寸相对小，且不产生免疫性。通常使用作为SELEX而为人所知的生物淘选方法选择适配体(指数富集的配体系统性进化技术)(Ellington et al.Nature.1990；346(6287):818-822；Tuerk et al.,Science.1990；249(4968):505-510；Ni et al.,Curr Med Che 2011；18(27):4206-14；该文献通过引用而以其整体并入本文)。生成用于任何给定靶点的适配体的方法是该领域中周知的。
一些具体实施例中，结合分子可以是用于细胞表面受体的天然出现的配体或合成的配体。
一些具体实施例中，该靶向分子是碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是经衍生的天然碳水化合物。一些具体实施例中，该碳水化合物包含单糖或二糖，包括但不限于，葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、或神经氨酸。一些具体实施例中，该碳水化合物是多糖，例如但不限于，支链淀粉、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环糊精、糖原、淀粉、羟乙基淀粉、卡拉胶、聚糖、直链淀粉、壳聚糖、N,O-羧甲基壳聚糖、褐藻胶和藻酸、淀粉、甲壳素、肝素、魔芋胶、葡甘露聚糖、石耳素、肝素、透明质酸、凝胶多糖、及黄原胶。一些具体实施例中，该碳水化合物是糖醇，例如但不限于，甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、或乳糖醇。
肿瘤抗原意为肿瘤细胞上的任何细胞表面分子。优选为该肿瘤抗原将肿瘤细胞与正常细胞区分开来。通过被独特地表达在肿瘤细胞上或与正常细胞相比过度呈递在肿瘤细胞内，肿瘤抗原可将肿瘤细胞与正常细胞区分开来。肿瘤抗原是多肽、肽(如，MHC肽)、脂质、或碳水化合物。
例示性的肿瘤抗原包括但不限于，Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、肌间线蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白黑色素-A(由T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-Dl、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶M2型同工酶的二聚体形式(肿瘤M2-PK)、异常Ras蛋白、或异常p53蛋白。
识别域
识别域用作通用CAR T细胞的靶点。本文中，该识别域也称为“抗原小分子”。该识别域链接至该结合域，链接模式为不干扰该结合域结合其配体的能力。该识别域是非人的。该识别域直接链接至该结合分子。或者，识别域间接链接至该结合分子(如，经由该保护域或承载域)。该识别域是一个或多个(即，复数个)小分子。该小分子是合成的或天然出现的。该小分子是生物活性的或无生物活性。本文中，短语“生物活性的”指代是在生物系统及/或有机体内具有活性的任何物质的特征。例如，当将物质给药至有机体时，该物质对该有机体具有生物学效果，则认为该物质是生物活性的。优选该小分子不具免疫原性(即，优先倾向于无抗原性)。
在该领域中，“小分子”通常理解为分子量小于约5千道尔顿(Kd)的有机分子。一些具体实施例中，该小分子小于约4Kd、约3Kd、约2Kd、或约1Kd。一些具体实施例中，该小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D、或约100D。一些具体实施例中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol、或小于约500g/mol。
可用于产生识别域的例示性小分子包括异硫氰酸荧光素(FITC)、蒽醌-2-酸、苯丙胺、苯二氮平、苯甲酰爱康宁、丁丙诺啡、阿片样物质、大麻酚类化合物、苯环己哌啶、三环抗抑郁药、右美沙芬、芬太尼、眠尔通、美沙酮、甲基苯丙胺、氧可酮、THC、曲马多、唑吡坦、氯胺酮、LSD、MDMA、甲喹酮、丙氧芬或诺克替明。用于本发明的其它例示性小分子包括
http://www.randoxtoxicology.com/products/biochip-array和
http://www.randoxtoxicology.com/products/biochip-array/doa-I中列举的那些小分子。
保护域
多种具体实施例中，该识别域链接至保护域。本文中，该保护域也称为“掩体”。该保护域用来掩蔽该识别域，以防止该识别域结合并激活BAT CAR。该保护域在整体或局部上是酶(如，蛋白酶)敏感的或pH敏感的。一些具体实施例中，该保护域由一个或多个酶易感位点构成(即，可裂解的肽)或由一个或多个pH易感位点构成。当一个酶易感位点或pH易感位点被曝露于酶如蛋白酶或特定的pH时，该试剂被裂解，因此，该识别域被暴露。
该保护域可由任何材料或尺寸构成，只要其可作为载剂或平台用于该识别域及/或该酶易感位点即可。优选为该材料是非免疫原性的，即，不在将要给药该材料的受试者题呢造成免疫应答。
该保护域在整体或部分上由聚合物或非聚合物材料构成。
该保护域被直接或经由承载域间接链接至该结合分子。适当的载体是该领域中已知的。优选具体实施例中，该承载域使用AkrivisADAPTTM技术(见，WO/2014/100377、WO/2012/177775、和US 20140186850，其内容通过引用而以其整体并入本文)。
一些态样下，该保护域由掩蔽肽和掩蔽聚合物构成。视态样，该保护域进一步包括检测域。
大量生物可降解和生物不可降解的生物相容性聚合物是聚合生物材料、药物控释和组织工程学领域中已知的(见，例如，Vacanti的美国专利US 6,123,727、US 5,804,178、US 5,770,417、US 5,736,372、US 5,716,404；Shastri的美国专利US 6,095,148、US 5,837,752；Anseth的美国专利US 5,902,599；Mikos的美国专利US 5,696,175、US 5,514,378、US 5,512,600；Barrera的美国专利US 5,399,665；Domb的美国专利US 5,019,379；Ron的美国专利US 5,010,167；d'Amore的美国专利US 4,946,929；以及Kohn的美国专利US 4,806,621、US 4,638,045；也见，Langer,Acc.Chem Res.33:94,2000；Langer,J.Control Release 62:7,1999；和Uhrich et al.,Chem Rev.99:3181,1999；上述文献全部通过引用而并入本文)。
聚合物包括但不限于：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基二酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基酯、聚卤化乙烯、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚邻苯二甲酸乙二酯、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯和聚苯乙烯。
生物不可降解聚合物的实例包括乙烯-醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、及其共聚物和混合物。
生物可降解聚合物的实例包括合成聚合物，如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯、聚丁酸、聚戊酸、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)和聚(丙交酯-共-己内酯)；以及天然聚合物，如藻酸盐及其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(化学基团如烷基、烯基的取代、加成、羟化、氧化、以及该领域技术人员通过常规实验做出的其它修饰)、白蛋白及其它亲水性蛋白、玉米蛋白及其它醇溶谷蛋白和疏水性蛋白、其共聚物和混合物。通常，这些材料通过酶促水解或曝露于体内的水中被表面或整体侵蚀而降解。前述材料可单独使用，作为物理混合物(混杂物)使用，或作为共聚物使用。一些具体实施例中，该聚合物是聚酯、聚酐、聚苯乙烯、聚乳酸、聚乙醇酸、以及乳酸与乙醇酸的共聚物及其混杂物。
PVP是一种不可离子化的亲水聚合物，其平均分子量为约10,000至700,000的范围，且其化学式为(C.6H9NO)[n]。PVP也作为聚[1-(2-氧代-1-吡咯烷基)乙烯]、Povidone.TM.、Polyvidone.TM.、RP 143.TM.、Kollidon.TM.、Peregal ST.TM.、Periston.TM.、Plasdone.TM.、Plasmosan.TM.、Protagent.TM.、Subtosan.TM..、和Vinisil.TM..而为人所知。PVP无毒，吸湿性高，且可易溶于水或有机溶剂。
聚乙二醇(PEG)，亦称聚(氧乙烯)二醇，是环氧乙烷与水的缩聚物，其化学通式为HO(CH2CH2O)[n]H。
聚乙烯醇(PVA)是通过以羟基替换醋酸根而从聚醋酸乙烯酯制备的聚合物，具有通式(CH.sub.2CHOH)[n]。大多数聚乙烯醇可溶于水。PEG、PVA和PVP可从化学品供应商如西格玛化学公司(Sigma Chemical Company(St.Louis,Mo.))商购。
某些具体实施例中，该颗粒可包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
该酶易感位点取决于在特定疾病状态中有活性的酶。例如，肿瘤与一组特定的酶相关。如果被分析的疾病状态是肿瘤，则该产品设计为具有与被该肿瘤或其它疾病组织表达的酶匹配的酶易感位点。或者，该酶特异性位点可与普遍存在但在特定疾病状态下不存在的酶有关。这一实例中，疾病状态将与相关酶的信号缺失或信号水平与正常参照物相比下降有关。
本文中，“酶”指的是活体细胞中产生的加速或催化有机体代谢过程的大量蛋白质中的任何蛋白。酶作用于底物。该底物在酶中被称为活性位点的位置与该酶结合，之后立即发生该酶催化的反应。酶包括但不限于，蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、肝素酶、磷酸酶。
可优化该酶易感位点，以向具体的靶点酶提供高催化活性(或其它酶促活性)，而且释放被优化的可检测标记物用于检测。与具体疾病或病症相关的大量其它酶/底物组合是该领域技术人员已知的，且可根据本发明使用。
一些态样下，该酶易感位点是肽(本文中，亦称“掩蔽肽”)。该掩蔽肽包括每裂解位点(即，可裂解的肽)以及一个或多个能链接该掩蔽聚合物与该结合分子(或直接链接或经由承载域链接)的位点
一些方法，该掩蔽肽具有下式：
(AaN1)p1(AaN2)p2(可裂解的肽)q1(AaC1)qAaC2
多种态样下，位于该可裂解的肽的N端侧翼的氨基酸序列具有通式时(AaN1)p1(AaN2)p2，
其中：
p1是选自1至10的整数；
p2是选自2至20的整数；
AaN1在每次出现时为任何氨基酸，优选独立选自赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
AaN2在每次出现时为任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸；以及
AaN2通过肽键链接至该可裂解的肽的N端。
一种具体实施例中，p1是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。一种具体实施例中，p1是1、2、3、4、或5。一种具体实施例中，p1是6、7、8、9、或10。一种具体实施例中，p1是1、2、或3。一种具体实施例中，p1是1或2。一种具体实施例中，p1是1。
一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自赖氨酸、组氨酸和精氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是任何氨基酸，优选为独立选自赖氨酸和组氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自赖氨酸和精氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自组氨酸和精氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是赖氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是组氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是精氨酸。
一种具体实施例中，AaN1在每次出现时独立选自天冬氨酸和谷氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时是天冬氨酸。一种具体实施例中，aN1在每次出现时是谷氨酸。
一种具体实施例中，p1是1，且AaN1是赖氨酸。一种具体实施例中，p1是1，且AaN1是组氨酸。一种具体实施例中，p1是1，且AaN1是精氨酸。一种具体实施例中，p1是1，且AaN1是天冬氨酸。一种具体实施例中，p1是1，且AaN1是谷氨酸。
一种具体实施例中，p1是2，且AaN1在每次出现时独立选自赖氨酸、组氨酸和精氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时独立选自赖氨酸和组氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时独立选自赖氨酸和精氨酸。一种具体实施例中，AaN1在每次出现时独立选自组氨酸和精氨酸。
一种具体实施例中，p1是2，且AaN1在每次出现时独立选自天冬氨酸和谷氨酸。
一种具体实施例中，p2是选自2至10的整数。一种具体实施例中，p2是选自11至20的整数。一种具体实施例中，p2是选自2至5的整数。一种具体实施例中，p2是选自5至10的整数。一种具体实施例中，p2是选自11至15的整数。一种具体实施例中，p2是选自15至20的整数。一种具体实施例中，p2是2、3、或4。一种具体实施例中，p2是2或3。一种具体实施例中，p2是2。
一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是任何氨基酸，优选为独立选自丝氨酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自苏氨酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸和苏氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是丝氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是苏氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是甘氨酸。
一种具体实施例中，AaN2在每次出现时独立选自天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时独立选自天冬酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时独立选自谷氨酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时独立选自天冬酰胺和谷氨酰胺。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是天冬酰胺。一种具体实施例中，AaN2在每次出现时是谷氨酰胺。
多种态样下，位于该可裂解的肽的C端侧翼的氨基酸序列具有通式(AaC1)qAaC2，
其中：
q是选自2至20的整数；
AaC1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸；
Aa C2是能将该掩蔽肽链接至该掩蔽聚合物、结合域或承载域的任何反应性基团。
AaC1通过肽键链接至该可裂解的肽的C端。
一种具体实施例中，q是选自2至10的整数。一种具体实施例中，q是选自11至20的整数。一种具体实施例中，q是选自2至5的整数。一种具体实施例中，q是选自5至10的整数。一种具体实施例中，q是选自11至15的整数。一种具体实施例中，q是选自15至20的整数。一种具体实施例中，q是2、3、或4。一种具体实施例中，q是2或3。一种具体实施例中，q是2。
一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自苏氨酸和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是任何氨基酸，优选独立选自丝氨酸和苏氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是丝氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是苏氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是甘氨酸。
一种具体实施例中，AaC1在每次出现时独立选自天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时独立选自天冬酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时独立选自谷氨酰胺和甘氨酸。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时独立选自天冬酰胺和谷氨酰胺。一种具体实施例中，AaC1在每次出现时是天冬酰胺。一种具体实施例中，Aa在每次出现时是谷氨酰胺。
AaC2是能将该掩蔽肽链接至该掩蔽聚合物、结合域或承载域的任何反应性基团。例如，是马来酰亚胺、碘乙酰胺、硫酯、NHS酯、亚氨酸酯、羟甲基膦、碳二亚胺、酐、碳酸酯、醛、乙二醛、卤代乙酰基、吡啶基二硫醚、乙烯基砜、异氰酸酯、羰基二咪唑、苯甲酮、蒽醌、补骨脂素化合物、芳基叠氮化物、或卤化芳基。一种具体具体实施例中，AaC2是半光氨酰胺。偶联化学是该领域中已知的(见，例如，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,Shan S.Wong,CRC Press 1991，其内容通过引用而以其整体并入本文)。
q1是选自1至20的整数。一种具体实施例中，q1是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。一种具体实施例中，q1是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10.一种具体实施例中，q1是6、7、8、9、或10。一种具体实施例中，q1是1、2、3、4或5.一种具体实施例中，p1是1或2。一种具体实施例中，q1是1。
该可裂解的肽含有能被肿瘤所分泌的酶裂解的酶易感位点。肿瘤所分泌的酶是该领域中已知的，且包括，例如，蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶。优选该酶易感位点是蛋白酶易感位点。该蛋白酶是，例如，半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、和天冬氨酸盐蛋白酶或苏氨酸蛋白酶。
半胱氨酸蛋白酶包括，例如，组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶H、组织蛋白酶S、钙蛋白酶、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、或MMP-14。丝氨酸蛋白酶包括，例如，胰蛋白酶(Trypsin)、Hepsin、KLK6、KLK7、KLK8、蛋白裂解酶(Matriptase)、SLP1、TMPRSS3、或PRSS3/中胰蛋白酶。天冬氨酸盐蛋白酶包括，例如，组织蛋白酶D。苏氨酸蛋白酶包括，例如，26S蛋白酶体。
通常，该可裂解的肽将为150个残基或更少、100个残基或更少、或50个残基或更少。总长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个残基。预期肽长度的范围是4至50个残基、5至50个残基、6至50个残基、7至50个残基、7至25个擦剂、4至20个残基、5至20个残基、6至20个残基、7至20个残基、和7至15个残基。
例示性的可裂解的肽包括，包含氨基酸序列PLGVRG、PRCGVPDV、PRCGNPDV、PRCGXPD(其中，“X”是任何氨基酸，优选“V”)、PRCGVPDL、PRCGVPDK或GPICFFRLGK的肽。
优选具体实施例中，该掩蔽肽包含氨基酸LysSerGlyProLeuGlyValArgGlySerSerCys。另一优选具体实施例中，该掩蔽肽包含氨基酸序列LysSerGlyProLeuGlyValArgGlySerSer半光氨酰胺。
“任何氨基酸”意为20种常见氨基酸、20种常见氨基酸的立体异构体(如，D-氨基酸)和非天然氨基酸。
本文中，该20种常见氨基酸及其缩写遵循传统用法。见《合成免疫学(第二版)》(Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland Mass.(1991)))。该20种常见氨基酸的立体异构体(如，D-氨基酸)和非天然氨基酸如α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非传统氨基酸也可能是用于本发明多肽的适当组分。非传统氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-Ν,Ν,Ν-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸化丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-Ν-甲基精氨酸、和其它类似的氨基酸和亚氨酸(如，4-羟基脯氨酸)。根据标准用法和惯例，在本文中使用的其它多肽符号中，左手方向是氨基端方向，而右手方向是羧基端方向。
当用于多肽时，术语“实质上的一致性”意为，当将两个肽序列最佳对准时，如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重对准时，该两个肽序列享有至少80％的序列一致性，例如，至少90％的序列一致性、至少95％的序列一致性、或至少99％的序列一致性。
一些具体实施例中，不一致的残基位置的差别为保守氨基酸替换。
保守氨基酸替换指的是具有类似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸基团是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸基团是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸基团是天定酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸基团是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸基团是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及，具有含硫侧链的氨基酸基团是半胱氨酸和甲硫氨酸。适当的保守氨基酸替换基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸谷氨酸-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
检测域含有一个或多个可检测的标记。本文中，“可检测的标记”理解为，当存在于样品或受试者体内时，可检测且优选可定量检测的分子，“可检测的标记”包括但不限于，酶促标记(如，碱性磷酸酶)、荧光标记、放射性标记、致密颗粒标记、化学发光标记、生物发光标记、辅基标记、发射荧光的金属原子、放射性同位素、量子点、纳米颗粒、高电子密度试剂、半抗原、或生物素。该领域技术人员应理解，在特定方法中使用的具体的可检测的标记将由下述所决定，例如，待检测的靶点、对其实施检测的样品(如，液体或固体样品，体外或体内检测)、以及用于检测的设备。可直接检测可检测的标记如荧光标记。或者，可通过将可检测的标记与至少一种额外的试剂接触而检测该可检测的标记，其中，该至少一种额外的试剂为，例如，产生颜色、荧光或发光产物的酶底物；结合非位阻系带的试剂，如用于结合含生物素系带的含有抗生物素蛋白的标记、用于结合6倍His的含镍系带，该试剂可以是直接检测的试剂如荧光或放射性标签或间接检测的试剂如酶。
本文中，术语“标记”或“标记的”指的是可检测的标记物的并入，例如，通过并入放射标记的氨基酸或附接至可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基部分的多肽(如，可通过光学方法或量热法检测的含有荧光标记物或酶促活性的链霉亲和素)而完成。某些态样下，该标记或标记物亦可是治疗剂。标记多肽和糖蛋白的多种方法是该领域中已知的，且可用于本发明。用于多肽的标记的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(如，F1TC、若丹明、磷的镧系元素化物)、酶促标记(如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、被二级受体识别的预定多肽表位(如，亮氨酸拉链成对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、附加表位)。一些具体实施例中，标记通过各种长度的间隔臂附接，以降低潜在的立体位阻。
CAR
根据本发明，该CAR通常包含至少一种包含至少一个细胞外配体结合域的跨膜多肽；以及一种包含至少一个细胞内信号传导域的跨膜多肽；因此，这些多肽组合在一起以形成嵌合抗原受体。
本文中，术语“细胞外配体结合域”定义为能结合配体的多肽。优选该细胞外配体结合域将能够结合该“暴露的”识别域。例如，该细胞外配体结合域结合构成该识别域的小分子。
细胞外结合域包括但不限于，抗体分子、受体配体、肽、半抗原、适配体、亲和体、T细胞受体四聚体和该领域技术人员已知的其它靶向分子。例如，预期该细胞外结合域可包括核酸、多肽、糖蛋白、碳水化合物、或脂质。
细胞外结合域可以是抗体，该术语倾向于包括抗体片段。例如，抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段、合成的稳定化Fv片段，如单链Fv片段(scFv)、二硫化物稳定化的Fv片段(dsFv)、单可变区结构域(dAbs)微抗体、组合抗体和多价抗体如双体抗体和多-scFv、来自骆驼科动物或工程化人类等价物的单结构域。通过传统免疫法(如，多克隆血清和杂交瘤)制作抗体；或将抗体制作为重组片段，在从噬菌体展示库或核糖体展示库中选择之后，一般表达在大肠杆菌中。或者，可在从产生双体抗体的细菌菌落创建的基质模板中生成包含VH域与VL域的非共价关联的“组合抗体”。术语“抗体”还包括任何具有结合域的蛋白质，且该结合域与免疫球蛋白结合域是同源的或大部分同源的。这些蛋白可源自天然来源，或部分或全部为合成生成。
例如，该细胞外配体结合域是亲和体。亲和体是被工程化以展示肽环圈的小的、高度稳定的蛋白质，其向特异性靶点蛋白提供高亲和性结合表面。它是源自胱蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的低分子量蛋白质，分子量为12至14kDa。亲和体蛋白由支架构成，它是基于胱抑素蛋白质折叠的稳定蛋白质。它们显示两个肽环圈和N端序列，可任意排列，从而以类似于抗体的高亲和性和特异性结合不同靶点蛋白。当该蛋白支架约束该肽可能采取的构象时，该肽被稳定化，由此比游离肽增加结合亲和性和特异性。
例如，该细胞外配体结合域可以是结合至细胞类型特异性标记物的核酸结合分子(如，适配体)。通常，适配体是结合至特定靶点如多肽的寡核苷酸(如，DNA、RNA、或其类似物或衍生物)。适配体是短的合成单链寡核苷酸，其特异性结合至多种分子靶点如小分子、蛋白质、核酸、甚至细胞及组织。这些小的核酸分子可形成能特异性结合蛋白或其它细胞靶点的二级结构和三级结构，且本质上是抗体的化学等价物。配体的特异性高，尺寸相对小，且不产生免疫性。通常通过被称为SELEX(指数富集的配体系统性进化技术)的生物淘选方法选择适配体(Ellington et al.Nature.1990；346(6287):818-822；Tuerk et al.,Science.1990；249(4968):505-510；Ni et al.,Curr Med Chem 2011；18(27):4206-14；上述文献通过引用而以其整体并入本文)。生成用于任何给定靶点的适配体的方法是该领域中周知的。
一些具体实施例中，结合分子可以是小分子抗原的天然出现的或合成的配体。
优选具体实施例中，该跨膜域进一步包含位于所述细胞外配体结合域与所述跨膜与之间的柄区域。本文中，术语“柄区域”通常意为寡肽或多肽，其功能为将跨膜域链接至该细胞外配体结合域。特别地，柄区域被用来向该细胞外配体结合域提供更高的挠性和可及性。柄区域可包含最多300个氨基酸，优选为10至100个氨基酸，更优选25至50个氨基酸，且最优选3至15个氨基酸。柄区域可源自天然出现的分子的整体或一部分，如源自CD8、CD4或CD28的细胞外区域的整体或一部分，或源自抗体恒定区的整体或一部分。或者，该柄区域可以是对应于天然出现的柄序列的合成序列，或可以是是全合成的柄序列。优选具体实施例中，所述柄区域是人CD8α链的一部分。
本发明的CAR的信号转导域或细胞内信号传导域，是细胞外配体结合域结合至靶点并导致免疫细胞激活和免疫应答后，细胞内信号传导的原因。换言之，该信号转导域是激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的原因。例如，T细胞的效应子功能可以是溶胞活性或助手活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导域”指的是蛋白质的一部分，其转导效应子信号函数信号并引导该细胞实施特化的功能。
信号转导域包含两类截然不同的细胞质信号传导序列：启动抗原依赖性初级激活的信号传导序列，以及以不依赖抗原的方式作用而提供二级或共刺激信号的信号传导序列。初级细胞质信号传导序列可包含作为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的激活基序而为人所知的信号传导基序。ITAM是在多种受体的胞浆内尾部中发现的意义明确的信号传导基序，该受体用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。用于本发明中的ITAM的实例可包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些非限制性实例。优选具体实施例中，该CAR的信号传导转导域可包含该CD3ζ信号传导域，或FcεRIβ或γ链的胞浆内域。另一优选具体实施例中，举例而言，该信号传导由CD3ζ与由CD28提供的共刺激和肿瘤坏死因子受体(TNFr)如4-1BB或OX40一起提供。
特定具体实施例中，本发明的CAR的细胞内信号传导域包含共刺激信号分子。一些具体实施例中，该细胞内信号传导域包含串联的2、3、4或更多个共刺激分子。共刺激分子是除有效免疫应答所需抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
“共刺激配体”指的是位于抗原呈递细胞上的分子，其将同源的共刺激分子特异性地结合在T细胞上，从而除了提供由例如TCR/CD3复合体与荷载肽的MHC分子结合而提供的初级信号外，还提供其它信号，介导T细胞应答，包括但不限于，增殖激活、分化等。共刺激配体可包括但不限于，CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM)、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的兴奋剂或抗体、和特异性结合B7-H3的配体。除此之外，共刺激配体也涵盖特异性结合T细胞上呈递的共刺激分子的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体。
“共刺激分子”指的是位于T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体结合，从而介导通过该细胞进行的例如但不限于增殖的共刺激应答。共刺激分子包括但不限于，1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD-3ζ、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、-1BBL OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NLG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体等。另一具体具体实施例中，所述信号转导域是TNFR相关因子2(TRAF2)结合基序、共刺激TNFR家族成员的胞浆内尾部。共刺激TNFR家族成员的胞浆内尾部含有由主要保守基序(P/S/A)X(QE)E)或次要基序(PXQXXD)构成的TRAF2结合基序，其中，X是任何氨基酸。响应受体三聚作用，TRAF蛋白为多种TNFR的胞浆内尾部所召集。
适宜的跨膜多肽的显着特征包含，被表达在免疫细胞尤其是淋巴细胞或天然杀手(NK)细胞的表面的能力，以及一起相互作用来引导免疫细胞对抗预设靶点细胞的应答的能力。本发明的CAR的包含细胞外配体结合域及/或信号转导域的不同跨膜多肽在与靶点配体结合后，一起相互作用以参与信号转导，并诱导免疫应答。该跨膜域可源自天然来源或合成来源。该跨膜域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
本文中使用的术语“一部分”指代是分子的作为较短的肽的任何子集。或者，可通过编码该多肽的DNA中的突变来制备该多肽的氨基酸序列功能性变体。这些变体或功能性变体包括，例如，该氨基酸序列内残基的删除、插入或替换形式。也可做出删除、插入、和替换的任何组合以实现最终构造，条件为该最终构造具备所吸引的活性，尤其是展现特异性抗靶点细胞的免疫活性。本发明的CAR在宿主细胞内的功能性，可在适用于演示所述CAR结合特定靶点时的信号传导潜力的测定中检测。这些测定是该领域技术人员可获得的。例如，该测定令在结合至靶点时被触发的信号传导途径可被检测，如牵涉测量由此被影响的所释放钙离子的增长、细胞内酪氨酸磷酸化、肌醇磷酸盐反转、或白介素(IL)2、干扰素γ、GM-CSF、IL-3、IL-4产生的测定。
细胞
本发明的具体实施例包括表达CAR的细胞(即，CARTS)。该细胞可以是任何种类，包括能表达用于癌症治疗的CAR的免疫细胞或隐匿编码该CAR的表达载体的细胞如细菌细胞。本文中，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括其子代，该子代是任何及全部后代。应理解，由于有意或无意的突变，所有子代可能并不一致。在表达不同核酸序列的情境中，“宿主细胞”指的是真核细胞，其能复制载体及/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可以且已经用作载体的接纳体。宿主细胞可“被转染”或“被转化”，指的是借以将外源性核酸转移至或引入该宿主细胞内的过程。被转化的细胞包括初代受试细胞及其子代。本文中，术语“工程化的”和“重组的”细胞或宿主细胞倾向于指代，其内部已经被引入外源性核酸序列如载体的细胞。因此，重组的细胞可与不含重组引入的核酸的天然出现的细胞区分开来。本发明的具体实施例中，宿主细胞是T细胞，包括助手T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(亦称TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T-杀手细胞、细胞溶解T细胞、CD8+ T细胞或杀手T细胞)、调节T细胞(Treg)、T滤泡调节细胞(TFR)、NK细胞和NKT细胞也为本发明所涵盖。
一些载体可采用令其可在原核细胞和真核细胞中被复制及/或表达的对照序列。该领域技术人员将会进一步理解，孵化所有上述宿主细胞以维持该细胞并允许载体复制所需的条件。还应理解并知晓允许载体大规模生产的技术和条件，以及允许由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白或肽生产的技术和条件。
该细胞可以是自体同源细胞、同基因细胞、同种异体细胞，且在一些情形中，甚至可以是异种细胞。
很多态样下，在感兴趣的是该细胞在其存在后不复存在的研究或其它事件中，如果人们希望终止该治疗，则细胞变为瘤细胞，人们可以期望能杀死被修饰的CTL。对于这一目的，人们可提供某些基因产物的表达，其中，人们可在控制条件下杀死经修饰的细胞，如可诱导的自杀基因。
目标CARTS
本发明进一步包括CARTS，其被修饰以分泌一种或多种多肽。该多肽可以是，例如，抗体或细胞因子。细胞因子包括，例如，IL-2。
目标CARTS具有在靶标位点如肿瘤位点、移植位点或自体免疫位点同步分泌多肽的优点。
可通过在该细胞内信号传导域之后包括感兴趣的编码该多肽的核酸，构造目标CART。优选存在位于该细胞内信号传导域与该感兴趣的多肽之间的内部核糖体进入位点(IRES)。该领域技术人员可知悉，通过采用串联的多个IRES序列，可表达重构一种多肽。
将构造引入细胞内
编码该CAR的表达载体可作为一种或多种DNA分子或构造被引入，其中，可以存在至少一种将会容许含有该构造的宿主细胞分泌的标记物。
该构造可通过传统路径制备，其中，该基因和调节区域可分离，以及酌情结扎、在适宜的克隆宿主中克隆、通过限定或测序或其它传统手段分析。特别地，使用PCR，可分离包括全部或一部分功能单元的个别片段，其中，可酌情使用“引物修复”、结扎、体外突变形成等引入一个或多个突变。一旦完成且被证明具有该适宜的序列，即可通过任何传统手段将该构造引入该细胞(即，T细胞)。该构造可整合并封装入非复制的、缺陷性病毒基因组如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或单纯性疱疹病毒(HSV)等，包括用于感染或转染入细胞内的逆转录病毒载体或慢病毒载体之内。若需要，该构造可包括用于转染的病毒序列。或者，可通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂质转染等引入该构造。该宿主细胞可在引入该构造之前在培养物中生长并扩张，之后进行适宜的处理以引入该构造并整合该构造。随后，凭借存在于该构造中的标记物，扩张并筛选该细胞。可成功使用的多种标记物包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。
一些态样下，可具有用于同源重组的靶标位点，其中，所希望的是构造被整合在特定基因组内。例如，可敲除内源基因，并使用该领域中用于同源重组的已知材料和方法将其替换(在相同基因组或他处)为编码该构造的基因。对于同源重组，可使用OMEGA载体或O载体。见，例如，Thomas and Capecchi,Cell(1987)51,503-512；Mansour,et al.,Nature(1988)336,348-352；以及Joyner,et al.,Nature(1989)338,153-156。
该构造可作为至少编码该CAR及视态样的另一基因的单一DNA分子或具有一种或多种基因的不同DNA分子而引入。其它基因包括，例如，编码治疗性分子的基因或自杀基因。该构造可同步引入或相继引入，各自具有相同或不同的标记物。
含有可用要素如细菌或酵母复制起点、可选择的及/或可扩增的标记物、用于在原核生物或真核生物中表达的启动子/增强剂要素等的可用来制备DNA构造原液和用于实现转染的载体是该领域中周知的，且很多可商购。
使用方法
根据本发明的试剂可用于治疗有此需要的患者的癌症或其它免疫紊乱，如移植物抗宿主疾病或自体免疫紊乱。另一具体实施例中，苯基本发明的试剂可用于制造治疗有此需要的患者的癌症或其它或其它免疫紊乱如移植物抗宿主疾病或自体免疫紊乱的药品。
本发明依赖于治疗有此需要的患者的方法，所述方法包含下述步骤中的至少一步：(a)提供具有肿瘤抗原特异性的结合分子，其中，该结合分子包含链接至保护域的非识别域，(b)提供包含细胞间信号传导域、跨膜域、和能特异性结合该识别域的嵌合抗原受体细胞(CART)，以及给药至该患者。
所述治疗可以是缓解、治愈性或预防性治疗。它可以是自体同源免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。自体同源意为，用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群发源于所述患者或发源于人体白细胞抗原(HLA)相容供体。同种异体意为，用于治疗患者的细胞或细胞群不是发源于所述患者而是发源于供体。
本发明尤其适用于同种异体免疫疗法，其适用程度为能令典型从供体获得的T细胞转化为非同种异体反应细胞内。这可能以标准方案进行，并如需要重复多次。可汇集所得的经修饰的T细胞，并作为“现成的”治疗产品给药至一位或几位患者。
可使用所揭露方法的细胞揭示于前文中。所述治疗可用来治疗被诊断患有癌症、自体免疫疾病或移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者。可治疗的癌症包括未血管化或大体上尚未血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。该癌症可包含非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴癌)或可包含实体肿瘤。待使用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于，癌、胚细胞瘤、肉瘤、某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、及恶性肿瘤，如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和幼儿肿瘤/癌症。
它可以是与选自抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法所组成的组的一种或多种抗癌疗法组合的治疗。
根据本发明的优选具体实施例，可对正在进行免疫抑制治疗的患者实行所述治疗。事实上，本发明优选依赖于细胞或细胞群，该细胞或细胞群已经被作成由于编码至少一种免疫抑制剂受体的基因的失活而具有对该免疫抑制剂的抗性。在这方面，该免疫抑制治疗应有助于在该患者体内选择并扩展该T细胞。
其它具体实施例中，本发明的细胞组合物与(如，之前、同步或之后)骨髓移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外照射放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAM PATH的T细胞消融疗法联合给药至患者。另一具体实施例中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法如与CD20反应的试剂如利妥昔单抗(Rituxan)之后给药。例如，一种具体实施例中，受试者可使用高剂量化疗进行标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。某些具体实施例中，移植之后，受试者接收本发明的扩展免疫细胞的融合。其它具体实施例中，在外科手术之前或之后给药该扩展的细胞。通过本文中揭示的任何一种方法获得的所述修饰的细胞可在本发明特定态样下用于在有此需要的患者体内对抗宿主抗移植物(HvG)排异反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)；因此，在本发明的范畴内，是在有此需要的患者体内对抗宿主抗移植物(HvG)排异反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)的方法，该方法包含通过将有效量的包含失活的TCRα及/或TCRβ基因的修饰的细胞给药至所述患者而治疗所述患者。
细胞的给药
本发明尤其适用于自体同源免疫疗法，适用程度为能将典型从供体获得的T细胞转化入非同种异体反应细胞内。这可以标准方案施行并如需要重复多次。可汇集所得的经修饰的T细胞，并作为“现成的”治疗产品给药至一位或几位患者。
依据该细胞的特性，可以多种途径将该细胞引入宿主有机体如哺乳动物体内。在具体具体实施例中，该细胞可引入肿瘤位点处，而在可选的具体实施例中，该细胞消磨该癌症或被修饰以消磨该癌症。所采用的细胞的数目将取决于多种环境、引入的目的、细胞的寿命、待使用的方案，例如，多种给药途径、细胞繁殖的能力、重组构造的稳定性等。该细胞可作为分散物施加，通常被注射在感兴趣的位点处或该位点附近。该细胞可处于生理学可接受的介质中。
一些具体实施例中，将该细胞胶囊化以抑制免疫识别并被置于肿瘤位点处。
可如所希望的给药该细胞。依据所希望的应答、给药方式、细胞的寿命、存在的细胞的数目，可采用多种方案。给药的数目将至少部分地取决于上文揭示的因素。
根据本发明的细胞或细胞群的给药可以任何便利方式完成，包括通过雾化吸入、注射、吞咽、输液、植入或移植给药。本文中揭示的组合物可经皮下、皮内、瘤内、结节内、脊髓内、肌肉内、静脉注射或淋巴管注射、或经腹腔给药至患者。一种具体实施例中，本发明的细胞组合物优选通过静脉注射给药。
细胞或细胞群的给药可由下述组成：为每千克体重104至109个细胞，优选为每千克体重105至106个细胞，包括这些范围内的所有整数值的细胞数目。该细胞或细胞群可以一种或多种剂量给药。另一具体实施例中，将所述有效量的细胞作为单剂量给药。另一具体实施例中，将所述有效量的细胞作为超过一剂在一段时间内给药。给药时机处于主治医师的判断内，且取决于该患者的临床状况。该细胞或细胞群可从任何来源获得，如血库或供体。尽管个体需要改变，但对用于特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最优范围的确定处于该领域知识范畴内。有效量意为提供治疗性或预防性益处的量。给药剂量将取决于接纳者的年龄、健康和体重，存在并行治疗时的并行治疗的种类，治疗频率和所希望效果的特性。
应了解，该系统具有多个变量，如细胞对配体的应答、表达的效率、以及视态样的分泌水平、表达产品的活性、可随着时间和环境改变的患者的特定需要、作为细胞损失或个体细胞的表达活性水平损失的结果的细胞活性损失率等。因此，人们期望，对于每一位患者，即使存在将要给药至整个群体的通用细胞，将监控每一位患者的个体适宜剂量，且该监控患者的实际操作是该领域中的常规操作。
基于核酸的表达系统
本发明的CAR可从表达载体中表达。生产这些表达载体的重组技术是该领域中周知的。
载体
术语“载体”用来指代承载剂核酸分子，核酸分子可插入该载体中，以被引入细胞内，而该核酸分子在该细胞内被复制。核酸分子可以是“外源的”，意为它对于待将该载体引入的细胞来说是外来的，或该序列对于细胞内的序列是同源的，但该序列通常未见于该宿主细胞核酸内的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒、和植物病毒)、及人工染色体(如，YAC)。该领域技术人员具备通过标准重组技术构造载体的知识(见，例如，Maniatis et al.,1988和Ausubel etal.,1994，两篇文献通过引用并入本文)。
术语“表达载体”指的是，包含编码能被转录的RNA的核酸的任何类型的基因构造。一些情形中，RNA分子随后被转译为蛋白质、多肽、或肽。其它情形中，这些序列不被转译，例如，在反义分子或核糖酶的生产中。表达载体可含有大量“控制序列”，“控制序列”指的是，特定宿主细胞中经可操作地链接的编码序列的转录中所必需且转译中可能需要的核酸序列。除了管理转录和转译的对照序列之外，载体和表达载体可含有用作其它功能和如后文所述的核酸序列。
启动子和增强子
“启动子”是控制序列，它是核酸序列的一个区域，启动子控制转录的启动和速率。启动子可含有基因性元件，在该元件处，调节蛋白和调节分子可结合例如RNA聚合酶和其它转录因子，以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作地位于”、“可操作地链接”、“处于控制下”及“处于转录控制下”意为，启动子处于正确的关于核酸的功能定位下及/或正确取向下，以控制该序列的控制及/或表达的启动。
启动子通常包含一个发挥功能以定位RNA合成起始位点的序列。最著名的的实例是TATA盒，但在某些缺乏TATA盒的启动子如用于哺乳动物末端脱氧核糖核苷基转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子中，覆盖于该起始位点上的离散元件本身有助于固定启动地点。其它启动子元件调节转录启动的频率。典型地，这些元件位于该起始位点的上游30 110bp区域，但大量启动子已经显示也含有位于该起始位点下游的功能元件。为了将编码序列带至“处于启动子控制下”，将该转录阅读框的转录起始位点的5'端定位于所选启动子的“下游”(即，3'端)。该“上游”启动子刺激该DNA的转录，且促进所编码RNA的表达。
启动子元件之间的间距经常是柔性的，因此，当令这些元件反转或相对于彼此移动时，启动子功能得以保留。在tk启动子中，在启动子元件之间的间距可增加至相距50bp，之后活性开始下降。依据该启动子，单个元件似乎可合作或独立发挥作用来激活转录。启动子可与“增强子”协同作用或不可与之协同作用，“增强子”指的是牵涉入核酸序列的转录激活中的顺式调控序列。
启动子可以是天然地与核酸序列相关，其可通过分离位于编码节段及/或外显子上游的5’引物非编码序列而获得。该启动子可称为“内源的”。同样，增强子可以是天然地与核酸序列相关，位于该序列的下游或上游。或者，通过将该编码核酸节段置于重组或异种启动子的控制之下，可能得到某些优势，其中，该重组或异种启动子指的是在其天然环境中并未正常地与核酸序列关联的启动子。重组或异种增强子也指的是在其天然环境中并未与核酸序列正常关联的增强子。这些启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，以及从任何病毒或原核生物或真核生物细胞中分离的启动子或增强子，且该启动子或增强子不是“天然出现的”，即，含有不同转录调节区域的不同元件及/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建中的启动子包括内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(tip)启动子系统。除了合成地生成启动子和增强子的核酸序列之外，也可使用重组克隆及/或核酸扩增技术生成该序列，该技术包括与本文中揭露的组合物有关的PCR.TM.(见，US 4,683,202和US 5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，预期还可采用引导位于非核细胞器如线粒体、叶绿体等中的序列的转录及/或表达的控制序列。
自然地，采用有效引导DNA阶段在被选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官、或有机体内的表达的启动子及/或增强子很重要。分子生物学领域揭示任意通常知道启动子、增强子、及细胞类型组合在蛋白质表达中的用途(见，例如，Sambrook et al.1989，通过引用并入本文)。所采用的启动子在适宜的条件下可以是本构的、组织特异性的、可诱导的、及/或可用的，以引导所引入的DNA节段的高水平表达，例如，在重组蛋白质及/或肽的大规模生产中具有优势。该启动子可以是异种的或内源的。
此外，任何启动子/增强子组合亦可用来驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可能的具体实施例。如果或作为输送复合物的一部分或作为另一基因表达构造而提供适宜的细菌聚合酶，真核细胞可支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
对组织特异性启动子或元件的鉴别以及表征其活性的测定方法是该领域技术人士所周知的。
特异性启动信号也可能为编码序列的有效转译所需。这些洗好包括ATG启动密码子或相邻序列。可能需要提供内源性转译控制信号，包括该ATG启动密码子。该领域技术人员将能轻易地确定这一点并提供该必需信号。
本发明的某些具体实施例中，内部核糖体进入位点(IRES)元件被用来创建多基因或多顺反子的信息，且这些可用于本发明中。
本发明的某些具体实施例中，该2A自裂解肽被用来创建多基因或多顺发自的信息，且这些可用于本发明中。
载体可包括多克隆位点(MCS)，该多克隆位点是含有多重限制酶位点的核酸区域，其任何一种均可与标准重组技术协同作用以消化该载体。“限制酶消化作用”指的是，使用仅在核酸分子中特定位置发挥功能的酶进行的核酸的催化裂解。这些限制酶中很多可商购。此类酶的用途是该领域技术人员广泛理解的。经常使用限制酶将载体线性化或片段化，该限制酶在MCS内部切割以令内源性序列能被结扎至该载体。“结扎”指的是在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，该两个核酸片段可以彼此连续或不连续。牵涉限制酶和结扎反应的技术是重组技术领域技术人员所周知的。
也可采用剪接位点、终止信号、复制起点、和可选择的标记物。
质粒载体
某些具体实施例中，预期使用质粒载体来转化宿主细胞。通常，将源自与该宿主细胞相容物种的含有复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主相联系。一般来说，该载体承载复制位点以及在经转化的细胞内提供表型选择的标记序列。非限制性实例中，往往使用pBR322的衍生物——一种源自大肠杆菌物种的质粒——来转化大肠杆菌。pBR322含有氨苄青霉素和四环素的耐药基因，并因此提供容易地鉴别经转化细胞的手段。该pBR质粒，或其它微生物质粒或噬菌体，必须还含有或经修饰以含有，例如，可被该微生物有机体用于其自身蛋白质表达的启动子。
此外，能与该宿主微生物相容的含有复制子和控制序列的噬菌体载体可作为转化载体而与这些宿主关联使用。例如，噬菌体λGEM.TM.11可用于制作可用来转化宿主细胞如大肠杆菌LE392的重组噬菌体载体。
其它可用的质粒载体包括plN载体(lnouye et al.,1985)；以及pGEX载体，用于生成谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白，以供后续纯化及分离或裂解之用。其它适当的融合蛋白是那些具有半乳糖苷酶、泛素等的融合蛋白。
包含该表达载体的细菌宿主细胞如大肠杆菌，在多种适当培养基中的任一种如LB培养基中生长。如该领域技术人员将会理解的，可通过令宿主细胞与腿与某些启动子为特异性的试剂接触，如通过将IPTG加入该培养基中或通过将孵化切换至更高温度而包括该重组蛋白在某些载体中的表达。将该细菌再培养一段时间后，通常在2至24小时之间，通过离心作用收集细胞并洗涤，以移除残留的培养基。
病毒载体
某些病毒经由受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞的能力和整合入宿主细胞基因组内并稳定且有效地表达病毒基因的能力，已经令它们称为将外来核酸转移至细胞(如，哺乳动物细胞)内的有吸引力的备选。本发明的组分可以是编码一种或多种本发明的CAR的病毒载体。可用来输送本发明的核酸的病毒载体的非限制性实例揭示如下。
腺病毒载体
一种输送该核酸的特定方法牵涉腺病毒表达载体的使用。尽管已知腺病毒整合入基因组DNA的能力低，通过这些载体提供的高效基因转移，这一特征得以抵消。“腺病毒表达载体”意为包括含有足以实现下述功能的腺病毒序列的那些构造：(a)支持该构造的封装和(b)最终表达已经被在其内部克隆的组织或细胞特异性构造。对基因构成或腺病毒(36kb的线性的双链DNA病毒)的认知，允许以外来序列对大段腺病毒DNA进行取代，取代度高达7kb(Grunhaus and Horwitz,1992)。
AAV载体
可使用腺病毒辅助转染将该核酸引入该细胞内。在使用腺病毒偶合系统的细胞系统中，已经报导了增加的转染效率(Kelleher and Vos,1994；Cotten et al.,1992；Curiel,1994)。对于在本发明的细胞中的用途，腺相关病毒(AAV)是有吸引力的载体系统，由于AAV具有高整合频率且可感染不分裂的细胞，因此令其可用于将基因输送至哺乳动物细胞内，例如，在组织培养中(Muzyczka,1992)或在体内输送。AAV具有广泛的感染性宿主范围(Tratschin et al.,1984；Laughlin et al.,1986；Lebkowski et al.,1988；McLaughlin et al.,1988)。关于生成和使用rAAV载体的细节揭示于US 5,139,941和US 4,797,368中，各自通过引用而并入本文。
逆转录病毒载体
因为逆转录病毒将其基因整合入宿主基因组、转移大量外来遗传材料、感染光谱物种和细胞类型和被封装在特异性细胞系中的能力，逆转录病毒可用作输送载体(Miller,1992)。
为了构建逆转录病毒载体，将核酸(如，编码所希望的序列的核酸)插入该病毒基因组中替换某些病毒序列，以产生具有复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建含有gag、pol、和env基因但没有LTR的封装细胞系和封装组分(Mann et al.,1983)。当将含有cDNA的重组质粒与该逆转录病毒LTR和封装序列一起引入特定细胞系(如，通过磷酸钙沉淀引入)中时，该封装序列令该重组质粒的RNA转录本被封装入病毒颗粒中，随后该病毒颗粒被分泌于培养基中(Nicolas and Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann et al.,1983)。随后，筹集含有该重组逆转录病毒的培养基，视情况浓缩，以备基因转移之用。逆转录病毒载体能感染多种细胞类型。但是，整合和稳定的表达需要宿主细胞的分配(Paskind et al.,1975)。
慢病毒是符合逆转录病毒，除了含有常见的gag、pol和env基因之外，还含有其它具有调节功能或结构功能的基因。慢病毒载体是该领域中周知的(见，例如，Naldini et al.,1996；Zufferey et al.,1997；Blomer et al.,1997；US 6,013,516和US 5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒HIV-1和HTV-2，以及猿猴免疫缺陷病毒SIV。已经通过多重衰减该HTV致病基因而生产慢病毒载体，例如，将env、vif、vpr、vpu和nef基因删除，令该载体成为生物学安全的载体。
重组慢病毒载体能感染不分裂的细胞，且可用于体内和离体基因转移以及核酸序列的表达。例如，重组慢病毒能感染不分裂的细胞，其中，以两种或多种承载名为gag、pol和env以及rev和tat的封装功能的载体转染适当的宿主细胞，揭示于通过引用并入本文的US5,994,136中。通过该包膜蛋白与抗体或以特定细胞类型的受体为靶向的特定配体的链接，可以该重组病毒为靶点。通过将感兴趣的序列(包括调节区域)与编码特异性靶点细胞上的受体的配体的另一基因一起插入该病毒载体中，例如，该载体显着是靶点特异性的。
其它病毒载体
本发明中，其它病毒载体可用作疫苗构造。可采用源自病毒如牛痘病毒(Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986；Coupar et al.,1988)、辛德毕斯病毒、巨细胞病毒和单纯性疱疹病毒的载体。它们提供了若干用于多种哺乳动物细胞的由吸引力的特征(Friedmann,1989；Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986；Coupar et al.,1988；Horwich et al.,1990)。
使用修饰病毒输送
待输送的核酸可被封装在已经工程化以表达特异性结合配体的传染性病毒内。该病毒颗粒将因此特异性结合至靶点细胞的同源受体，并将其内容为输送至该细胞。基于通过将乳糖残基加成至该病毒衣壳而对逆转录病毒的化学修饰，研发了设计为允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新颖途径。这一修饰可容许经由唾液酸糖蛋白受体进行的干细胞的特异性感染。
设计重组逆转录病毒的靶向的另一途径，其中，使用对抗逆转录病毒封装蛋白和对抗特异性细胞受体的生物素化抗体。使用链霉亲和素将该抗体经由生物素组分偶合(Roux et al.,1989)。使用对抗I类和II类主要组织相容性抗原复合体的抗体，他们在体外证明了承载那些具有亲嗜性病毒的表面抗原的多种人类细胞的感染(Roux etal.,1989)。
载体输送和细胞转化
适当的输送用于转染或转化细胞的核酸的方法是该领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于，DNA、RNA或mRNA的直接输送，如通过离体转染、通过注射等等直接输送。通过应用该领域中已知的技术，可稳定地或瞬时地转化细胞。
离体转化
转染从离体设定的有机体移除的真核细胞和组织的方法是该领域技术人员已知的。因此，预期该细胞或组织可使用本发明的核酸移除并离体转染。在特定情况下，可将所移植的细胞或组织置于有机体内。优选实例中，核酸被表达在该植入的细胞中。
本发明的试剂盒
本文中揭示的任何组合物可包含在试剂盒中。一个非限制性实例中，可将一种或多种用于细胞疗法中的细胞及/或暗含重组表达载体的用来生成一种或多种用于细胞疗法中的细胞的试剂包含在试剂盒中。该试剂盒的组分提供在适当的容器单元中。
该试剂盒的一些组分可封装在水性介质或封装为冻干形式。该试剂盒的容器单元将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器单元，其内部置有组分，且优选经过适当的等量化。如果该试剂盒中存在超过一种组分，则该试剂盒通常还会含有第二、第三或另一额外的容器，其内部可单独置有该其它组分。但是，组分的各种组合可包含在一个小瓶内。本发明的试剂盒典型还会包括含有严格限制的商业规格的该组分。这些容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其内部留存所希望的小瓶。
当将该试剂盒的组分提供为一种及/或多种液体溶液时，该液体溶液时水溶液，尤其可采用无菌的水溶液。一些情形中，该容器单元自身可为注射器、移液管、及/或其它类似的设备，制剂可从该容器单元施加至身体的感染部位、注射至动物体内、及/或甚至施加至该试剂盒中的其它组分及/或与之混合。
但是，该试剂盒的组分可提供为干燥的粉末。当试剂及/或组分被提供为干燥的粉末时，可通过加入适当的溶剂重构该粉末。预期亦可将该溶剂提供于另一容器单元中。该试剂盒还可包含第二容器单元，其内部含有无菌的、药学可接受的缓冲剂及/或其它稀释剂。
本发明的特定具体实施例中，将待用于细胞疗法中的细胞提供在试剂盒中，且在一些情形中，该细胞基本上是该试剂盒的唯一组分。该试剂盒可包含用来制作所希望的细胞的试剂和材料。具体具体实施例中，该试剂和材料包括用于扩增所希望的序列的引物、核苷酸、适当的缓冲剂或缓冲试剂、盐、等等，且在一些情形中，该试剂包括编码如本文中揭示的CAR的载体及/或DNA及/或用于该载体及/或DNA的调节元件。
特定的具体实施例中，该试剂盒中存在一种或多种适用于从个体提取一个或多个样品的设备。该设备可以是注射器、解剖刀、等等。
本发明的一些情形中，除了细胞疗法的具体实施例之外，该试剂盒还包括第二癌症疗法，如化学疗法、激素疗法、及/或免疫疗法。可调整给试剂盒以令其适用于个体的特定癌症，并包含用于该个体的各第二癌症疗法。
联合疗法
本发明的某些具体实施例中，本发明的用于临床表现的方法与在增生过度性疾病的治疗中有效的其它剂如抗癌剂合用。“抗癌”剂能通过例如杀死癌细胞、将细胞凋亡引入癌细胞中、降低癌细胞增长率、降低转移的发病率或数目、减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤细胞或癌细胞的血液供给、促进对抗癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌症的进展、或增加癌症患者的寿命，对受试者体内的癌症造成负面影响。更普遍地，将会以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供这些其它组合物。这一过程可能牵涉令该癌细胞同时接触表达构造及该剂或多种因素。这可以通过令该细胞接触单一组合物或包括两种剂的药物制剂而实现，或通过令该细胞同时接触两种截然不同的组合物或制剂而实现，其中，一种组合物包括该表达构造，而另一种包括该第二种剂。
肿瘤细胞对化疗剂和放疗剂的抗性呈现了临床肿瘤学中的一个主要问题。目前，癌症研究的一个目标为，寻找通过将其与其它疗法组合而改善放化疗效率的途径。在本发明的情境中，预期该细胞疗法同样可与化疗介入、放疗介入、免疫治疗介入、以及前凋亡或细胞循环调节剂协同作用。
或者，本发明疗法可在该其它剂治疗之前或之后进行，间隔时间为从几分钟到几周的范围。将该其它剂与本发明单独施加至个体的多种具体实施例中，通常会确保每一次输送时间之间的有效时期并不造成药效过期，因此，该剂和本发明的疗法将仍然能发挥对该细胞的有益的组合效应。这些例子中，预期可令该细胞接触两种治疗，且两种治疗的时间间隔为约12至24小时内，更优选在约6至12个小时内。但在一些态样下，希望显着延伸治疗的时期，其中，每次给药之间的时间间隔为几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
预期将根据需要重复该治疗周期。还预期多种标准疗法以及手术介入可与本发明的细胞疗法合用。
化学疗法
癌症疗法还包括基于化疗和放疗两者的多种联合疗法。联合化疗包括，例如，白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、六甲蜜胺、多西他赛、赫赛汀、甲氨蝶呤、米托蒽醌(novantrone)、诺雷德、顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、道诺霉素、阿霉素、争光霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤、或前述物质的任何类似物或衍射变体及其组合。
具体具体实施例中，将用于该个体的化学疗法与本发明协同作用，例如，在给药本发明之前、之中及/或之后进行该化学疗法。
放射疗法
其它造成DNA损伤并已经广泛应用的因素包括一般已知的γ射线、X射线、及/或直接输送至肿瘤细胞的放射性同位素。还考虑DNA损伤的其它形式的因素，如微波和UV辐射。最可能所有这些因素对于DNA、前体DNA、DNA的复制和修复、及染色体的组装和维护具有光谱损伤效应。X射线的剂量范围是，从50至200伦琴的长期(3至4周)日剂量，到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的变化幅度大，且取决于该同位素的半衰期、辐射的强度和类型、以及瘤细胞的吸收度。
本文中，当用于细胞时，术语“接触”和“曝露”用来揭示一种过程，借由给过程，治疗性构造和化疗剂或放疗剂被输送至靶点细胞或被放置为直接毗邻该靶点细胞。为了实现细胞杀伤或细胞停滞，以有效杀伤该细胞或阻止该细胞分裂的组合量输送该两种剂。
免疫疗法
免疫疗法通常依赖于对免疫效应子细胞的使用，以及对以癌细胞为靶向并摧毁癌细胞的分子的使用。该免疫效应子可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的一些标记物为特异性的抗体。该抗体可独自用作疗法的效应子，或可复原其它细胞以实际上实现细胞杀伤效果。该抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，且仅用作靶向剂。或者，该效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶点相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应子细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此，除本文中揭示的本发明疗法外的免疫疗法可作为联合疗法的一部分与本发明的细胞疗法协同作用。联合疗法的一般步骤讨论如下。通常，肿瘤细胞必须承载一些标记物，该标记物必须经得起靶向考验，即不存在于大多数其它细胞上。很多肿瘤标记物存在，且这些肿瘤标记物中的任一种在本发明的情境中均可能适用于靶向。常见的肿瘤标记物包括PD-1、PD-L1、CTLA4、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白、erb B和pl55。
基因
又一具体实施例中，该第二种治疗是基因疗法，其中，在本发明的临床具体实施例之前、之后或同时给药治疗性多核苷酸。多种表达产物为本发明所涵盖，包括细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂、或程序性细胞死亡调节剂。
外科手术
大约60％的癌症患者将接受某些类型的手术，包括预防性手术、诊断性或分期手术、治愈性手术和缓解性手术。治愈性手术时可与其它疗法如本发明中的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法及/或另类疗法协同作用的癌症治疗。
治愈性手术包括切除术，其中，全部或部分的癌组织被物理性移除、切除、及/或摧毁。肿瘤切除术指的是物理性移除至少一部分肿瘤。除了肿瘤切除术之外，通过外科手术进行的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术、和显微镜控制下的手术(莫氏手术(Mohs'surgery))。进一步预期，本发明可与浅表性癌组织、癌前组织、或附带量的正常组织的移除协同作用。
一旦部分或全部的癌细胞、组织或肿瘤被切除，在身体内形成一个空穴。可通过将另一抗癌治疗输注、直接注射或局部应用至该部位而实施治疗。可重复这一治疗，例如，每1、2、3、4、5、6、或7天一次，或每1、2、3、4、或5周一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月一次。这些治疗的剂量也可变。
其它试剂
预期其它试剂可与本发明合用以改善治疗的疗效。这些其它试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和细胞间隙连接上调的试剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、或增加过得增殖的细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、干扰素β、和干扰素γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、和其它趋化因子。进一步预期，通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌效应，细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将会加强本发明的细胞凋亡诱导能力。通过提高细胞间隙连接的数目而增加细胞间信号传导，将会增加对相邻的过度增殖细胞群的抗过度增殖效应。其它具体实施例中，细胞生长或分化抑制剂可与本发明合用，以改善该治疗的抗过度增殖效力。细胞粘附抑制剂被预期改善本发明的效力。细胞粘附抑制剂的实例为黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的试剂，如抗体c225，可与本发明合用以改善该治疗的效力。
定义
本文中，术语“生物相容的”指的是对细胞无毒的物质。一些具体实施例中，如果将一物质在体内加至细胞中不诱发炎症及/或其它体内负面效应，则认为该物质是“生物相容的”。一些具体实施例中，如果将一物质在体外或体内加至细胞中导致小于或等于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、或小于约5％细胞死亡，则认为该物质是“生物相容的”。
本文中，术语“生物可降解的”指的是在生理学条件下可被降解的物质。一些具体实施例中，生物可降解的物质是通过细胞机制破坏的物质。一些具体实施例中，生物可降解的物质是通过化学过程破坏的物质。例如，例示性的生物可降解材料的降解需要酶的存在。生理学条件对于多数(如果不是全部)该生物可降解材料是不充分的。
本文中，当关于两个或更多个部分使用术语“与…相关”、“协同作用”的、“链接的”、“附接的”和“系带的”时，意为这些部分彼此或直接或经由一个或多个用作链接剂的额外部分物理关联或连接以形成足够稳定的结构，因此，这些部分在使用该结构的条件如生理学条件下保持物理上的关联。一些具体实施例中，该部分通过一个或多个共价键彼此粘附。一些具体实施例中，该部分通过牵涉特异性(而非共价)结合(如，链霉亲和素/抗生物素蛋白相互作用、抗体/抗原相互作用等)而彼此粘附。一些具体实施例中，足量的弱相互作用可对该部分提供足够的稳定性，以将该部分维持为物理上关联。
本文中，当关于两个或更多个部分使用术语“协同作用的”、“链接的”和“粘附的”时，意为这些部分彼理或直接或经由一个或多个用作链接剂的额外部分此物关联或连接以形成足够稳定的结构，因此，这些部分在使用该结构的条件如生理学条件下保持物理上的关联。这些部分典型或通过一个或多个共价键或通过牵涉特异性结合的机理粘附。或者，足量的弱相互作用可对该部分提供足够的稳定性，以将该部分维持为物理上关联。
本文中，术语“结合(bind)”或“结合(binding)”指的是介于成对的分子或其部分之间的相互作用，该分子或其部分典型由于特异性或非特异性结合或相互作用而展现相互亲和性或结合能力，该结合或相互作用包括但不限于，生化作用、生理作用、及/或化学作用。“生物结合”定义一种出现在分子对之间的作用类型，该分子包括蛋白质、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素等。术语“结合配偶体”指的是可与特定分子结合的分子。“特异性结合”指代是一种分子，该分子能结合至或识别结合配偶体(或限定数目的结合配偶体)，结合或识别程度本质上高于另一类似的生物学整体。
[实施例]
实施例1：以掩蔽的小分子功能化肿瘤靶向的抗体
本实施例的目的为，构建由与小分子偶合的骨架结构聚合物结构组成的支架，该支架可进一步以蛋白质敏感水凝胶聚合物修饰。PEG是用于功能化该小分子支架的优良选择，引物其稳定化生物分子且耐降解，由是构建偶合化学反应。可选择任何数目的小分子。这一PEG/小分子/蛋白酶敏感水凝胶聚合物的支架将与肿瘤靶向的抗体偶合。
实施例2：以掩蔽的小分子功能化肿瘤靶向的抗体
本实施例的目的为使用CytomX技术，该技术使用蛋白酶敏感肽来阻断肿瘤靶向抗体识别其抗原的能力。在这一策略中，设想该小分子被直接偶合至该抗体的Fc部分或偶合至该抗体的抗原识别部分以外的某些其它位点。我们将基于小分子的药理活性而选择该小分子。
实施例3：创建仅在肿瘤附近暴露小分子的pH依赖性聚合物
这一技术的一般策略为，研发其构象以pH依赖方式改变的肽。我们计划将小分子抗原共价链接至这一肽。在生理学条件下，该肽将折叠会其自身上以掩蔽该小分子。在酸性条件下，该肽将打开，暴露该小分子。该策略的优势在于，未结合至该肿瘤的抗体将掩蔽该小分子，从而阻断不适宜的或非计划中的免疫系统激活。将该水凝胶聚合物链接至该I期肿瘤靶向抗体的一般策略适合于将此肽链接至该肿瘤靶向抗体。作为备选策略，可将这一pH敏感的肽直接注射入肿瘤，以生成免疫应答。
实施例4：工程化CAR T细胞以引导其对抗小分子
材料和方法
这一实验的目的为工程化CAR T细胞，该细胞可由直接偶合至肿瘤靶向抗体或包埋在偶合至该肿瘤靶向抗体的蛋白酶敏感聚合物中的小分子触发。使用识别该小分子的单链抗体将该CAR T细胞工程化。使用CD8a前导序列、CD8a铰链序列、CD28、4-IBB和CO3ζ细胞内域融合体构建该嵌合体。图7将本文中使用的CAR模块的组合物形象化。
CAR构造的生成
该分子设计受到出版物Sun et al,Breast Cancer Res,16(3):R61(2014)的启发，该出版物中，抗-HER2抗体被融合在CD8a前导序列与CD8a铰接序列之间，且跟随有CD28和CD3ζ胞内域。与该出版物相比，4-1BB胞内域被插入CD28与CD3ζ之间。此外，不使用任何链结基或间隔区。
将两个单链抗体克隆入该构造中：如Boder et al,Proc Natl Acad Sci U S A.26；97(20):10701-5,(2000)中揭示的抗-FITC抗体，和由Randox Biosciences(Admore,Diamond Road,United Kingdom)设计的抗蒽醌-2-羧酸。
预期这一CAR T与任何小分子反应，但须是适宜的单链抗体即可。
通过Gibson组装克隆每一构造并使用传统序列服务(GENEWIZ,Inc.)测序。
亲嗜性逆转录病毒的生成
我们选择用于概念验证的逆转录病毒载体是基于Hoist et al.J.Gen.Virol.88:1708-1716(2007)所揭示的载体且可通过Addgene获得(质粒#52107)。简而言之，该CAR构造被插入含有MSCV'sψ序列和C端GFP报告基因的空逆转录病毒载体中，该C端GFP报告基因通过自裂解IRES模块而与该CAR序列分隔开来。
使用PLAT-E封装细胞系(Cell Biolabs,Inc.)，如生产商所描述，生成该亲嗜性逆转录病毒。简而言之，将Plat-E细胞铺展于DMEM、10％胎牛血清(FCS)、1μg/mL嘌呤霉素、10μg/mL杀稻瘟菌素、青霉素和链霉素中。转染前一天，令该细胞在150mm组织培养板(Falcon,#353025)上在DMEM、10％(FCS)中生长，直至70％细胞融合。在转染当天，将2.0ml的Opti-MEM(ThermoFisher Scientific,#31985070)与112.5μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen,#11668500)混合，并在室温下孵化10分钟。然后，加入30μg的质粒，并将该混合物在室温再孵化15分钟。在整个细胞培养过程中，以螺旋移动逐滴加入该Opti-MEM/lipofectamine 2000/DNA溶液。细胞在37℃/5％CO2中保持孵化48小时。收获时，收集上清液，并通过0.45μm聚醚砜(PES)过滤器(CELLTREAT Scientific Products,#229749)过滤。经过滤的溶液分为两等份：一份立即用于鼠T细胞的转导，一份再次等分并在-80℃储存。
鼠杂交瘤T细胞的转导
使用剥夺TCRα和β链的鼠杂交瘤T细胞(58C)来研究抗原暴露时的T细胞激活(Letourneur and Malissen,Eur J Immunol.Dec；19(12):2269-74,(1989))。
将该鼠T细胞铺展于具有青霉素和链霉素的RPMI 10％FBS中。在转染当天，将300,000细胞种植在6孔Costar板(Corning,#3516)的孔中。将含有5μg/ml聚凝胺(Santa Cruz Biotechnology,#sc-134220)的病毒上清液加入每一孔中。令该细胞与该病毒上清液轻柔混合之后，将该细胞在Sorvall RT离心机(ThermoFisher,#EW-17705-10)中在37℃和800g离心1小时。离心之后，以2ml的具有青霉素和链霉素的RPMI10％FBS替换该病毒上清液。剩余小份的病毒上清液在4℃储存过夜。16至24小时之后，使用1ml的先前在4℃储存的相同病毒上清液实施旋转感染。收获经转导的细胞，在37℃/5％CO2中孵化48小时后分类，得到GFP阳性细胞。
作为CD69表面表达函数的T细胞激活的定量
在37℃，以500μl的10μg/ml抗原在PBS中的溶液将24孔Falcon板(Corning,#353047)的孔涂覆1小时。该抗原溶液含有用于该抗-FITC CAR T细胞的结合至抗原小分子的肽：BSA-FITC(Life Technologies,#A23015)，以及用于抗蒽醌CAR T(anti-AQ CAR T)的结合至蒽醌-2-酯的裂解后的肽(pCP(AQ)，SEQ ID NO:1)。作为模拟，使用BSA(Sigma-Aldrich,#A7906)涂覆每一牵涉CAR T细胞的实验的孔。涂覆后，将置于具有青霉素和链霉素的500μl细胞RPMI 10％FBS中的500,000 58C种植在每一孔中。在37℃，将该58C细胞在其抗原的存在下孵化4小时，之后进行FACS分析。
在FACS分析之前，将250μl的细胞溶液转移至具有圆底的96孔Falcon板(Corning,#353077)中。每张板在4℃以500g离心3分钟(ThermoFisher,#EW-17705-10)。移除上清液之后，将250μl的PBS 2％FBS加入每孔中。混合该细胞，并将该板在4℃以500g重新离心3分钟(ThermoFisher,#EW-17705-10)。移除上清液之后，将100μl的PBS2％FBS抗体溶液加入每孔中。在冰上实施抗体染色30分钟。将150μl的PBS 2％FBS加入每孔中，以将细胞从未结合的抗体中洗出。将该板在4℃以500g离心3分钟(ThermoFisher,#EW-17705-10)，并移除上清液。最后，将200μl的PBS 2％FBS加入每孔中，将该溶液过滤入Falcon FACS管(Coming,#352235)中，之后进行FACS分析。
使用海水蓝抗鼠CD69(Biolegend#104524)检测CD69。我们使用海水蓝亚美尼亚仓鼠IgG同种型Ctrl(Biolegeng#400925)作为同种型对照物。
结果
测试了由不同的CAR构造生成的CD69表面表达。数据呈现在图8中。相对于模式计算对此图和后续图式的相对计数。
图8是对以适宜的抗小分子BAT-CAR T细胞转导的58C细胞群的FACS分析。将CD69定量为当抗原接触时CAR T细胞激活的结果。仅当以抗-FITC CAR T(SEQ ID NO:10)或抗蒽醌-2-酯(抗-AQ，SEQ ID NO:Y)将鼠杂交瘤T细胞工程化以识别小分子时，CD69表达被触发。当将原生58C细胞或以空pMIG载体转导的58C细胞曝露于抗原时，未观察到激活。当存在以CAR工程化的鼠杂交瘤T细胞作为BSA效应子时，抗-FITC CAR T细胞或抗-AQ CAR T细胞均未被激活。靶点为涂覆24孔板的孔的抗体同源抗原。
实施例5：用于抗原暴露的MMP2敏感聚合物的生成
材料和方法
该实验的目的为，证实化学合成的肽可被其同源基质金属蛋白酶(MMP)如MMP2或MMP9裂解。该肽可被裂解为在溶剂中游离存在，或直接或间接偶合至该肿瘤靶向单元。该肽被设计为偶合至该抗原小分子，且意为位于该靶向单元与该掩蔽PEG聚合物之间的桥接嵌段。
与蒽醌小分子偶合的掩蔽肽的定义
所选择的肽“CP(AQ)”(SEQ ID NO:2)在其中心含有如Bremer et al.,Nat Med.Jun,7(6):743-8(2001)中所揭示的MMP2裂解序列“ProLeuGlyValArgGly”，且裂解位点位于Gly与Val之间。
CP(AQ)合成序列是
“Lys(AQ)SerGlyProLeuGlyValArgGlySerSerCys”：第一个残基“Lys”通过其γ氨基共价键结至该抗原小分子蒽醌-2-酸。“SerGly”和“SerSer”分别环绕其N端和C端，从而向该肽提供对该蛋白酶的可及性、柔性和增加的水溶液溶解性。最终，蒽醌-2-酸被偶合至该肽N端上的赖氨酸。为了在将该肽与剩余平台组分(如，肿瘤靶向单元和PEG掩蔽聚合物)偶合的过程中提供特异性的取向，该可裂解的肽的位于其N端的传统游离氨基得以保持，但位于其C端的氨基被加成L-半胱氨酰胺。该胺用于偶合在经NHS激活的酯上和L-半胱氨酰胺上，用于直接偶合对抗马来酰亚胺。
通过MMP2进行的肽裂解的确认
在UV荧光箔(Sigma-Aldrich,#70643)上实施薄层色谱(TLC)，以分离并跟踪由商用MMP2(BioLegend,#554304)造成的随时间而增长的肽蛋白分解(图9)。
为了跟踪通过MMP2进行的CP(AQ)的蛋白分解，我们获得等量小样的裂解后的肽“Lys(AQ)SerGlyProLeuGly”(pCP(AQ)，SEQ ID NO:1)用作TLC运行过程中的参考。
发现，由CH2Cl2:MeOH＝3:1(Sigma-Aldrich)构成的流动相适用于分离pCP(AQ)与CP(AQ)。发现TLC适用于本实验，因为pCP(AQ)和CP(AQ)两者均共价键结至蒽醌-2-酸，蒽醌-2-酸在UV范围内吸收光，因此淬灭该板的荧光。再者，CP(AQ)承载带正电的精氨酸，比裂解后的肽pCP(AQ)显着增加片段极性。
在37℃，在温和摇动下，在50mM的pH 7.5的Borate缓冲液、5mM CaCl2中，完成蛋白分解反应(Seltzer et al.J Biol Chem Nov 25；265(33):20409-13,(1990)。将100μg的C(AQ)和处于100μl反应缓冲液中的0.2μg的纯化的重组MMP2加入这一缓冲液中。在定期的时间点，将1.5μl的反应等量小样加载在起始线上。将另外两种溶液与该反应样品一起制备，该另外两种溶液中一种具有处于100μl反应缓冲液中的100μg的CP(AQ)，另一种具有处于100μl反应缓冲液中的100μg的pCP(AQ)。两种溶液作为该反应样品拆分过程中的参考并作为降解对照。在传统实验室净化工作台的UV光下跟踪反应。以手机(Apple，iPhone 5S)拍摄该板在运行前后的图片。
结果
通过MMP2进行的CP(AQ)蛋白分解裂解的结果显示在图9中。对比TLC运行之前与之后的斑点强度，结果显示，以MMP2孵化CP(AQ)后，该化合物能将有机溶液从亲水性转化为疏水性(图9B，斑点R)。pCP(AQ)和CP(AQ)分别采取一致和相反的行为(图9B，斑点F和P)。
实施例6：通过BAT-CAR平台进行的肿瘤抗原靶向
材料和方法
本实验的目的为，证实该BAT-CAR平台能通过单独使用或与其抗原承载域关联的其靶向单元而以其肿瘤抗原为靶点。该BAT-CAR平台是模块化的，且可分为两个主要结构域：肿瘤靶向单元(TTU)和抗原承载单元(CU)。该平台结构组分呈现在图10中。
该TTU依次被分为两个结构域：肿瘤靶向肽和TTU-CU链接区域。该肿瘤靶向肽可由抗肿瘤抗原的抗体构成，但亦可由任何能以足够的特异性识别过表达在良性肿瘤细胞上的蛋白质的肽构成。如果该靶向单元是抗体，则可以是全长度IgG抗体、单链抗体(scFv)、或天然IgG的导致片段抗原结合区域(Fab)的蛋白水解产物。本实施例中，该肿瘤靶向肽是抗体曲妥珠单抗(Genentech Inc.，赫赛汀)。该TTU-CU链接区域由二价抗体构成，该二价抗体可识别曲妥珠单抗一侧的恒定区域的以及位于另一侧的CU上的特异性表位。本实验中，以Alexa fluor 647(ThermoFisher Scientific,#A20347)孵化该TTU，以溶于经由流式细胞术(AMH)完成TTU示踪。
该CU可分为四个区域：肽骨架、短PEG间隔区、蛋白酶可裂解的肽(CP(AQ))和PEG掩蔽尾部。
该肽骨架可由聚赖氨酸或聚谷氨酸盐或任何允许侧链偶合的聚合物组成。其含有被TTU上的TTU-CU链接域特异性识别的区域，且可在其一个末端被荧光标记。本实施例中，该肽骨架由聚赖氨酸组成并以FITC标记。该短PEG间隔区(Quanta Biodesign,Plain City,OH 43064)可以是位于该肽骨架与该CP(AQ)之间的PEG链接基团。该短PEG链接基团之后可以是不同的承载该抗原小分子的蛋白酶可裂解的肽。本实施例中，该蛋白酶可裂解的肽是CP(AQ)(SEQ ID NO:1)。为了比较起见，本实施例中，pCP(AQ)也偶合至该短PEG链接基团。本实施例中，CP(AQ)亦可链接至Alexa fluor 647(ThermoFisher Scientific,#A20347)。
该PEG掩蔽尾部(Quanta Biodesign)可以是不同的长度和复杂度，且可在末端结合至荧光团，该荧光团与在通过蛋白酶释放该掩蔽PEG尾部后位于该肽骨架上的荧光团不同。本实施例中，可将末端结合Alexa fluor 647(ThermoFisher Scientific,#A20347)的PEG12和PEG24偶合至CP(AQ)。
通过TTU进行的肿瘤靶点结合的定量
为了定量TTU以其同源肿瘤抗原为靶点的能力，将人HER2+细胞系(HCC1954)与TTU/AMH混合或仅与AMH混合。再者，以TTU/AMH孵化鼠皮肤黑色素瘤HER2+细胞系，以提供阴性对照。本实施例中，使用基于赫赛汀的抗-HER2-TTU/AMH。
为了测试该TTU的特异性，以细胞刮棒(MedSupply Partners#TL-TR9000)收获100,000HER2+HCC1954或HER2-B16F10细胞。当必要时，将该细胞在冰上于100μl的PBS 2％FBS中以1μg的抗HER2-TTU/AMH或1μg的AMH孵化30分钟。孵化之后，该细胞以400μl的PBS 2％FBS稀释，并在4℃以500g离心5分钟。丢弃上清液，将细胞再次悬浮于200μl的PBS 2％FBS中。最后，通过FalconFACS管(Corning,#352235)的管帽过滤该细胞，并将细胞保持在含冰的密封Styrofoam箱中以待分析。
对通过TTU/CU进行的靶点结合的确认
为了测试抗-HER2-TTU/CU结合，以细胞刮棒(MedSupply Partners#TL-TR9000)收获100,000HER2+HCC1954细胞。以0.4μg的TTU模块和0.4μg的不同架构的CU模块染色细胞，其中，该TTU模块与先前所述相同但未链接至任何荧光团(图10)。此处使用的所有CU均已经以位于其骨架的FITC标记。第二个样品也以-PEG2-pCP(AQ)标记，第三个样品以-PEG2-CP(AQ)-A647标记，第四个样品以-PEG2-CP(AQ)-PEG12-Alexa fluor 647标记，最后一个样品以-PEG2-CP(AQ)-PEG24-Alexa fluor 647标记。将TTU和CU两者同步加至该细胞。将该细胞在冰上染色30分钟，或在37℃和5％CO2中染色8小时。
在37℃孵化后，刮落细胞，并将上清液(500μl)转移至微量离心管内。随后以500μl的PBS 2％FBS稀释该细胞，并在4℃以500g离心5分钟。丢弃上清液，固体块以1000μl的PBS 2％FBS洗涤。最后，将该细胞再次悬浮于200μl的PBS 2％FBS中，并过滤通过Falcon FACS管(Corning,#352235)的管帽。将该细胞保持在含冰的密封Styrofoam箱中以待分析。
结果
通过TTU/AMH得到的靶向特异性显示在图11中。将未染色的HER2+HCC1954细胞的直方图与HER2-B16F10细胞的直方图重叠，表明抗-HER2-TTU/AMH不以靶点外的位点为靶向。正如预期，当以该抗-HER2-TTU/AMH复合体孵化HER2+HCC1954细胞时，给出了强的Alexa fluor 647信号。
通过FACS采集的用以证实通过TTU/CU的不同混合物(图10中的构造E)得到的肿瘤靶点的结合数据实例总结在图12中。
图12是抗-HER2-TTU和可变的CU对HER2+HCC1954细胞的染色。上图是显示以CU-FITC-CP(AQ)-PEG24-Alexa fluor 647±TTU染色的HCC1954细胞的数据。所采集的数据显示，TTU的加入增强了该CU至该靶点肿瘤细胞的结合。下图是显示以CU-FITC-CP(AQ)-PEG24-Alexa fluor 647+TTU染色的完整细胞群在冰上孵化30分钟后和在37℃/5％CO2中孵化8小时后的数据。由于具有相同FITC强度的细胞显示较低强度的A646信号，所采集的数据证实，在8小时孵化期间，存在最低限度的CP(AQ)裂解。图7的上图中，靶点为HCC1954细胞，效应子为±TTU和CU-FITC-CP(AQ)-PEG24-Alexa fluor 647。
实施例7：抗-FITC CAR T及其组分的构造
构造#1，编码包括“抗-FITC CAR T”的多肽
抗FITC-4M5.3抗体
信号肽–CD8a-sp|P01731|1-27
铰接区域–CD8a-sp|P01731|152-194
跨膜区域(TM)–CD28-sp|P31041|151-177
胞内域(ICD)–CD28-sp|P31041|178-218
胞内域(ICD)–41BB-sp|P20334|209-256
胞内域(ICD)–CD3z-sp|P241614|52-164
抗-FITC CAR T全肽
其它具体实施例
尽管已经连同其详细说明书而揭示本发明，前述说明书试图例示性说明而非限制本发明的范畴，本发明的范畴由所附权利要求书的范畴所界定。其它态样下、优点和修饰处于权利要求书的范畴内。