包含治疗剂的治疗性纳米粒及其制备和使用方法与流程
将某些药物递送至患者(例如，靶向特定组织或细胞类型或靶向具体疾病组织但不靶向正常组织)或控制药物释放的系统长久以来一直被认为是有益的。
例如，包括活性药物并且，例如，靶向特定组织或细胞类型或靶向具体疾病组织但不靶向正常组织的治疗剂可减少未被靶向的身体组织中的药物的量。在治疗诸如癌症(其中期望细胞毒性剂量的药物递送至癌细胞而不杀死周围的非癌组织)的病况时，这是特别重要的。有效药物靶向可减少抗癌疗法中常见的不期望和有时危及生命的副作用。此外，这样的治疗剂可使药物到达它们以其它方式不能到达的某些组织。
提供控制释放和/或靶向疗法的治疗剂还必须能够递送有效量的药物，其在其它纳米粒递送系统中是已知的限制。例如，制备具有与各纳米粒缔合的适量药物、同时保持纳米粒的大小足够小以具有有利递送性质的纳米粒系统可为一个挑战。
检查点抑制剂的治疗性递送为癌症提供了有前景的治疗。这些治疗剂需要有效且无毒的递送方法。然而，在递送这类剂中存在重大挑战，包括保持抗体完整性以免其降解。包括这样的抗体的纳米粒制剂通常受阻于不期望的性质，例如，爆发性释放特征和抗体降解。
因此，存在对纳米粒治疗剂和制备这样的纳米粒的方法的需求，其能递送抗体，同时还保持抗体的功效和效力。
发明概述
本文描述的是包含治疗剂的治疗性和/或药学上可接受的聚合物纳米粒，其中治疗性纳米粒和抗pd-1抗体给药于患者。在一些实施方案中，纳米粒包封治疗剂(例如，多西他赛)，并且治疗性纳米粒和抗pd-1抗体并行(side-by-side)给药于患者以进行治疗。在一些实施方案中，抗pd-1抗体和治疗剂(例如，多西他赛)包封在纳米粒内。在一些实施方案中，治疗性纳米粒和抗pd-1抗体给药(并行，或纳米粒内具有抗pd-1抗体和治疗剂)于患有鳞状非小细胞肺癌的患者。在一些实施方案中，治疗性纳米粒还包括疏水性抗衡离子剂。
所涵盖的纳米粒可包含作为检查点抑制剂的抗体。例如，所涵盖的纳米粒可包含抗pd-1抗体。应当理解，纳米粒可以包含疏水性抗衡离子剂。还应当理解，抗体可以包封在纳米粒内，或者可以连接至纳米粒，或者可以与治疗性纳米粒并行给药。
附图简述
图1是形成所公开的纳米粒的乳化方法的流程图。
图2a和2b显示所公开的乳化方法的流程图。
图3：显示用同种型对照(10mg/kgq4dip)；抗pd-1(10mg/kgq4dip)；多西他赛纳米粒(10mg/kgq4dip)；和多西他赛纳米粒+抗pd-1的治疗开始后平均肿瘤体积随时间的spider图。
图4：显示用抗pd-1治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
图5：显示用多西他赛纳米粒治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
图6：显示用抗pd-1和多西他赛纳米粒治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
图7：显示用同种型对照(10mg/kgq4dip)；抗pd-1(10mg/kgq4dip)；多西他赛纳米粒(10mg/kgq4dip)；和多西他赛纳米粒+抗pd-1的治疗开始后平均肿瘤体积随时间的spider图(重复功效研究)。
图8：显示治疗对体重没有显著影响的spider图。
图9：显示用同种型对照(10mg/kgivq4d)；抗pd-1(10mg/kgivq4d)；多西他赛(泰索帝-2.5mg/kgivq4d)；和多西他赛(泰索帝)+抗pd-1的治疗开始后平均肿瘤体积随时间的数据的spider图。
图10：显示治疗对体重没有显著影响的spider图。
图11：显示用同种型对照治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
图12：显示用抗pd-1治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图(重复研究)。
图13：显示用多西他赛纳米粒治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图(重复研究)。
图14：显示用抗pd-1和多西他赛纳米粒治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图(重复研究)。
图15：显示用多西他赛治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
图16：显示用抗pd-1和多西他赛治疗的单个小鼠的肿瘤生长的spider图。
发明详述
本文描述的是包含至少一种治疗剂(例如，多西他赛，或多西他赛和抗pd-1抗体)的聚合物纳米粒，以及制备和使用这样的治疗性纳米粒的方法。在一些实施方案中，所公开的纳米粒包含抗体，如为检查点抑制剂的抗pd-1抗体。在一些实施方案中，治疗性纳米粒包封治疗剂(例如，多西他赛)，并且纳米粒与抗pd-1抗体并行(或共同给药)给药于患者，例如患有鳞状非小细胞肺癌的患者。在一些实施方案中，在所公开的纳米粒中和/或包括在纳米粒制备方法中，包含(即，掺入)疏水性酸(例如，脂肪酸和/或胆汁酸)可以产生包括改善的药物负载的纳米粒。此外，在某些实施方案中，包含疏水性酸和/或在疏水性酸存在下制备的纳米粒可呈现改善的控制释放特性。例如，与在不存在疏水性酸的情况下制备的纳米粒相比，所公开的纳米粒可以更缓慢地释放抗体治疗剂。
本文涵盖的是包含抗体的纳米粒，诸如抗pd-1抗体，例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)等。
在另一方面，提供药学上可接受的组合物。药学上可接受的组合物可包含多种如本文所述的治疗性纳米粒和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含包封治疗剂(例如多西他赛)和抗pd-1抗体的纳米粒。在一些实施方案中，抗pd-1抗体未包封在纳米粒中。在一些实施方案中，抗pd-1抗体包封在纳米粒中。
在又一方面，提供治疗有此需要的癌症患者的方法。所述方法包括向患者给药治疗有效量的包含如本文所述的治疗性纳米粒的组合物。在一些实施方案中，组合物包含治疗性纳米粒，其包封至少一种治疗剂(例如，多西他赛，或多西他赛和抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，组合物包含包封至少一种治疗剂(例如，多西他赛)的治疗性纳米粒，并与抗pd-1抗体并行给药。
不希望受限于任何理论，相信所公开的包含疏水性酸(例如，脂肪酸和/或胆汁酸)的纳米粒制剂通过在治疗剂和酸之间形成疏水性离子对(hip)或疏水性抗衡离子，具有显著改善的制剂特性(例如，药物负载和/或释放特征)。如本文所使用的，hip是通过库仑吸引而保持在一起的一对带相反电荷的离子。在一些实施方案中，纳米粒内的抗体可与疏水性抗衡离子剂缔合。应当理解，术语“离子剂”或“离子对”不限于1:1的比率，而是指相反电荷的离子以任何比率被相互吸引。例如，带八个负电荷的治疗剂或抗体可与带八个正电荷的分子“配对”。或者，带八个正电荷的治疗剂或抗体可与八个负电荷“配对”。因此，如本文所使用的，离子对是通过库仑吸引而保持在一起的一对带相反电荷的离子。如本文所涵盖的，离子对形成可导致纳米粒具有例如增加的药物负载。由于在水溶液中的治疗剂的溶解度降低，例如在一些实施方案中，也可能发生治疗剂或抗体从纳米粒中较缓慢地释放。此外，将治疗剂或抗体与大疏水性抗衡离子复合可减缓治疗剂在聚合物基质内的扩散。有利地，离子对的形成不需要疏水性基团与治疗剂或抗体的共价缀合。
本文所公开的纳米粒包括一种、两种、三种或更多种的生物相容性和/或生物降解的聚合物。例如，所涵盖的纳米粒可包含约35重量％至约99.75重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99.75重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99.5重量％，在一些实施方案中约50重量％至约99重量％，在一些实施方案中约50重量％至约98重量％，在一些实施方案中约50重量％至约97重量％，在一些实施方案中约50重量％至约96重量％，在一些实施方案中约50重量％至约95重量％，在一些实施方案中约50重量％至约94重量％，在一些实施方案中约50重量％至约93重量％，在一些实施方案中约50重量％至约92重量％，在一些实施方案中约50重量％至约91重量％，在一些实施方案中约50重量％至约90重量％，在一些实施方案中约50重量％至约85重量％，在一些实施方案中约60重量％至约85重量％，在一些实施方案中约65重量％至约85重量％，以及在一些实施方案中约50重量％至约80重量％的一种或多种包含生物降解的聚合物及聚(乙二醇)(peg)的嵌段共聚物，以及约0重量％至约50重量％的生物降解的均聚物。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可包含约0.2重量％至约35重量％、约0.2重量％至约20重量％、约0.2重量％至约10重量％、约0.2重量％至约5重量％、约0.5重量％至约5重量％、约0.75重量％至约5重量％、约1重量％至约5重量％、约2重量％至约5重量％、约3重量％至约5重量％、约1重量％至约20重量％、约2重量％至约20重量％、约5重量％至约20重量％、约1重量％至约15重量％、约2重量％至约15重量％、约3重量％至约15重量％、约4重量％至约15重量％、约5重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约2重量％至约10重量％、约3重量％至约10重量％、约4重量％至约10重量％、约5重量％至约10重量％、约10重量％至约30重量％或约15重量％至约25重量％的治疗剂。
在某些实施方案中，所公开的纳米粒包含疏水性酸(例如，脂肪酸和/或胆汁酸)和/或通过包括疏水性酸的方法制备。与通过不含疏水性酸的方法制备的纳米粒相比，这样的纳米粒可以具有更高的药物负载。例如，通过包括疏水性酸的方法制备的公开的纳米粒的药物负载(例如，按重量计)可以比通过不含疏水性酸的方法制备的公开的纳米粒高约2倍至约10倍，或甚至更高。在一些实施方案中，通过包括疏水性酸的第一种方法制备的所公开的纳米粒的药物负载(按重量计)可以比通过第二种方法制备的公开的纳米粒高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍，其中第二种方法与第一种方法相同，除了第二种方法不包括疏水性酸。
涵盖任何合适的疏水性酸。在一些实施方案中，疏水性酸可以是羧酸(例如，一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸等)、亚磺酸、次磺酸或磺酸。在一些情况下，涵盖的疏水性酸可包括两种或更多种酸的混合物。在一些情况下，疏水性酸的盐可以用于制剂中。
例如，所公开的羧酸可以是脂肪族羧酸(例如，具有环状或无环、支链或无支链的烃链的羧酸)。在一些实施方案中，所公开的羧酸可以被一个或多个官能团取代，官能团包括但不限于卤素(即f、cl、br和i)、磺酰基、硝基和氧代。在某些实施方案中，所公开的羧酸可以是未被取代的。
示例性羧酸可包括被取代或未被取代的脂肪酸(例如，c6-c50脂肪酸)。在一些情况下，脂肪酸可以是c10-c20脂肪酸。在其他情况下，脂肪酸可以是c15-c20脂肪酸。在一些情况下，脂肪酸可以是饱和的。在其他实施方案中，脂肪酸可以是不饱和的。例如，脂肪酸可以是单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸基团的双键可以是顺式构象。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸的双键可以是反式构象。不饱和脂肪酸包括但不限于ω-3、ω-6和ω-9脂肪酸。
饱和脂肪酸的非限制性实例包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、木蜡酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、蜂花酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十六酸(ceroplasticacid)、三十六烷酸(hexatriacontanoicacid)及其组合。
不饱和脂肪酸的非限制性实例包括十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸(eicosatrienoicacid)、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸(meadacid)、芥子酸、神经酸、瘤胃酸、α-十八碳三烯酸、β-十八碳三烯酸、肝酸、α-桐油酸、β-桐油酸、梓树酸、石榴酸、rumelenic酸、α-十八碳四烯酸、β-十八碳四烯酸、伯色五烯酸、松子油酸、罗汉松酸、棕榈油酸、反型异油酸、顺式9-二十碳烯酸、芥子酸及其组合。
疏水性酸的其他非限制性实例包括芳香酸，如1-羟基-2-萘甲酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、双羟萘酸、肉桂酸、苯乙酸及其组合。
在一些实施方案中，疏水性酸可以是胆汁酸。胆汁酸的非限制性实例包括鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、hycholic酸、β-鼠胆酸、胆酸、氨基酸缀合胆汁酸及其组合。氨基酸缀合胆汁酸可以与任何合适的氨基酸缀合。在一些实施方案中，氨基酸缀合胆汁酸是甘氨酸缀合胆汁酸或牛磺酸缀合胆汁酸。
在一些情况下，涵盖的酸分子量可为小于约1000da、在一些实施方案中为小于约500da、在一些实施方案中为小于约400da、在一些实施方案中为小于约300da、在一些实施方案中为小于约250da、在一些实施方案中为小于约200da以及在一些实施方案中为小于约150da。在一些情况下，酸的分子量可为约100da至约1000da、在一些实施方案中为约200da至约800da、在一些实施方案中为约200da至约600da、在一些实施方案中为约100da至约300da、在一些实施方案中为约200da至约400da以及在一些实施方案中为约300da至约500da。
在一些实施方案中，可以至少部分地基于酸的强度选择疏水性酸。例如，在25℃下测得疏水性酸在水中的酸解离常数(pka)为约-5至约7、在一些实施方案中为约-3至约5、在一些实施方案中为约-3至约4、在一些实施方案中为约-3至约3.5、在一些实施方案中为约-3至约3、在一些实施方案中为约-3至约2、在一些实施方案中为约-3至约1、在一些实施方案中为约-3至约0.5、在一些实施方案中为约-0.5至约0.5、在一些实施方案中为约1至约7、在一些实施方案中为约2至约7、在一些实施方案中为约3至约7、在一些实施方案中为约4至约6、在一些实施方案中为约4至约5.5、在一些实施方案中为4至约5以及在一些实施方案中为约4.5至约5。在一些实施方案中，在25℃测得酸的pka可为小于约7、小于约5、小于约3.5、小于约3、小于约2、小于约1或小于约0。
在一些实施方案中，涵盖的疏水性酸的相变温度可有利于例如改善最终治疗性纳米粒中治疗性纳米粒的特性。例如，酸的熔点可低于约300℃，在一些情况下低于约100℃，以及在一些情况下低于约50℃。在某些实施方案中，酸的熔点可为约5℃至约25℃，在一些情况下为约15℃至约50℃、在一些情况下为约30℃至约100℃、在一些情况下为约75℃至约150℃、在一些情况下为约125℃至约200℃、在一些情况下为约150℃至约250℃以及在一些情况下为约200℃至约300℃。在一些情况下，酸的熔点可为低于约15℃，在一些情况下为低于约10℃，或在一些情况下为低于约0℃。在某些实施方案中，酸的熔点可为约-30℃至约0℃，或在一些情况下为约-20℃至约-10℃。
例如，可以至少部分地基于抗体治疗剂在含有酸的溶剂中的溶解度来选择用于本文公开的方法和纳米粒的酸。例如，在一些实施方案中，溶解在含有酸的溶剂中的抗pd-1抗体治疗剂的溶解度可为约700mg/ml至约900mg/ml、为约600mg/ml至约800mg/ml、为约500mg/ml至约700mg/ml至约800mg/ml、为约15mg/ml至约200mg/ml、为约20mg/ml至约200mg/ml、为约25mg/ml至约200mg/ml、为约50mg/ml至约200mg/ml、为约75mg/ml至约200mg/ml、为约100mg/ml至约200mg/ml、为约125mg/ml至约175mg/ml、为约15mg/ml至约50mg/ml、为约25mg/ml至约75mg/ml。在一些实施方案中，溶解在含有酸的溶剂中的抗体治疗剂的溶解度可大于约10mg/ml、大于约50mg/ml或大于约100mg/ml。在一些实施方案中，溶解在含有疏水性酸的溶剂(例如，由治疗剂、溶剂和疏水性酸组成的第一溶液)中的抗体治疗剂的溶解度可比抗体治疗剂溶解在不含疏水性酸的溶剂(例如，由治疗剂和溶剂组成的第二溶液)中的溶解度高至少约2倍、在一些实施方案中高至少约5倍、在一些实施方案中高至少约10倍、在一些实施方案中高至少约20倍、在一些实施方案中高约2倍至约20倍或者在一些实施方案中高约10倍至约20倍。
在一些情形下，酸在药物溶液中(即抗体治疗剂溶液)的浓度可为约1重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约2重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约4重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约6重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约8重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约10重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约12重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约14重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约16重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约9重量％，在一些实施方案中为约6重量％至约12重量％，在一些实施方案中为约9重量％至约15重量％，在一些实施方案中为约12重量％至约18重量％，以及在一些实施方案中为约15重量％至约21重量％。在某些实施方案中，疏水性酸在药物溶液中的浓度可以是至少约1重量％，在一些实施方案中至少约2重量％，在一些实施方案中至少约3重量％，在一些实施方案中至少约5重量％，在一些实施方案中至少约10重量％，在一些实施方案中至少约15重量％，以及在一些实施方案中至少约20重量％。
在某些实施方案中，在25℃下测得的疏水性酸的溶解度可小于约2g/100ml水，在一些实施方案中小于约1g/100ml水，在一些实施方案中小于约100mg/100ml水，在一些实施方案中小于约10mg/100ml水，以及在一些实施方案中小于约1mg/100ml水。在其他实施方案中，在25℃下测得的酸的溶解度可为约1mg/100ml水至约2g/100ml水，在一些实施方案中为约1mg/100ml水至约1g/100ml水，在一些实施方案中为约1mg/100ml水至约500mg/100ml水，以及在一些实施方案中为约1mg/100ml水至约100mg/100ml水。在一些实施方案中，疏水性酸在25℃下可基本上不溶于水。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可基本上不含在制备纳米粒期间使用的疏水性酸。在其他实施方案中，所公开的纳米粒可包含疏水性酸。例如，在一些实施方案中，所公开的纳米粒中的酸的含量可为约0.05重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约0.5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约2重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约7重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约10重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约15重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约20重量％至约30重量％，在一些实施方案中为约0.05重量％至约0.5重量％，在一些实施方案中为约0.05重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约1重量％至约5重量％，在一些实施方案中为约3重量％至约10重量％，在一些实施方案中为约5重量％至约15重量％，以及在一些实施方案中为约10重量％至约20重量％。
在一些实施方案中，例如，当在室温(例如，25℃)和/或在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒基本上立即释放(例如，经约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约1小时、约1小时或约24小时)少于约2％、少于约5％、少于约10％、少于约15％、少于约20％、少于约25％、少于约30％或少于约40％的抗生素治疗剂。在某些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含抗生素治疗剂的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放抗生素治疗剂：约0.01％至约50％，在一些实施方案中约0.01％至约25％，在一些实施方案中约0.01％至约15％，在一些实施方案中约0.01％至约10％，在一些实施方案中约1％至约40％，在一些实施方案中约5％至约40％，以及在一些实施方案中约10％至约40％的抗生素治疗剂经约1小时释放。在一些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含抗生素治疗剂的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放抗生素治疗剂：约10％至约70％，在一些实施方案中约10％至约45％，在一些实施方案中约10％至约35％，或在一些实施方案中约10％至约25％的多黏菌素/黏菌素抗生素治疗剂经约4小时释放。
在一些实施方案中，当在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒可基本上保留抗体治疗剂，例如，至少约1分钟，至少约1小时或更长。
在一些实施方案中，例如，当在室温(例如，25℃)和/或在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒基本上释放(例如，经约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约1小时、约1小时或约24小时)少于约2％、少于约5％、少于约10％、少于约15％、少于约20％、少于约25％、少于约30％或少于约40％的治疗剂或治疗剂-疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)，离子对。在某些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含治疗剂的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放治疗剂：约0.01％至约50％，在一些实施方案中约0.01％至约25％，在一些实施方案中约0.01％至约15％，在一些实施方案中约0.01％至约10％，在一些实施方案中约1％至约40％，在一些实施方案中约5％至约40％，以及在一些实施方案中约10％至约40％的治疗剂经约1小时释放。在一些实施方案中，当在例如25℃和/或在37℃下置于水溶液(例如，磷酸盐缓冲液)中时，包含治疗剂的纳米粒可以以基本上对应于以下的速度释放治疗剂：约10％至约70％，在一些实施方案中约10％至约45％，在一些实施方案中约10％至约35％，或在一些实施方案中约10％至约25％的治疗剂经约4小时释放。
在一些实施方案中，当在37℃下置于磷酸盐缓冲液中时，所公开的纳米粒可基本上保留治疗剂，例如，至少约1分钟，至少约1小时或更长。
在一些实施方案中，抗体治疗剂或抗pd-1抗体与包封另一种治疗剂的治疗性纳米粒一起给药。除了抗体之外，第二治疗剂可以包封在纳米粒内。在其他实施方案中，第二治疗剂包封在纳米粒内，并且抗体连接至纳米粒或连接至纳米粒的配体上。在其他实施方案中，治疗剂选自化学治疗剂，诸如阿霉素(doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))、米托蒽醌、吉西他滨(健择)、柔红霉素、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-fu)、长春花碱、长春花新碱、博莱霉素、紫杉醇(泰素)、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、cpt-11、10-羟基-7-乙基喜树碱(sn38)、达卡巴嗪、s-i卡培他滨、呋氟尿嘧啶、5'-脱氧氟尿苷、uft、恩尿嘧啶、脱氧胞苷、5-氮杂胞嘧啶、5-氮杂脱氧胞嘧啶、别嘌呤醇、2-氯腺苷、三甲氧喋呤、氨基蝶呤、亚甲基-10-去氮杂氨基蝶呤(mdam)、奥沙利铂、吡铂、四铂、沙铂、铂-dach、奥马铂、ci-973、jm-216及其类似物、表阿霉素、依托泊苷磷酸盐、9-氨基喜树碱、10,11-亚甲二氧基喜树碱、karenitecin、9-硝基喜树碱、tas103、长春地辛、l-苯丙氨酸氮芥、ifosphamidemefosphamide、培磷酰胺、曲磷胺卡莫司汀、司莫司汀、埃博霉素a-e、拓优得、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、安吖啶、依托泊苷磷酸盐、karenitecin、阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、金刚烷胺、金刚烷乙胺、拉米夫定、齐多夫定、贝伐单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、布地奈德、西罗莫司长春花新碱及其组合，或者治疗剂可以是sirna。
在一个实施方案中，所公开的治疗性纳米粒可包含靶向配体，例如，低分子量配体。在某些实施方案中，低分子量配体缀合至聚合物，并且纳米粒包含一定比率的配体缀合聚合物(例如，pla-peg-配体)与非官能化聚合物(例如，pla-peg或plga-peg)。纳米粒可具有优化比率的这两种聚合物，从而有效量的配体与纳米粒缔合用于治疗疾病或紊乱，诸如癌症。例如，增加的配体密度可增加靶点结合(细胞结合/靶点摄取)，使纳米粒“靶点特异”。或者，纳米粒中一定浓度的非官能化聚合物(例如，非官能化plga-peg共聚物)可控制炎症和/或免疫原性(即，激发免疫反应的能力)，并且使得纳米粒具有适于治疗疾病或紊乱的循环半衰期。此外，在一些实施方案中，非官能化聚合物可降低通过网状内皮系统(res)从循环系统的清除率。因此，非官能化聚合物可向纳米粒提供可使颗粒在给药后穿过身体的特征。在一些实施方案中，非官能化聚合物可平衡否则会较高的配体浓度，较高的配体浓度可加速个体的清除，导致向靶细胞的递送减少。
在一些实施方案中，本文公开的纳米粒可包含缀合至配体的官能化聚合物，其组成纳米粒整个聚合物组合物(即，官能化+非官能化聚合物)的约0.1-50摩尔％，例如，0.1-30摩尔％，例如，0.1-20摩尔％，例如，0.1-10摩尔％。还如本文所公开的，在另一实施方案中，包含与一种或多种低分子量配体缀合(例如，共价缀合(即，通过连接基(例如，亚烷基连接基))或键)的聚合物的纳米粒，其中低分子量配体相对于总聚合物的重量％为约0.001至5，例如，为约0.001至2，例如，为约0.001至1。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒可能能够有效地结合至生物实体或者与生物实体缔合，所述生物实体例如，特定的膜组分或细胞表面受体。应该理解，肽、配体、蛋白、抗体或纳米抗体也可用于靶向纳米粒。治疗剂的靶向(例如，靶向特定组织或细胞类型，靶向具体疾病组织但不靶向正常组织等)对于治疗组织特异性疾病(如实体癌(例如，前列腺癌))是期望的。例如，与全身递送细胞毒性抗癌剂相反，本文公开的纳米粒可基本上防止剂杀死健康细胞。另外，所公开的纳米粒可使得给药较低剂量的剂(与没有用公开的纳米粒或制剂给药的有效量的剂相比)，其可以减少通常与传统化疗有关的不期望的副作用。
一般而言，“纳米粒”指直径小于1000nm(例如，约10nm至约200nm)的任何颗粒。所公开的治疗性纳米粒可包括具有以下直径的纳米粒：约60至约120nm，或约70至约120nm，或约80至约120nm，或约90至约120nm，或约100至约120nm，或约60至约130nm，或约70至约130nm，或约80至约130nm，或约90至约130nm，或约100至约130nm，或约110至约130nm，或约60至约140nm，或约70至约140nm，或约80至约140nm，或约90至约140nm，或约100至约140nm，或约110至约140nm，或约60至约150nm，或约70至约150nm，或约80至约150nm，或约90至约150nm，或约100至约150nm，或约110至约150nm，或约120至约150nm。应该理解，所公开的纳米粒可以形成特定大小，其可决定摄取途径、循环时间、靶向、内化和/或清除。聚合物
在一些实施方案中，纳米粒可包含聚合物基质和治疗剂，诸如上述的治疗剂，包括抗pd-1抗体，任选地与疏水性抗衡离子剂一起，例如与疏水性抗衡离子剂的离子对，诸如内-溶酶体破坏剂。在一些实施方案中，治疗剂和/或靶向部分(即，低分子量配体)可与聚合物基质的至少一部分缔合。例如，在一些实施方案中，靶向部分(例如，配体)可与聚合物基质的表面共价缔合。在一些实施方案中，通过连接基介导共价缔合。治疗剂可与聚合物基质的表面缔合，封装于聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散遍及聚合物基质。
药物递送技术领域中已知广泛多种聚合物和由其形成颗粒的方法。在一些实施方案中，本公开涉及具有至少两种大分子的纳米粒，其中第一大分子包含结合至低分子量配体(例如，靶向部分)的第一聚合物；以及第二大分子包含不结合至靶向部分的第二聚合物。纳米粒可任选地包含一种或多种另外的非官能化聚合物。
可在所公开的纳米粒中使用任何合适的聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。就序列而言，共聚物可以是随机的、嵌段或包含随机及嵌段序列的组合。通常，聚合物是有机聚合物。
本文所使用的术语“聚合物”具有其在如本领域中所使用的通常含义，即包含一个或多个通过共价键连接的重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或在一些情形下可在聚合物中存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物可以是生物来源的，即，生物聚合物。非限制性实例包括肽或蛋白质。在一些情况下，另外的部分也可存在于聚合物中，例如，生物部分，诸如下文中描述的那些。若多于一种类型的重复单元存在于聚合物中，则聚合物称为“共聚物”。应理解，在使用聚合物的任何实施方案中，在一些情况下所使用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以任何方式排列。例如，重复单元可以随机顺序、以交替顺序或作为嵌段共聚物(即，包含一个或多个各包含第一重复单元(例如，第一嵌段)的区域，以及一个或多个各包含第二重复单元(例如，第二嵌段)的区域)等排列。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。
所公开的颗粒可包含共聚物，在一些实施方案中其描述彼此缔合的两种或更多种聚合物(诸如本文所描述的那些)，通常通过将两种或更多种聚合物共价键合。因此，共聚物可包含缀合在一起以形成嵌段共聚物的第一聚合物和第二聚合物，其中第一聚合物可以是嵌段共聚物的第一嵌段，第二聚合物可以是嵌段共聚物的第二嵌段。当然，本领域普通技术人员会理解，在一些情况下，嵌段共聚物可含有多个聚合物嵌段，并且本文所使用的“嵌段共聚物”并不仅限于仅具有单一第一嵌段及单一第二嵌段的嵌段共聚物。例如，嵌段共聚物可包含包含第一聚合物的第一嵌段、包含第二聚合物的第二嵌段以及包含第三聚合物或第一聚合物的第三嵌段等。在一些情况下，嵌段共聚物可含有任何数量的第一聚合物的第一嵌段以及第二聚合物的第二嵌段(以及在某些情况下，第三嵌段、第四嵌段等)。此外，应注意，在一些情形下，嵌段共聚物也可由其他嵌段共聚物形成。例如，第一嵌段共聚物可缀合至另一聚合物(其可以是均聚物、生物聚合物、另一嵌段共聚物等)以形成含有多个类型嵌段的新嵌段共聚物，和/或缀合至其他部分(例如，至非聚合部分)。
在一些实施方案中，聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以是两亲性的，即具有亲水性部分及疏水性部分，或相对亲水性部分及相对疏水性部分。亲水性聚合物可以是一般吸引水的聚合物，疏水性聚合物可以是一般排斥水的聚合物。例如，可以通过制备聚合物样品并且测量其与水的接触角来鉴别亲水性或疏水性聚合物(通常，亲水性聚合物会具有小于60°的接触角，疏水性聚合物会具有大于约60°的接触角)。在一些情况下，两种或更多种聚合物的亲水性可以相对于彼此来测量，即，第一聚合物可以比第二聚合物更加亲水。例如，第一聚合物可具有小于第二聚合物的接触角。
在一组实施方案中，本文所涵盖的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)包括生物相容性聚合物，即，当插入或注射入活体个体时通常不诱导不良反应的聚合物，例如，无显著炎症和/或免疫系统对聚合物的急性排斥(例如通过t细胞应答)。因此，本文所涵盖的治疗性颗粒可以是非免疫原性的。本文所使用的术语非免疫原性指处于天然状态的内源性生长因子，其通常不引发或仅引发最低水平的循环抗体、t细胞或反应性免疫细胞，且其通常不在个体中引发针对自身的免疫应答。
生物相容性通常指至少部分免疫系统对物质的急性排斥，即植入个体中的非生物相容性物质在个体中激发免疫应答，其可足够严重使得免疫系统对物质的排斥不能被充分控制，且通常其程度使得必须从个体中去除所述物质。一种测定生物相容性的简单试验可以是体外将聚合物暴露于细胞；生物相容性聚合物是在中等浓度下(例如，在50微克/106个细胞的浓度下)通常不会导致显著细胞死亡的聚合物。例如，当暴露于细胞(诸如成纤维细胞或上皮细胞)时，即使被这样的细胞吞噬或摄取，生物相容性聚合物可引起小于约20％的细胞死亡。可用于各个实施方案中的生物相容性聚合物的非限制性实例包括聚二噁烷酮(pdo)、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(甘油癸二酸酯)、聚乙交酯(即聚(乙醇)酸)(pga)、聚丙交酯(即聚(乳)酸)(pla)、聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸(plga)、聚己酸内酯或包括这些和/或其它聚合物的共聚物或衍生物。
在某些实施方案中，所涵盖的生物相容性聚合物可以是生物降解的，即，聚合物能够在生理环境内(诸如在体内)化学地和/或生物地降解。如本文所使用的，“生物降解的”聚合物是当引入细胞中时通过细胞机制(生物学降解)和/或通过化学过程(诸如水解)(化学降解)分解成细胞可再利用或处置而对细胞无显著毒性作用的组分的那些聚合物。在一个实施方案中，生物降解的聚合物及其降解副产物可以是生物相容性的。
本文所公开的颗粒可含或可不含peg。此外，某些实施方案可涉及含有聚(酯-醚)的共聚物(例如，具有通过酯键(例如，r-c(o)-o-r'键)及醚键(例如，r-o-r'键)连接的重复单元的聚合物)。在一些实施方案中，含有羧酸基团的生物降解的聚合物(如可水解的聚合物)可与聚(乙二醇)重复单元缀合以形成聚(酯-醚)。含有聚(乙二醇)重复单元的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)也可称为“peg化”的聚合物。
例如，所涵盖的聚合物可以是在暴露于水时(例如，在个体内)自发水解的聚合物，或聚合物可以在暴露于热时(例如，在约37℃温度下)降解。聚合物的降解可以以不同速率发生，其取决于所使用的聚合物或共聚物。例如，聚合物的半衰期(50％的聚合物可以被降解成单体和/或其他非聚合物部分的时间)可以大约是数天、数周、数月或数年，其取决于聚合物。聚合物可以是生物学降解的，例如，通过酶活性或细胞机制，在一些情况下，例如，通过暴露于溶菌酶(例如，具有相对低的ph)。在一些情况下，聚合物可以分解成细胞可再利用或处置而对细胞无显著毒性作用的单体和/或其他非聚合物部分(例如，聚丙交酯可水解形成乳酸，聚乙交酯可水解形成乙醇酸等)。
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，其包括包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，诸如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(在本文中统称为“plga”)；以及包含乙醇酸单元的均聚物，本文称为“pga”，和包含乳酸单元的均聚物，诸如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d,l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯和聚-d,l-丙交酯，在本文统称为“pla”。在一些实施方案中，示例性聚酯包括，例如，聚羟基酸；丙交酯和乙交酯的peg化聚合物及共聚物(例如，peg化pla、peg化pga、peg化plga及其衍生物)。在一些实施方案中，聚酯包括，例如，聚酐、聚(原酸酯)、peg化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、peg化聚(己内酯)、聚赖氨酸、peg化聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、peg化聚(乙烯亚胺)、聚(l-丙交酯-共-l-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]及其衍生物。
在一些实施方案中，聚合物可以是plga。plga是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物降解的共聚物，并且可通过乳酸:乙醇酸的比率表征各种形式的plga。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸或d,l-乳酸。可通过改变乳酸-乙醇酸比率来调节plga的降解速率。在一些实施方案中，plga可通过大约85:15、大约75:25、大约60:40、大约50:50、大约40:60、大约25:75或大约15:85的乳酸:乙醇酸的比率表征。在一些实施方案中，可以选择颗粒聚合物(例如，plga嵌段共聚物或plga-peg嵌段共聚物)中的乳酸与乙醇酸单体的比率以优化各种参数，诸如可以优化水摄取、治疗剂释放和/或聚合物降解动力学。
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸聚丙烯酰胺、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油基酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯、以及包含一种或多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可包含具有低含量季铵基团的丙烯酸和甲基丙烯酸酯的完全聚合共聚物。
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。通常，阳离子聚合物能够缩合和/或保护带负电荷的核酸链(例如，dna、rna或其衍生物)。在一些实施方案中，在所公开的颗粒中涵盖使用含胺聚合物，诸如聚(赖氨酸)、聚乙烯亚胺(pei)和聚(酰胺-胺)树枝状大分子。
在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯。这些聚酯的实例包括聚(l-丙交酯-共-l-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)。
涵盖例如，当peg未缀合至配体时，peg可被封端并且包括末端基团。例如，peg可封端于羟基、甲氧基或其他烷氧基、甲基或其他烷基、芳基、羧酸、胺、酰胺、乙酰基、胍基或咪唑。其他所涵盖的末端基团包括叠氮化物、炔烃、马来酰亚胺、醛、酰肼、羟胺、烷氧基胺或硫醇部分。
本领域普通技术人员会知晓使聚合物peg化的方法和技术，例如，通过使用edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)使聚合物与以胺封端的peg基团反应、通过开环聚合技术(romp)等等。
在一个实施方案中，可优化聚合物的分子量(或例如，例如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)以用于如本文公开的有效治疗。例如，聚合物的分子量可影响颗粒降解速率(诸如，当可调整生物降解的聚合物的分子量时)、溶解度、水摄取和药物释放动力学。例如，可调整聚合物的分子量(或例如，例如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)从而使颗粒在合理的时间段内(从数小时至1-2周、3-4周、5-6周、7-8周等)在所治疗的个体中生物降解。
所公开的颗粒，例如，可包含peg和pl(g)a的二嵌段共聚物，其中例如，peg部分可具有约1,000-20,000，例如，约2,000-20,000、例如，约2至约10,000的数均分子量，pl(g)a部分可具有约5,000至约20,000或约5,000-100,000，例如，约20,000-70,000、例如，约15,000-50,000的数均分子量。
例如，本文所公开的是示例性治疗性纳米粒，其包含约10重量％至约99重量％的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物，或约20重量％至约80重量％、约40重量％至约80重量％或约30重量％至约50重量％或约70重量％至约90重量％的聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物。示例性聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物可包括约10至约20kda、约15至约20kda或约10至约25kda数均分子量的聚(乳)酸和约4至约6或约2kda至约10kda数均分子量的聚(乙)二醇。
在一些实施方案中，聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物可以具有约0.6至约0.95数均分子量分数的聚(乳)酸，在一些实施方案中为约0.7至约0.9、在一些实施方案中为约0.6至约0.8、在一些实施方案中为约0.7至约0.8、在一些实施方案中为约0.75至约0.85、在一些实施方案中为约0.8至约0.9以及在一些实施方案中为约0.85至约0.95。应当理解的是，聚(乳)酸数均分子量分数可通过共聚物的聚(乳)酸组分的数均分子量除以聚(乳)酸组分的数均分子量和聚(乙)二醇组分的数均分子量的和。
所公开的纳米粒可任选地包含约1重量％至约50重量％的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸(其不包括peg)，或可任选地包含约1重量％至约50重量％或约10重量％至约50重量％或约30重量％至约50重量％的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸。例如，聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸可具有约5至约15kda或约5至约12kda的数均分子量。示例性pla可具有约5至约10kda的数均分子量。示例性plga可具有约8至约12kda的数均分子量。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒可含有约10重量％至约30重量％、在一些实施方案中约10重量％至约25重量％、在一些实施方案中约10重量％至约20重量％、在一些实施方案中约10重量％至约15重量％、在一些实施方案中约15重量％至约20重量％、在一些实施方案中约15重量％至约25重量％、在一些实施方案中约20重量％至约25重量％、在一些实施方案中约20重量％至30重量％或在一些实施方案中约25重量％至约30重量％的聚(乙)二醇，其中聚(乙)二醇可以以聚(乳)酸-聚(乙)二醇共聚物、聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸-聚(乙)二醇共聚物或聚(乙)二醇均聚物存在。在某些实施方案中，纳米粒的聚合物可以缀合至脂质。例如，聚合物可以是脂质封端的peg。
靶向部分
在一些实施方案中，本文提供的是可包括任选靶向部分(即，能够结合至生物实体或与生物实体缔合的部分的纳米粒，所述生物实体例如，膜组分、细胞表面受体、抗原等。存在于颗粒表面的靶向部分可使颗粒定位于特定靶向位点，例如，肿瘤、疾病位点、组织、器官、某类细胞等。因此，纳米粒然后可以是“靶点特异性的”。在一些情况下，药物或其他有效负载(payload)然后可从颗粒释放并使得与特定靶向位点局部相互作用。
在一个实施方案中，所公开的纳米粒包含为低分子量配体的靶向部分。本文所使用的术语“结合”(“bind”或“binding”)指相关的一对分子或其部分之间的相互作用，其通常因特异性或非特异性结合或相互作用(包括但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用)而展现相互亲和力或结合能力。“生物学结合”定义发生于分子(包括蛋白质、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素等)对之间的一类相互作用。术语“结合配偶体”指可与特定分子进行结合的分子。“特异性结合”指分子(诸如聚核苷酸)能够以基本上高于其他类似生物实体的程度结合至或识别结合配偶体(或有限数量的结合配偶体)。在一组实施方案中，靶向部分具有小于约1微摩尔、至少约10微摩尔或至少约100微摩尔的亲和力(通过解离常数测量)。
例如，靶向部分可使得颗粒定位于个体身体内的肿瘤(例如，实体瘤)、疾病位点、组织、器官、某类细胞等，其取决于所使用的靶向部分。例如，低分子量配体可定位于实体瘤，例如，乳房或前列腺肿瘤或癌细胞。个体可以是人类或非人类动物。个体的实例包括但不限于，哺乳动物，诸如狗、猫、马、猴、兔、牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、灵长类动物、人类等。
所涵盖的靶向部分可以包括小分子。在某些实施方案中，术语“小分子”指具有相对低分子量并且不是蛋白质、多肽或核酸的有机化合物(不论是天然存在或人工产生(例如，通过化学合成)的)。小分子通常具有多个碳-碳键。在某些实施方案中，小分子的大小小于约2000g/mol。在一些实施方案中，小分子小于约1500g/mol或小于约1000g/mol。在一些实施方案中，小分子小于约800g/mol或小于约500g/mol，例如约100g/mol至约600g/mol或约200g/mol至约500g/mol。
在一些实施方案中，低分子量配体是式i、ii、iii或iv：
及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋物；
其中m和n各自独立地是0、1、2或3；p是0或1；
r1、r2、r4和r5各自独立地选自被取代或未被取代的烷基(例如，c1-10-烷基、c1-6-烷基或c1-4-烷基)、被取代或未被取代的芳基(例如，苯基或吡啶基)和其任意组合；并且r3是h或c1-6-烷基(例如，ch3)。
对于式i、ii、iii和iv的化合物而言，r1、r2、r4或r5包含与纳米粒的连接点，例如，与形成所公开的纳米粒的部分的聚合物(例如，peg)的连接点。连接点可以通过共价键、离子键、氢键、通过吸附(包括化学吸附和物理吸附)形成的键、来自范德华键形成的键或分散力形成。例如，如果r1、r2、r4或r5定义为苯胺或c1-6-烷基-nh2基团，则可去除这些官能化基团的任意氢(例如，氨基氢)，从而低分子量配体共价结合至纳米粒的聚合物基质(例如，聚合物基质的peg嵌段)。如本文所使用的，术语“共价键”指两个原子之间通过共享至少一对电子所形成的键。
在式i、ii、iii或iv的特定实施方案中，r1、r2、r3、r4和r5各自独立地是c1-6-烷基或苯基，或者c1-6-烷基或苯基的任意组合，其独立地被oh、sh、nh2或co2h取代一次或多次，并且其中烷基可插入n(h)、s或o。在另一个实施方案中，r1、r2、r4和r5各自独立地是ch2-ph、(ch2)2-sh、ch2-sh、(ch2)2c(h)(nh2)co2h、ch2c(h)(nh2)co2h、ch(nh2)ch2co2h、(ch2)2c(h)(sh)co2h、ch2-n(h)-ph、o-ch2-ph或o-(ch2)2-ph，其中各ph可以独立地被oh、nh2、co2h或sh取代一次或多次。对于这些式而言，nh2、oh或sh基团用作与纳米粒的共价连接点(例如，-n(h)-peg、-o-peg或-s-peg)。
示例性配体包括：
及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋物，其中nh2、oh或sh基团用作与纳米粒的共价连接点(例如，-n(h)-peg、-o-peg或-s-peg)或
在一些实施方案中，可用于靶向与实体瘤(诸如前列腺或乳腺癌肿瘤)有关的细胞的小分子靶向部分包括psma肽酶抑制剂，诸如2-pmpa、gpi5232、va-033、苯基烷基膦酰胺和/或其类似物及衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括硫醇和吲哚硫醇衍生物，诸如，2-mppa及3-(2-巯乙基)-1h-吲哚-2-甲酸衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括氧肟酸酯衍生物。在一些实施方案中，可用于靶向与前列腺癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括基于pbda和基于脲的抑制剂(诸如，zj43、zj11、zj17、zj38和/或其类似物及衍生物)、雄激素受体靶向剂(arta)、多胺(诸如，腐胺、精胺和亚精胺)、谷氨酸羧化酶ii(gcpii)(也称为naag肽酶或naaladase)的抑制剂。
在一些实施方案中，所涵盖的配体可以是小分子dppiv抑制剂，其可以靶向成纤维细胞活化蛋白(fap)用于治疗实体瘤。磺胺(乙酰唑胺和其他)配体可靶向g250抗原用于治疗ccrcc(肾透明细胞癌)和其他实体瘤。配体可以包括靶向氯毒素受体的氯毒素用于治疗胶质母细胞瘤和实体瘤。小分子可以靶向cxcr4和基质金属蛋白酶(mmp)用于治疗白血病、淋巴瘤和血管生成中的上调。
在另一个实施方案中，靶向部分可以是靶向叶酸受体或toll受体的配体。在另一个实施方案中，靶向部分是叶酸(folate)、叶酸(folicacid)、小分子、抗体和纳米抗体。
靶向部分可以包括靶向抗体。所涵盖的抗体靶向epcam(cd326)、igf-r、间皮素、lewis-y抗原(cd174)、canag(muc1、pem、ca242、cd205)、ncam(cd56)、cripto、黑素转铁蛋白(p97)、糖蛋白nmb(cg56972)、cd70(cd27配体)、5t4(滋养层细胞糖蛋白)、cd57、cd206、cd44、癌胚抗原(cea)、gd2、cd40、纤连蛋白ed-b、内皮糖蛋白(cd105)、生腱蛋白c、磷脂酰丝氨酸(ps)、her3、cd30、cd33、cd40、cd52、cd74、cd138、cs1(cd319、cracc)、tag-72、cd2、cd64、robo4、dll4、tie2和/或b7-h3。例如，生腱蛋白c可以被生腱蛋白c靶向抗体靶向以治疗神经胶质瘤和癌。her3可以被调蛋白或her3靶向抗体靶向以治疗实体瘤。cd33抗体可以靶向cd33用于治疗aml。例如，可以用靶向epcam(cd326)、igf-r、间皮素、lewis-y抗原(cd174)、canag(muc1、pem、ca242、cd205)、ncam(cd56)和cripto的抗体治疗实体瘤。可以用靶向黑素转铁蛋白(p97)的抗体治疗原发性和转移性黑色素瘤。cd30可以被抗体靶向用于治疗霍奇金病和alc淋巴瘤。cd74可以被抗体靶向用于治疗多发性骨髓瘤、nhl或cll。affymax肽可以靶向trailr2用于治疗实体瘤。肽(诸如dyaxlitt)可以靶向c-met用于治疗实体瘤。其他肽和小分子配体可以靶向epha2和ephb2用于治疗实体瘤。
例如，所涵盖的靶向部分可以包括核酸、适体、多肽、糖蛋白、碳水化合物或脂质。例如，靶向部分可以是结合至细胞类型特异性标记物的核酸靶向部分(例如，适体，例如，a10适体)。通常，适体是结合至特定靶点(诸如多肽)的寡核苷酸(例如，dna、rna或其类似物或衍生物)。在一些实施方案中，靶向部分可以是用于细胞表面受体的天然存在的或合成的配体，例如，生长因子、激素、ldl、转铁蛋白等。靶向部分可以是抗体，该术语意指包括抗体片段。例如，可使用诸如噬菌体展示等过程来鉴别抗体、单链靶向部分的特征部分。
靶向部分可以是具有长度长达约50个残基的靶向多肽或靶向肽模拟物。例如，靶向部分可以包括氨基酸序列akerc、creka、arylqkln或axylzzln，其中x和z是可变氨基酸，或其保守性变体或肽模拟物。在特定实施方案中，靶向部分是肽，其包括氨基酸序列akerc、creka、arylqkln或axylzzln，其中x和z是可变氨基酸并且具有长度少于20、50或100个残基。也涵盖creka(cysargglulysala)肽或其肽模拟物或八肽axylzzln作为靶向部分，以及肽或其保守性变体或肽模拟物，其与胶原蛋白iv结合或形成复合物，或靶向组织基底膜(例如，血管的基底膜)。示例性靶向部分包括靶向icam(细胞间黏附分子，例如，icam-1)的肽。其他基于肽的靶向部分可以是affymax、dyaxlitt、ysa/swl、ngr肽和具有乌苯美司的类似物、奥曲肽、cck和胃泌素类似物、亮丙瑞林和类似物、glp1/艾塞那肽、凝集素和mercator。应该理解，靶向配体可以靶向trailr2、c-met、epha2、ephb2、氨肽酶n(cd13)、vla-4(α4β1整合素)、cxcr4、黑素皮质素受体(mc1r)、生长抑素受体、胆囊收缩素受体、gnrh受体、glp1-受体、e-选择素、il-11受体、血小板应答蛋白-1受体、内皮细胞抑制素、cd79和cd74。
在一些实施方案中，本文所公开的靶向部分可以缀合至所公开的聚合物或共聚物(例如，pla-peg)，并且这样的聚合物缀合物可以形成所公开的纳米粒的部分。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒可以包括聚合物-药物缀合物。例如，药物可以缀合至所公开的聚合物或共聚物(例如，pla-peg)，并且这样的聚合物-药物缀合物可以形成所公开的纳米粒的部分。例如，所公开的治疗性纳米粒可以任选地包括约0.2重量％至约30重量％的pla-peg或plga-peg，其中peg被药物官能化(例如，pla-peg-药物)。
可以使用任意合适的缀合技术形成所公开的聚合物缀合物(例如，聚合物-配体缀合物)。例如，可以使用诸如以下技术使两种化合物(诸如靶向部分或药物和生物相容性聚合物(例如，生物相容性聚合物和聚(乙二醇)))缀合在一起：edc-nhs化学(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺)或涉及马来酰亚胺或羧酸(其可缀合至硫醇、胺或类似官能化聚醚的一端)的反应。靶向部分或药物和聚合物形成聚合物-靶向部分缀合物或聚合物-药物缀合物的缀合可在有机溶剂(诸如但不限于，二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮等)中进行。本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定具体反应条件。
在另一组实施方案中，可通过使包含羧酸官能团的聚合物(例如，聚(酯-醚)化合物)与包含胺的聚合物或其他部分(诸如靶向部分或药物)反应来进行缀合反应。例如，靶向部分(诸如低分子量配体)或药物(诸如达沙替尼)可与胺反应形成含胺部分，其然后可缀合至聚合物的羧酸。这样的反应可以以单一步骤反应发生，即，在不使用中间体(例如，n-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺)下进行缀合。在一些实施方案中，可使药物与含胺连接基反应形成含胺药物，其然后可缀合至如上文所述的聚合物的羧酸。在一组实施方案中，可通过以下方式来实现含胺部分与羧酸封端的聚合物(诸如聚(酯-醚)化合物)之间的缀合反应：将溶于有机溶剂(诸如(但不限于)二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二恶烷或二甲基亚砜)中的含胺部分添加至含有羧酸封端的聚合物的溶液中。羧酸封端的聚合物可含于有机溶剂(诸如，但不限于，二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或丙酮)中。在一些情况下，含胺部分与羧酸封端的聚合物之间的反应可自发发生。可以在这样的反应之后洗涤掉未缀合反应物，并且可使聚合物沉淀于溶剂(诸如，例如，乙醚、己烷、甲醇或乙醇)中。在某些实施方案中，可在含醇部分和聚合物的羧酸官能团之间形成缀合物，其可如上述用于胺和羧酸的缀合物类似地来实现。
应该理解，在一些实施方案中，纳米粒可包含两种不同类型的配体。例如，纳米粒可包含小分子配体和核酸类型配体。在一些实施方案中，纳米粒可包含三种不同类型的配体。在一些实施方案中，纳米粒可包含多种不同类型的配体。应该理解，所公开的纳米粒可包括任意数量的不同配体。纳米粒的制备
本公开的另一方面涉及制备所公开的纳米粒的系统和方法。在一些实施方案中，使用不同比率的两种或更多种不同的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)并从聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)产生颗粒，颗粒的性质被控制。例如，一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以包括低分子量配体，而另一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以针对其生物相容性和/或其控制所得颗粒的免疫原性的能力来选择。
所公开的纳米粒例如在可含有糖的溶液中，在室温下或在25℃下可以稳定(例如，基本上保留所有活性剂)至少约3天、约4天或至少约5天。
在一些实施方案中，所公开的纳米粒还可包含脂肪醇，其可增加药物释放速率。例如，所公开的纳米粒可包含c8-c30醇，诸如鲸蜡醇、辛醇、硬脂醇、花生醇、二十二醇或八烷醇(octasonal)。
纳米粒可具有控制释放特性，例如，能够经延长的时间段(例如，超过1天、1周或更长时间)将一定量的多黏菌素/黏菌素抗生素治疗剂递送至患者，例如递送至患者的特定部位。
在一些实施方案中，在向个体或患者给药所公开的纳米粒或包含所公开的纳米粒的组合物后，患者体内多黏菌素/黏菌素抗生素治疗剂的血浆浓度的峰值(cmax)与单独给药(例如，不作为纳米粒的一部分)的治疗剂cmax相比显著更高。
在另一个实施方案中，当向个体给药包含治疗剂的所公开的纳米粒时，与单独给药的治疗剂的tmax相比可具有显著更长的治疗剂tmax。
也可以形成这样的颗粒的文库。例如，通过改变颗粒内两种(或更多种)聚合物的比例，这些文库可用于筛选试验、高通量测定等。文库内的实体可以根据如上所述的特性而变化，并且在一些情况下，可以在文库内改变颗粒的一种以上的特性。因此，一个实施方案涉及具有不同比例的具有不同特性的聚合物的纳米粒文库。该文库可包括任何合适比例的聚合物。
在一些实施方案中，生物相容性聚合物是疏水性聚合物。生物相容性聚合物的非限制性实例包括聚丙交酯、聚乙交酯和/或聚(丙交酯-共-乙交酯)。
在不同的实施方案中，本公开提供纳米粒，其包含1)聚合物基质；2)任选地，包围或分散在形成颗粒的连续或不连续的壳的聚合物基质内的两亲化合物或层；3)可以形成聚合物基质的一部分的非官能化聚合物，和4)任选地，低分子量配体，其与靶蛋白缀合物诸如psma结合，共价连接至聚合物，可以形成聚合物基质的一部分。例如，两亲层可以减少水渗透到纳米粒中，从而增强药物包封效率并减缓药物释放。
如本文所用，术语“两亲”是指分子同时具有极性部分和非极性部分的特性。通常，两亲化合物具有连接至长疏水尾部的极性头部。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可以具有形式正电荷或形式负电荷。或者，极性部分可以同时具有形式正电荷和负电荷，并且是两性离子或内盐。在一些实施方案中，两亲化合物可以是(但不限于)以下的一种或多种：天然衍生的脂质、表面活性剂或者同时具有亲水和疏水部分的合成化合物。
两亲化合物的具体实例包括但不限于以下磷脂，诸如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二(二十二酰基)磷脂酰胆碱(dbpc)、二(二十三酰基)磷脂酰胆碱(dtpc)、二(二十四酰基)磷脂酰胆碱(dlpc)，其以0.01-60(重量，脂质/w聚合物)，最优选0.1-30(重量，脂质/w聚合物)的比例掺入。可以使用的磷脂包括但不限于磷脂酸、具有饱和脂质和不饱和脂质的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心磷脂和β-酰基-γ-烷基磷脂。磷脂的实例包括但不限于磷脂酰胆碱诸如二油酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二(十五酰基)磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二花生酰基磷脂酰胆碱(dapc)、二(二十二酰基)磷脂酰胆碱(dbpc)、二(二十三酰基)磷脂酰胆碱(dtpc)、二(二十四酰基)磷脂酰胆碱(dlpc)；和磷脂酰乙醇胺诸如二油酰基磷脂酰乙醇胺或1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油磷酸乙醇胺。也可以使用合成的具有不对称酰基链的磷脂(例如，一个酰基链有6个碳原子，另一个酰基链有12个碳原子)。
在具体实施方案中，可用于形成两亲层的两亲组分是卵磷脂，特别是磷脂酰胆碱。卵磷脂是两亲脂质，并且因此形成磷脂双层，其具有面向其周围(通常含水)的亲水(极性)头部，并且疏水性尾部彼此相对。卵磷脂具有为天然脂质的优点，可从例如大豆获得，并且已经获得fda批准用于其他递送装置。此外，脂质(诸如卵磷脂)的混合物比单一纯脂质更有利。
在某些实施方案中，所公开的纳米粒具有两亲单层，意指该层不是磷脂双层，而是作为纳米粒周围或内部的单连续或不连续层存在。两亲层与纳米粒“缔合”，意指它位于与聚合物基质邻近的某些位置，如围绕聚合物壳的外部，或分散在构成纳米粒的聚合物内。
在一组实施方案中，通过提供包含一种或多种聚合物的溶液，并使该溶液与聚合物非溶剂接触以产生颗粒来形成颗粒。溶液可与聚合物非溶剂混溶或不混溶。例如，水混溶性液体(诸如，乙腈)可含有聚合物，并且，例如，通过以受控速率将乙腈倾倒至水中来使乙腈与水、聚合物非溶剂接触，形成颗粒。含于溶液中的聚合物在与聚合物非溶剂接触时，然后可沉淀以形成颗粒，诸如纳米粒。当在环境温度和压力下一种液体不溶于另一种液体至少10重量％的水平时，这两种液体可称为彼此“不混溶(immiscible)”或不混溶(notmiscible)。通常，有机溶液(例如，二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二恶烷、二甲基亚砜等)和含水液体(例如，水，或含有溶解盐或其它种类、细胞或生物介质、乙醇等的水)彼此不混溶。例如，可将第一溶液倾倒至第二溶液中(以适宜速率或速度)。在一些情况下，当第一溶液与不混溶的第二液体接触时，可形成颗粒，诸如纳米粒，例如，在将第一溶液倾倒至第二液体中时，聚合物在接触时发生沉淀使得聚合物形成纳米粒，在一些情况下，例如，当小心控制引入速率并且保持在相对缓慢速率时，可形成纳米粒。本领域普通技术人员仅使用常规实验即可容易地优化这样的颗粒形成的控制。
可使用所公开的方法高度控制性质，诸如，表面官能性、表面电荷、大小、zeta(ζ)电位、疏水性、控制免疫原性的能力等。例如，可合成颗粒文库，并且筛选以鉴别具有使得颗粒具有特定密度的存在于颗粒表面上的部分(例如，低分子量配体)的特定聚合物比率的颗粒。这使得能制备具有一种或多种特定性质(例如，部分的特定大小和特定表面密度)的颗粒，而无需过多努力。因此，某些实施方案涉及使用这样的文库的筛选技术，以及使用这样的文库鉴别任何颗粒。此外，可通过任意合适方法来进行鉴别。例如，鉴别可以是直接或间接，或定量或定性进行。
在一些实施方案中，使用类似于那些记载的用于产生配体官能化聚合物缀合物的程序用靶向部分对已形成的纳米粒官能化。例如，将第一共聚物(plga-peg、聚(丙交酯-共-乙交酯)和聚(乙二醇))与治疗剂混合以形成颗粒。然后使颗粒与低分子量配体缔合以形成纳米粒，其可用于治疗癌症。颗粒可与不同量的低分子量配体缔合以控制纳米粒的配体表面密度，由此改变纳米粒的治疗性特征。另外，例如，通过控制参数(诸如分子量、peg分子量和纳米粒表面电荷)可获得极精确控制的颗粒。
在另一个实施方案中，提供纳米乳化方法，诸如图1、2a和2b中所表示的方法。例如，可将治疗剂(例如达沙替尼)、第一聚合物(例如，二嵌段共聚物(诸如pla-peg或plga-peg，其中的任一个可任选地结合至配体))和任选的第二聚合物(例如，(pl(g)a-peg或pla)与有机溶液组合以形成第一有机相。这样的第一相可包括约1重量％至约50重量％固体、约5重量％至约50重量％固体、约5重量％至约40重量％固体、约1重量％至约15重量％固体或约10重量％至约30重量％固体。该第一有机相可与第一含水溶液组合以形成第二相。有机溶液可包括，例如，甲苯、甲基乙基酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷(methylenechloride)、二氯甲烷(dichloromethane)、氯仿、丙酮、苯甲醇、tween80、span80等。在实施方案中，有机相可包括苯甲醇、乙酸乙酯及其组合。第二相可以是约0.1重量％至50重量％、约1重量％至50重量％、约5重量％至40重量％或约1重量％至15重量％的固体。含水溶液可以是任选地与胆酸钠、乙酸乙酯、聚乙酸乙烯酯及苯甲醇中的一种或多种组合的水。在一些实施方案中，含水相的ph可基于治疗剂的pka和/或疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)的pka选择。
例如，油或有机相可使用仅部分地与非溶剂(水)混溶的溶剂。因此，在以足够低比率混合时和/或在使用经有机溶剂预饱和的水时，油相仍为液体。油相可乳化至含水溶液中并且作为液滴，例如，使用高能量分散系统(诸如，均化器或超声处理器)剪切成纳米粒。乳液的含水部分(另外称为“水相”)可以是由胆酸钠组成并且经乙酸乙酯和苯甲醇预饱和的表面活性剂溶液。在一些情形下，有机相(例如，第一有机相)可以包括治疗剂(例如抗体，如抗pd-1抗体)。另外，在某些实施方案中，含水溶液(例如，第一含水溶液)可包括基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)。在其他实施方案中，治疗剂和基本上疏水性抗衡离子剂(诸如内-溶酶体破坏剂)两者都可溶于有机相中。
例如，可以在一个或两个乳化步骤中进行乳化第二相以形成乳液相。例如，可制备初级乳液，然后乳化以形成细乳液。例如，可使用简单混合、高压均化器、探针超声处理器、搅拌棒或转子定子均化器来形成初级乳液。可通过使用，例如，探针超声处理器或高压均化器(例如，通过穿过均化器1、2、3或更多次)来使初级乳液形成细乳液。例如，当使用高压均化器时，所用压力可以是约30至约60psi、约40至约50psi、约1000至约8000psi、约2000至约4000psi、约4000至约8000psi或约4000至约5000psi，例如，约2000、2500、4000或5000psi。
在一些情况下，可选择细乳液条件(其特征可在于乳液中的滴液的非常高的表面体积比率)以最大化治疗剂的溶解度。在某些实施方案中，在细乳液条件下，所溶解组分可快速地发生平衡，即快于纳米粒的固化。
在一些实施方案中，可在乳化第二相之前将治疗剂于第二相中组合。在另一个实例中，治疗剂可溶于分开的混溶的溶液中，然后在乳化期间将其加入至第二相中。
可能需要溶剂蒸发或稀释以完成溶剂萃取和固化颗粒。为更好地控制提取动力学和更加可放大的(scalable)方法，可使用通过含水骤冷液(aqueousquench)的溶剂稀释。例如，可将乳液在冷水中稀释至足以溶解所有有机溶剂以形成骤冷相的浓度。在一些实施方案中，可至少部分地在约5℃或更低的温度下进行骤冷。例如，用于骤冷的水可在低于室温的温度下(例如，约0至约10℃或约0至约5℃)。在某些实施方案中，可选择具有有利于将乳液相骤冷的ph的骤冷液，例如，通过改善纳米粒的性质(诸如释放特征)或改善纳米粒参数(诸如药物负载)。可通过酸或碱滴定，例如或者通过适当选择缓冲液来调节骤冷液的ph。在一些实施方案中，骤冷液的ph的选择可基于治疗剂。
在一些实施方案中，用于纳米粒制剂方法(例如，包括但不限于含水相、乳液相、骤冷液和骤冷相)的含水溶液的ph可独立地选择并且可为约1至约3，在一些实施方案中为约2至约4，在一些实施方案中为约3至约5，在一些实施方案中为约4至约6，在一些实施方案中为约5至约7，在一些实施方案中为约6至约8，在一些实施方案中为约7至约9，以及在一些实施方案中为约8至约10。在某些实施方案中，用于纳米粒制剂方法的含水溶液的ph可为约3至约4，在一些实施方案中为约4至约5，在一些实施方案中为约5至约6，在一些实施方案中为约6至约7，在一些实施方案中为约7至约8，以及在一些实施方案中为约8至约9。
在一些实施方案中，不是所有治疗剂在此阶段都封装于颗粒中，将药物增溶剂加入至骤冷相中以形成溶解相。药物增溶剂可以是，例如，tween80、tween20、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精、十二烷基硫酸钠、胆酸钠、二乙基亚硝胺、乙酸钠、脲、甘油、丙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、聚(乙)二醇、双(聚氧乙烯乙二醇十二烷基醚(bris(polyoxyethyleneglycolddodecylether)、苯甲酸钠、水杨酸钠或其组合。例如，可将tween-80添加至骤冷纳米粒悬浮液中以溶解游离药物并防止形成药物晶体。在一些实施方案中，药物增溶剂与治疗剂分子的比率是约200:1至约10:1，或在一些实施方案中约100:1至约10:1。
可过滤溶解相以回收纳米粒。例如，可使用超滤膜浓缩纳米粒悬浮液，基本上消除有机溶剂、游离药物(即，未封装的治疗剂)、药物增溶剂和其他处理助剂(表面活性剂)。可使用切向流过滤系统进行示例性过滤。例如，通过使用孔径适于保留纳米粒而允许溶质、胶束和有机溶剂通过的膜，可选择性分离纳米粒。可使用具有300-500kda(～5-25nm)的分子量截留的示例性膜。
可使用恒定体积方式来进行渗滤，其意在可以与从悬浮液中去除滤液相同的速率向进料悬浮液中添加渗滤液(冷去离子水，例如，约0至约5℃，或0至约10℃)。在一些实施方案中，过滤可包括使用约0至约5℃或0至约10℃的第一温度和约20至约30℃或15至约35℃的第二温度的第一滤液。在一些实施方案中，过滤可包括处理约1至约30、在一些情况下约1至约15或在一些情况下1至约6的渗滤体积(diavolume)。例如，过滤可包括在约0至约5℃下处理约1至约30或在一些情况下约1至约6的渗滤体积，以及在约20至约30℃下处理至少一渗滤体积(例如，约1至约15、约1至约3或约1至约2的渗滤体积)。在一些实施方案中，过滤包括在不同区别温度下处理不同的渗滤体积。
在纯化和浓缩纳米粒悬浮液后，纳米粒可通过一个、两个或更多个除菌和/或深度过滤器(例如，使用～0.2μm深度预过滤器)。例如，除菌过滤步骤可涉及使用过滤组(filtrationtrain)以受控速率过滤治疗性纳米粒。在一些实施方案中，过滤组可包括深度过滤器和除菌过滤器。
在制备纳米粒的另一实施方案中，有机相由治疗剂和聚合物(例如，共聚物和任选地具有配体的共聚物)的混合物构成。将有机物与含水相以大约1:5比率(油相:含水相)混合，其中含水相由表面活性剂和一些溶解溶剂构成。通过在简单混合下或通过使用转子定子均化器组合两种相以形成初级乳液。然后通过使用高压均化器使初级乳液形成细乳液。然后通过在混合下添加至去离子水中将细乳液骤冷。在一些实施方案中，骤冷液:乳液的比率可以是约2:1至约40:1或在一些实施方案中约5:1至约15:1。在一些实施方案中，骤冷液:乳液的比率大约是8.5:1。然后将tween(例如tween80)的溶液加入至骤冷液中以获得总共大约2％的tween。这用于溶解游离、未封装的核酸。然后通过离心或超滤/渗滤分离纳米粒。
会理解，用于制备制剂的聚合物和治疗剂的量可不同于最终制剂。例如，一些治疗剂可不完全引入纳米粒中，例如，这样的游离治疗剂可以被过滤掉。例如，在实施方案中，可使用第一有机溶液(第一有机溶液中含有约11重量％理论负载的治疗剂)，第二有机溶液(含有约89重量％的聚合物(例如，聚合物可包括约2.5mol％的缀合至聚合物的靶向部分和约97.5mol％的pla-peg))来制备制剂，其得到，例如，包含约2重量％的治疗剂、约97.5重量％的聚合物(其中聚合物可包括约1.25mol％的缀合至聚合物的靶向部分和约98.75mol％的pla-peg)的最终纳米粒。这样的方法可提供适于给患者给药的最终纳米粒，其包括约1重量％至约20重量％的治疗剂，例如，约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约8重量％、约10重量％或约15重量％的治疗剂。
治疗剂
在本发明的某些方面，治疗性纳米粒包封、包围或连结或连接至抗pd-1抗体或者可作为pd-1的激动剂和/或拮抗剂的抗体，从而调节由pd-1调节的免疫应答。pd-1是50-55kda的i型跨膜受体，其最初是在经历激活诱导的细胞凋亡的t细胞系中鉴定。pd-1在t细胞、b细胞和巨噬细胞上表达。pd-1在激活的t细胞、b细胞和巨噬细胞上表达。实验数据表明pd-1与其配体在中央和外周免疫应答下调中的相互作用。特别地，在pd-l1的存在下，野生型t细胞而非pd-1缺陷型t细胞中的增殖受到抑制。
本公开中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖任何包括抗原结合位点的多肽，而不论其是在体外或是在体内产生。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变和移植抗体。术语抗体还包括抗体片段，如fab、f(ab)2、fv、scfv、fd、dab和保留抗原结合功能(即特异性结合pd-1的能力)的其他抗体片段。通常，这样的片段会包括抗原结合结构域。
通常，抗体可以例如使用传统的杂交瘤技术(kohler和milstein(1975)nature,256:495-499)、重组dna方法(美国专利号4,816,567)或由抗体文库进行的噬菌体展示(clackson等人(1991)nature,352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.,222:581-597)来制备。对于其他抗体生产技术，另请参见antibodies：alaboratorymanual，harlow等编辑，coldspringharborlaboratory，1988。
不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构象为本领域公知。也称为免疫球蛋白的完整抗体通常是由每条大约25kda的两条轻(l)链和每条大约50kda的两条重(h)链组成的糖基化蛋白四聚体。在抗体中发现两种类型的轻链，称为λ链和κ链。基于重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五种主要类型：a、d、e、g和m，其中几个可进一步分为亚型(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
包括抗pd-1抗体的治疗性纳米粒能够调节pd-1相关的免疫应答下调。所公开的治疗性纳米粒包括可作为pd-1的激动剂或拮抗剂的抗体，这取决于其使用方法。抗体可用于预防、诊断或治疗哺乳动物尤其是人的医学疾病。抗体也可用于分离pd-1或表达pd-1的细胞。此外，抗体可用于治疗有与异常pd-1表达或功能相关的疾病风险或易患与异常pd-1表达或功能相关的疾病，或患有与异常pd-1表达或功能相关的疾病的个体。
在癌症扩散(canceroutgrowth)和病毒感染的情况下，pd-1信号传导的激活促进免疫耐受，导致癌症或病毒感染的细胞逃脱免疫监视和癌细胞转移或病毒负载增加。通过治疗剂抑制pd-1介导的细胞信号传导可激活免疫细胞，包括t细胞、b细胞和nk细胞，从而增强免疫细胞功能、抑制癌细胞生长或病毒感染，并恢复免疫监视和免疫记忆功能，以治疗这样的人类疾病。
药物制剂
根据另一方面，本文所公开的纳米粒可与药学上可接受的载体组合形成药物组合物。本领域技术人员会理解，可基于下文所述的给药途径、靶组织位置、所递送的药物、递送药物的时间过程等来选择载体。
可通过本领域已知的任意方式(包括口服和肠胃外途径)将药物组合物给药于患者。本文所使用的术语“患者”指人类以及非人类，包括，例如，哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，非人类可以是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。在某些实施方案中，期望肠胃外途径，因为其避免与消化管中所发现的消化酶接触。根据这样的实施方案，发明的组合物可通过注射(例如，静脉、皮下或肌内、腹膜内注射)、经直肠、经阴道、局部(通过粉剂、乳霜、软膏或滴剂)或通过吸入(通过喷雾剂)给药。
在特定实施方案中，纳米粒全身性地向有此需要的个体给药，例如，通过iv输注或注射。
可根据已知现有技术使用合适分散或湿润剂以及悬浮剂来配制可注射制剂，例如，无菌可注射含水混悬剂或含油混悬剂。无菌可注射制剂也可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，为1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的载体和溶剂是水、ringer’s溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用包括合成甘油单酸酯或甘油二酸酯的任何温和的不挥发性油。此外，脂肪酸诸如油酸被用于制备注射剂。在一个实施方案中，将发明的缀合物悬浮于包含1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)tweentm80的载体液中。注射剂可例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂(其可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中)除菌。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，封装或未封装的缀合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体(例如，柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下混合：(a)填充剂或增量剂，诸如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)黏合剂，如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，诸如，甘油，(d)崩解剂，诸如，琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，诸如，石蜡，(f)吸收促进剂，诸如，季铵化合物，(g)润湿剂，如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，(h)吸收剂，诸如，高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，诸如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
会理解，个体医生根据被治疗的患者来选择含有治疗剂的纳米粒的确切剂量，一般而言，调节剂量和给药以提供有效量的治疗剂纳米粒至所治疗的患者。如本文所使用的，含有治疗剂的纳米粒的“有效量”指引发期望的生物学应答所必需的量。本领域普通技术人员会理解，含有治疗剂的纳米粒的有效量可根据这样的因素而变化：所期望的生物学终点、待递送药物、靶组织、给药途径等。例如，含有治疗剂的纳米粒的有效量可以是导致肿瘤大小经所期望的时间段减小期望量的量。可考虑的其他因素包括疾病状况的严重程度；所治疗患者的年龄、体重和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合；反应敏感性；以及对疗法的耐受性/反应。
可以以剂量单位形式配制纳米粒以便给药和剂量均一。本文所使用的表达“剂量单位形式”指适于被治疗的患者的纳米粒的物理上分离单位。然而，会理解，组合物的总日用量应由主治医师在合理医疗判断的范围内决定。对于任何纳米粒而言，可最初在细胞培养试验中或动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效剂量。也使用动物模型来实现期望给药的浓度范围和途径。然后可使用这样的信息来确定人类给药的有用剂量和途径。可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定纳米粒的治疗效力和毒性，例如，ed50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和ld50(对50％群体致死的剂量)。毒性与治疗效应的剂量比率是治疗指数，其可以表示为比率ld50/ed50。展现大的治疗指数的药物组合物可用于一些实施方案中。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类使用的剂量范围。
在实施方案中，本文所公开的组合物可包括少于约10ppm的钯或少于约8ppm或少于约6ppm的钯。例如，本文提供的是包括具有聚合物缀合物的纳米粒的组合物，其中组合物具有少于10ppm的钯。
在一些实施方案中，涵盖适于冷冻的组合物，其包括本文所公开的纳米粒和适于冷冻的溶液，例如，将糖(如，单糖、二糖或多糖，例如，蔗糖和/或海藻糖)，和/或盐和/或环糊精溶液添加至纳米粒悬浮液中。糖(例如，蔗糖或海藻糖)可作为，例如，冷冻保护剂来防止颗粒在冷冻时聚集。例如，本文提供的是纳米粒制剂，其包含多种所公开的纳米粒、蔗糖、离子卤化物和水；其中纳米粒/蔗糖/水/离子卤化物是约3-40％/10-40％/20-95％/0.1-10％(w/w/w/w)或约5-10％/10-15％/80-90％/1-10％(w/w/w/w)。例如，这样的溶液可包括本文所公开的纳米粒，约5重量％至约20重量％蔗糖和浓度为约10-100nm的离子卤化物(诸如，氯化钠)。在另一实中，本文提供的是纳米粒制剂，其包含多种所公开的纳米粒、海藻糖、环糊精和水；其中纳米粒/海藻糖/水/环糊精是约3-40％/1-25％/20-95％/1-25％(w/w/w/w)或约5-10％/1-25％/80-90％/10-15％(w/w/w/w)。
例如，所涵盖的溶液可包括本文所公开的纳米粒，约1重量％至约25重量％二糖(诸如，海藻糖或蔗糖(例如，约5重量％至约25重量％海藻糖或蔗糖，例如，约10重量％海藻糖或蔗糖或约15重量％海藻糖或蔗糖，例如，约5重量％蔗糖))和环糊精(诸如，β-环糊精，其浓度为约1重量％至约25重量％(例如，约5重量％至约20重量％，例如，10重量％或约20重量％或约15重量％至约20重量％)环糊精)。所涵盖的制剂可包括多种所公开的纳米粒(例如，具有pla-peg和活性剂的纳米粒)，和约2wt％至约15wt％(或约4wt％至约6wt％，例如，约5wt％)蔗糖及约5wt％至约20％(例如，约7wt％至约12wt％，例如，约10wt％)环糊精(例如，hpbcd)。
本公开部分地涉及冻干的药物组合物，其在复溶时具有最小量的大聚集物。这样的大聚集物的大小可大于约0.5μm、大于约1μm或大于约10μm，并且在复溶溶液中可以是不期望的。聚集物大小可使用多种技术来测量，包括美国药典在32<788>中所显示的那些，在此援引加入。usp32<788>中所概述的测试包括遮光颗粒计数测试、微观颗粒计数测试、激光衍射和单颗粒光学传感。在一个实施方案中，使用激光衍射和/或单颗粒光学传感来测量给定样品中的粒径。
usp32<788>通过遮光颗粒计数测试描述了用于取样悬浮液中的粒径的指南。对于小于或等于100ml的溶液，如果存在的颗粒的平均数量不超过6000个/容器(其≥10μm)以及600个/容器(其≥25μm)，则制剂与测试相符合。
如usp32<788>中所概述，微观颗粒计数测试描述用于使用调节至100±10倍放大倍数且具有目镜测微计的双目显微镜来测定颗粒量的指南。目镜测微计是圆直径计数线，其由分成象限的圆组成且具有在以100倍放大倍数观测时指示10μm和25μm的黑色参考圆。在计数线下方提供线性标度。目测计算参照10μm和25μm的颗粒数。对于小于或等于100ml的溶液，如果所存在颗粒的平均数量不超过3000个/容器(其≥10μm)以及300个/容器(其≥25μm)，则制剂与测试相符合。
在一些实施方案中，所公开的组合物的10ml含水样品在复溶后包含少于600个颗粒/ml(其大小大于或等于10微米)；和/或少于60个颗粒/ml(其大小大于或等于25微米)。
可使用动态光散射(dls)来测量粒径，但其依赖于布朗运动从而该技术可能检测不到一些较大的颗粒。激光衍射依赖于颗粒与悬浮介质之间的折射率差。该技术能够检测亚微米至毫米范围的颗粒。相对小(例如，约1-5重量％)量的较大颗粒可以在纳米粒悬浮液中测定。单颗粒光学传感(spos)使用稀悬浮液的遮光来计数约0.5μm的个体颗粒。通过知晓所测量样品的颗粒浓度，可计算聚集物的重量百分比或聚集物浓度(颗粒/ml)。
在冻干期间由于颗粒表面脱水可发生聚集物的形成。该脱水可通过在冻干之前在悬浮液中使用冻干保护剂(例如，二糖)来避免。合适的二糖包括蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖和/或其混合物。其他所涵盖的二糖包括曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芦丁酮糖和木二糖。当与起始悬浮液相比时，复溶显示等同的dls大小分布。然而，激光衍射可检测一些复溶溶液中>10μm大小的颗粒。另外，spos也可以检测>10μm大小颗粒(高于fda指南的浓度(对于>10μm颗粒，104-105个颗粒/ml))。
在一些实施方案中，可使用一种或多种离子卤化物盐作为除糖(如，蔗糖、海藻糖或其混合物)外的另外的冻干保护剂。糖可包括二糖、单糖、三糖和/或多糖，并且可包括其他赋形剂，例如，甘油和/或表面活性剂。任选地，可包括环糊精作为另外的冻干保护剂。可添加环糊精以代替离子卤化物盐。或者，除离子卤化物盐外可添加环糊精。
合适的离子卤化物盐可包括氯化钠、氯化钙、氯化锌或其混合物。其他合适的离子卤化物盐包括氯化钾、氯化镁、氯化铵、溴化钠、溴化钙、溴化锌、溴化钾、溴化镁、溴化铵、碘化钠、碘化钙、碘化锌、碘化钾、碘化镁或碘化铵和/或其混合物。在一个实施方案中，约1重量％至15重量％的蔗糖可与离子卤化物盐一起使用。在一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约10mm至约100mm的氯化钠。在另一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约100mm至约500mm的二价离子氯化物盐，诸如，氯化钙或氯化锌。在又一实施方案中，待冻干的悬浮液可进一步包含环糊精，例如，可使用约1重量％至约25重量％的环糊精。
合适的环糊精可包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其混合物。本文所公开的组合物中使用的所涵盖的示例性环糊精包括羟丙基-β-环糊精(hpbcd)、羟乙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基乙基-β-环糊精、二乙基-β-环糊精、三-o-烷基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精。在一些实施方案中，约1重量％至约25重量％的海藻糖(例如，约10％至约15％，例如，5重量％至约20重量％)可与环糊精一起使用。在一个实施方案中，冻干的药物组合物可包含约1重量％至约25重量％的β-环糊精。示例性组合物可包含含pla-peg、活性剂/治疗剂、约4％至约6％(例如，5wt％)蔗糖和约8重量％至约12重量％(例如，约10wt％)hpbcd的纳米粒。
一方面，提供冻干的药物组合物，其包含所公开的纳米粒，其中以约50mg/ml的纳米粒浓度在小于或约100ml的含水介质中复溶冻干的药物组合物时，适用于肠胃外给药的复溶的组合物包含少于6000个(诸如少于3000个)大于或等于10微米的微粒；和/或少于600个(诸如，少于300个)大于或等于25微米的微粒。
微粒数可通过诸如usp32<788>中的通过遮光颗粒计数测试、usp32<788>中的通过微观颗粒计数测试、激光衍射和单颗粒光学传感的方式测定。
一方面，提供在复溶后适用于肠胃外使用的药物组合物，其包含多种治疗性颗粒，各治疗性颗粒包含具有疏水性聚合物部分(segment)和亲水性聚合物部分的共聚物；活性剂；糖；和环糊精。
例如，共聚物可以是聚(乳)酸-嵌段-聚(乙)二醇共聚物。在复溶后，100ml含水样品可包含少于6000个具有大小大于或等于10微米的颗粒；和少于600个具有大小大于或等于25微米的颗粒。
添加二糖和离子卤化物盐的步骤可包括添加约5重量％至约15重量％蔗糖或约5重量％至约20重量％海藻糖(例如，约10重量％至约20重量％海藻糖)，和约10至约500mm离子卤化物盐。离子卤化物盐可选自氯化钠、氯化钙和氯化锌或其混合物。在一个实施方案中，还添加约1重量％至约25重量％的环糊精。
在另一实施方案中，添加二糖和环糊精的步骤可包括添加约5重量％至约15重量％的蔗糖或约5重量％至约20重量％的海藻糖(例如，约10重量％至约20重量％海藻糖)，和约1重量％至约25重量％的环糊精。在实施方案中，添加约10重量％至约15重量％的环糊精。环糊精可选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其混合物。
另一方面，提供防止药物纳米粒组合物中颗粒大量聚集的方法，其包括向冻干的制剂中添加糖和盐以防止纳米粒在复溶时的聚集。在实施方案中，还添加环糊精至冻干制剂中。又一方面，提供防止药物纳米粒组合物中颗粒大量聚集的方法，其包括向冻干的制剂中添加糖和环糊精以防止纳米粒在复溶时的聚集。
所涵盖的冻干的组合物可具有大于约40mg/ml的治疗性颗粒浓度。适合于肠胃外给药的制剂可在10ml剂量中具有少于约600个具有大小大于10微米的颗粒。冻干可包括在大于-40℃或例如小于约-30℃的温度下冷冻组合物，形成冷冻组合物；和干燥冷冻组合物以形成冻干的组合物。干燥步骤可在约50毫托下在约-25℃至约-34℃或约-30℃至约-34℃的温度下发生。
治疗方法
在一些实施方案中，靶向的纳米粒可用于治疗、缓解、改善、减轻疾病、紊乱和/或病况的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。在一些实施方案中，靶向的纳米粒可用于治疗实体瘤，例如，癌症和/或癌细胞。在一些实施方案中，靶向egfr表达的细胞。在一些实施方案中，靶向表达egfr的其他癌细胞的实体瘤。在某些实施方案中，靶向的纳米粒可用于在有此需要的受试者中治疗任何的癌症，其中psma表达在癌细胞表面或在肿瘤新生血管(包括前列腺或非前列腺实体瘤的新生血管)中。psma相关适应症的实例包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和胶质母细胞瘤。
术语“癌症”包括恶化前和恶性癌症。癌症包括但不限于，血癌(例如，慢性髓性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤)、前列腺癌、胃癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤或基底细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、乳腺癌、头颈癌、支气管癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食管癌、口腔癌或咽癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肾癌(例如，肾细胞癌)、睪丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、胃肠道间质瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。“癌细胞”可以是肿瘤的形式(即实体瘤)，单独存在于个体内(例如，白血病细胞)，或是源自癌症的细胞系。
在本发明的一些实施方案中，含有抗pd-1抗体的治疗性纳米粒用于治疗鳞状非小细胞肺癌。在某些实施方案中，本发明的靶向的颗粒的“治疗有效量”是对鳞状非小细胞肺癌的一种或多种症状或特征有效治疗、缓解、改善、减轻、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重性和/或降低其发生率的量。
癌症可与多种身体症状有关。癌症症状通常取决于肿瘤的类型和位置。例如，肺癌可引起咳嗽、呼吸短促和胸痛，而结肠癌通常引起腹泻、便秘和便血。然而，仅举几个实例，以下症状通常与许多癌症有关：发烧、寒冷、盗汗、咳嗽、呼吸困难、重量减轻、食欲不振、厌食、恶心、呕吐、腹泻、贫血、黄疸、肝大、咯血、疲劳、全身乏力、认知功能障碍、抑郁、内分泌失调、中性粒细胞减少、疼痛、不愈合的疮、淋巴结肿大、周围神经病变和性功能障碍。
在一方面，提供治疗癌症(例如，白血病)的方法。应该理解，治疗诸如感染、炎症、遗传疾病等方法可以如本文所公开的完成。在一些实施方案中，癌症的治疗包括以实现期望的结果所必需的量和时间，向有此需要的个体给药治疗有效量的发明的靶向的颗粒。在某些实施方案中，发明的靶向的颗粒的“治疗有效量”是有效治疗、缓解、改善、减轻癌症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率的量。
在一方面，提供向患有癌症(例如，白血病)的个体给药发明的组合物的方法。在一些实施方案中，可以实现期望的结果(即，治疗癌症)所必需的量和时间向个体给药颗粒。在某些实施方案中，发明的靶向的颗粒的“治疗有效量”是有效治疗、缓解、改善、减轻癌症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率的量。
发明的治疗方案涉及向健康个体(即，不展现任何癌症症状和/或未被诊断患有癌症的个体)给药治疗有效量的发明的靶向的颗粒。例如，可以在癌症发生和/或癌症症状发作之前用发明的靶向的颗粒对健康个体进行“免疫”；处于风险的个体(例如，具有家族癌症史的患者；携带与癌症发生有关的一种或多种基因突变的患者；具有与癌症发生有关的遗传多态性的患者；被与癌症发生有关的病毒感染的患者；具有与癌症发生有关的习惯和/或生活方式的患者等)可以基本上与癌症症状发作同时(例如，48小时内、24小时内或12小时内)治疗。当然，已知患有癌症的个体可在任何时间接受发明的治疗。
在其他实施方案中，所公开的纳米粒可用于抑制癌细胞(例如，髓性白血病癌细胞)的生长。如本文所使用的，术语“抑制癌细胞的生长”或“癌细胞生长的抑制”指癌细胞增殖和/或迁移的速率的任何减缓、癌细胞增殖和/或迁移的阻止或杀死癌细胞，从而使得与所观测或预测的未治疗的对照癌细胞的生长速率相比，癌细胞生长的速率降低。术语“抑制生长”也可指癌细胞或肿瘤的大小减小或消失，以及指其转移可能性的降低。优选地，在细胞水平的这样的抑制可在患者中减小癌症的大小、阻止癌症生长、降低癌症侵袭性或预防或抑制癌症转移。本领域技术人员可以通过多种合适指标中的任何指标容易地确定癌细胞生长是否被抑制。
例如，癌细胞生长的抑制可例如通过以下得到证实：癌细胞停滞在细胞周期的特定阶段，例如，停滞在细胞周期的g2/m阶段。癌细胞生长的抑制也可通过直接或间接测量癌细胞或肿瘤大小来证实。在人类癌症患者中，这样的测量通常使用公知的成像方法来进行，诸如磁共振成像、计算机化的轴向层析成像和x射线。癌细胞生长也可间接的测定，诸如通过测定循环癌胚抗原、前列腺特异性抗原或与癌细胞生长相关的其他癌症特异性抗原的水平。癌症生长的抑制通常也与个体的存活期延长和/或健康和康乐增加相关。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒并排给药，或与另一种治疗剂(如抗pd-1抗体)共同给药。
本文还提供向患者给药本文所公开的纳米粒(包括活性剂)的方法，其中，在向患者给药时，与给药单独的剂(即不是作为所公开的纳米粒)相比，这样的纳米粒大大降低分布体积和/或大大降低游离cmax。
美国专利号8,206,747，于2012年6月26日授权，标题为“drugloadedpolymericnanoparticlesandmethodsofmakingandusingsame”在此整体援引加入。
实施例
本发明现已被一般性地描述，通过参考下列实施例会更容易理解，其仅用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，不意在以任何方式限制本发明。
实施例1：低分子量psma配体(gl2)的合成
将5g(10.67mmol)起始化合物溶于150ml无水dmf中。向该溶液中加入烯丙基溴(6.3ml,72mmol)和k2co3(1.47g,10.67mmol)。搅拌反应2小时，除去溶剂，将粗物质溶于acoet中并用h2o洗涤至ph为中性。用mgso4(无水)干燥有机相并蒸发，得到5.15g(95％)物质。(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.9，起始化合物rf＝0.1，用茚三酮和紫外光显色)。
向化合物(5.15g,10.13mmol)于ch3cn(50ml)中的溶液中加入et2nh(20ml,0.19mol)。在室温下搅拌反应40分钟。除去溶剂，通过柱色谱(己烷:acoet3:2)纯化化合物，得到2.6g(90％)。(ch2cl2:meoh10:1中的tlcrf＝0.4，茚三酮显色(该化合物显紫色))。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ5.95-5.85(m,1h,-ch2chch2),5.36-5.24(m,2h,-ch2chch2),4.62-4.60(m,3h,-ch2chch2,nhboc),3.46(t,1h,ch(lys)),3.11-3.07(m,2h,ch2nhboc),1.79(bs,2h,nh2),1.79-1.43(m,6h,3ch2(lys)),1.43(s,9h,boc)。
在-78℃下向搅拌的二烯丙基谷氨酸酯(3.96g,15mmol)和三光气(1.47g,4.95mmol)于ch2cl2(143ml)中的溶液中加入于ch2cl2(28ml)中的et3n(6.4ml,46mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌1.5h。然后在-78℃下加入赖氨酸衍生物(2.6g，9.09mmol)于ch2cl2(36ml)中的溶液，并在室温下搅拌反应12h。将溶液用ch2cl2稀释，用h2o洗涤两次，经mgso4(无水)干燥，并通过柱色谱(己烷:acoet3:1→2:1→acoet)纯化，得到4g(82％)(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.3，用茚三酮显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ5.97-5.84(m,3h,3-ch2chch2),5.50(bt,2h,2nhurea),5.36-5.20(m,6h,3-ch2chch2),4.81(bs,1h,nhboc),4.68-4.40(m,8h,3-ch2chch2,ch(lys),ch(glu)),3.09-3.05(m,2h,ch2nhboc),2.52-2.39(m,2h,ch2(glu.)),2.25-2.14和2.02-1.92(2m,2h,ch2(glu.)),1.87-1.64(m,4h,2ch2(lys)),1.51-1.35(m,2h,ch2(lys)),1.44(s,9h,boc)。
在0℃下，向化合物(4g,7.42mmol)于干燥ch2cl2(40ml)中的溶液中加入tfa(9ml)。在室温下搅拌反应1小时。真空除去溶剂直至完全干燥，得到4.1g(定量)。(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.1，用茚三酮显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ6.27-6.16(2d,2h,2nhurea),5.96-5.82(m,3h,3-ch2chch2),5.35-5.20(m,6h,3-ch2chch2),4.61-4.55(m,6h,3-ch2chch2),4.46-4.41(m,2h,ch(lys),ch(glu)),2.99(m,2h,ch2nhboc),2.46(m,2h,ch2(glu.)),2.23-2.11和2.01-1.882h,ch2(glu.)),1.88-1.67(m,4h,2ch2(lys)),1.45(m,2h,ch2(lys))。
在氩气下在0℃下向化合物(2g,3.6mmol)于dmf(无水)(62ml)中的溶液中加入pd(pph3)4(0.7g,0.6mmol)和吗啉(5.4ml,60.7mmol)。在室温下搅拌反应1小时。除去溶剂。将粗产物用ch2cl2洗涤两次，然后溶解在h2o中。向该溶液中加入稀释的naoh溶液(0.01n)直至ph为强碱性。减压除去溶剂。将固体再次用ch2cl2、acoet以及meoh-ch2cl2(1:1)混合物洗涤，溶解在h2o中并用amberliteir-120h+树脂中和。蒸发溶剂，并将化合物用meoh沉淀，得到1g(87％)的gl2。1h-nmr(d2o,300mhz)δ4.07(m,2h,ch(lys),ch(glu)),2.98(m,2h,ch2nh2),2.36(m,2h,ch2(glu.)),2.08-2.00(m,1h,ch2(glu)),1.93-1.60(m,5h,ch2(glu.),2ch2(lys)),1.41(m,2h,ch2(lys))。质谱esi:320.47[m+h+],342.42[m+na+]。
实施例2：低分子量psma配体(gl1)的合成
将130mg(0.258mmol)起始化合物溶于3mldmf(无水)中。向该溶液中加入烯丙基溴(150μl,1.72mmol)和k2co3(41mg,0.3mmol)。搅拌反应1小时，除去溶剂，将粗产物溶于acoet中并用h2o洗涤至ph为中性。将有机相用mgso4(无水)干燥并蒸发，得到130mg(93％)。(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.9，起始化合物rf＝0.1，用茚三酮和紫外光显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ7.81-7.05(12h,芳烃),6.81(bs,1h,nhfmoc),5.93-5.81(m,1h,-ch2chch2),5.35-5.24(m,2h,-ch2chch2),5.00(bd,1h,nhboc),4.61-4.53(m,5h,-ch2chch2,ch2(fmoc)ch(pheala.)),4.28(t,1h,ch(fmoc)),3.12-2.98(m,2h,ch2(pheala.),1.44(s,9h,boc)。
在0℃下，向化合物(120mg,0.221mmol)于干燥ch2cl2(2ml)中的溶液加入tfa(1ml)。在室温下搅拌反应1小时。真空除去溶剂，加入水并再次除去水，加入ch2cl2并再次除去ch2cl2直至完全干燥，得到120mg(定量)。(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.1，用茚三酮和紫外光显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ7.80-7.00(13h,芳烃,nhfmoc),5.90-5.75(m,1h,-ch2chch2),5.35-5.19(m,3h,-ch2chch2,nhboc),4.70-4.40(2m,5h,-ch2chch2,ch2(fmoc),ch(pheala.)),4.20(t,1h,ch(fmoc)),3.40-3.05(m,2h,ch2(pheala.))。
在-78℃下，向搅拌的二烯丙基谷氨酸酯(110mg,0.42mmol)和三光气(43mg,0.14mmol)于ch2cl2(4ml)中的溶液中加入于ch2cl2(0.8ml)中的et3n(180μl,1.3mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌1.5h。然后在-78℃下加入苯基丙氨酸衍生物(140mg,0.251mmol)于ch2cl2(1ml)和et3n(70μl,0.5mmol)中的溶液，并在室温下搅拌反应12小时。将溶液用ch2cl2稀释，用h2o洗涤两次，经mgso4(无水)干燥，并通过柱色谱(己烷:acoet3:1)纯化，得到100mg(57％)(ch2cl2:meoh20:1中的tlcrf＝0.3，用茚三酮和紫外光显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ7.80-6.95(13h,芳烃,nhfmoc),5.98-5.82(m,3h,3-ch2chch2),5.54(bd,1h,nhurea),5.43-5.19(m,7h,3-ch2chch2,nhurea),4.85-4.78(m,1h,ch(pheala.)),4.67-4.50(m,9h,3-ch2chch2,ch2(fmoc),ch(glu.)),4.28(t,1h,ch(fmoc)),3.05(d,2h,ch2(pheala.)),2.53-2.33(m,2h,ch2(glu.)),2.25-2.11和1.98-1.80(2m,2h,ch2(glu.))。
向起始原料(60mg,0.086mmol)于ch3cn(1ml)中的溶液中加入et2nh(1ml,10mmol)。在室温下搅拌反应40分钟。除去溶剂，通过柱色谱(己烷:acoet2:1)纯化化合物，得到35mg(85％)。(ch2cl2:meoh10:1中的tlcrf＝0.5，起始化合物rf＝0.75，用茚三酮(该化合物具有紫色)和紫外光显色)。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ6.85和6.55(2d,4h,芳烃),5.98-5.82(m,3h,3-ch2chch2),5.56(bd,1h,nhurea),5.44-5.18(m,7h,3-ch2chch2,nhurea),4.79-4.72(m,1h,ch(pheala.)),4.65-4.49(m,7h,3-ch2chch2,ch(glu.)),3.64(bs,2h,nh2),3.02-2.89(m,2h,ch2(pheala.)),2.49-2.31(m,2h,ch2(glu.)),2.20-2.09和1.91-1.78(2m,2h,ch2(glu.))。
在氩气下在0℃下向化合物(50mg,0.105mmol)于dmf(无水；1.5ml)中的溶液中加入pd(pph3)4(21mg,0.018mmol)和吗啉(154μl,1.77mmol)。在室温下搅拌反应1h。除去溶剂。将粗物质用ch2cl2洗涤两次，并溶解在h2o中。向该溶液中加入稀释的naoh溶液(0.01n)直至ph为强碱性。减压除去溶剂。将固体再次用ch2cl2、acoet以及meoh-ch2cl2(1:1)混合物洗涤，溶解在h2o中并用amberliteir-120h+树脂中和。蒸发溶剂，并将化合物用meoh沉淀，得到25mg(67％)的gl1。1h-nmr(d2o,300mhz)δ7.08和6.79(2d,4h,芳烃),4.21(m,1h,ch(pheala.)),3.90(m,1h,ch(glu.)),2.99和2.82(2dd,2h,ch2(pheala.)),2.22-2.11(m,2h,ch2(glu.)),2.05-1.70(2m,2h,ch2(glu.)).13c-nmr(d2o,75mhz)δ176.8,174.5,173.9(3coo).153.3(nhconh),138.8(h2n-c(ph)),124.5,122.9,110.9(芳烃),51.3(ch(pheala.)),49.8(ch(glu.)),31.8(ch2(pheala.)),28.4和23.6(2ch2-glu.))。质谱esi:354.19[m+h+],376.23[m+na+]。
实施例3：pla-peg的制备
合成通过d,l-丙交酯与作为高分子-引发剂的α-羟基-ω-甲氧基聚(乙二醇)的开环聚合来完成，并且在升高的温度使用作为催化剂的2-乙基己酸锡(ii)来进行，如下所示(pegmn≈5,000da；plamn≈16,000da；peg-plamn≈21,000da)
聚合物通过将其溶解于二氯甲烷中，并在己烷和乙醚的混合物中沉淀来纯化。从该步骤中回收的聚合物会在干燥箱中干燥。
实施例4：pla-peg-配体制备
合成开始于通过使fmoc、boc赖氨酸与烯丙基溴和碳酸钾在二甲基甲酰胺中反应，fmoc、boc赖氨酸转化为fmoc、boc、烯丙基赖氨酸，然后用于乙腈中的二乙胺处理。然后使boc、烯丙基赖氨酸与三光气和二烯丙基谷氨酸酯反应，随后用于二氯甲烷中的三氟乙酸处理以形成化合物“gl2p”。
然后通过加入羟基-peg-羧酸与edc和nhs，将gl2p中赖氨酸的侧链胺聚乙二醇化。gl2p与peg通过酰胺键缀合。所得化合物的结构标记为“ho-peg-gl2p”。在聚乙二醇化之后，d,l-丙交酯与作为引发剂的ho-peg-gl2p中的羟基的开环聚合(rop)用于通过酯键将聚丙交酯嵌段聚合物连接到ho-peg-gl2p上，得到“pla-peg-gl2p”。2-乙基己酸锡(ii)用作开环聚合的催化剂。
最后，使用于二氯甲烷中的吗啉和四(三苯基膦)钯(作为催化剂)除去pla-peg-gl2p上的烯丙基，得到最终产物pla-peg-配体。通过在30/70％(v/v)乙醚/己烷中沉淀来纯化最终化合物。
实施例5：纳米粒制备-纳米沉淀法
可以使用gl1、gl2或任何期望的配体制备纳米粒。脲基psma抑制剂gl2(其游离氨基位于对psma结合不重要的区域)根据路线1中所示的操作由市售原料boc-phe(4nhfmoc)-oh和二烯丙基谷氨酸合成。使用纳米沉淀法形成纳米粒：将聚合物配体缀合物与其他药剂一起溶解在水混溶的有机溶剂中，来跟踪颗粒摄取。可以包括附加的非官能化聚合物以调节配体表面密度。将聚合物溶液分散在含水相中，过滤收集所得颗粒。可以干燥颗粒或立即测试体外细胞的摄取或体内抗前列腺肿瘤的活性。
路线1
实施例6：纳米粒制备-乳化法
形成由5％固体(wt％)组成的有机相，包括2％聚(丙交酯-共-乙交酯)-聚(乙二醇)二嵌段共聚物(plga-peg；45kda-5kda)的、2％聚(d,l-丙交酯)(pla；8.5kda)和1％多西他赛(dtxl)，其中多西他赛具有以下结构：
有机溶剂是乙酸乙酯(ea)和苯甲醇(ba)，其中ba包括20％(wt％)的有机相。ba部分用于溶解多西他赛。将有机相与含水相以约1:5的比例混合(油相:含水相)，其中水相由0.5％胆酸钠、2％ba和4％ea(wt％)的水溶液组成。通过经简单混合或通过使用转子定子均化器将两种相组合形成初级乳液。然后通过使用探针超声处理器或高压均化器使初级乳液形成细乳液。
然后在混合下通过加入至去离子水的冷骤冷液(0-5℃)使细乳液骤冷。骤冷液:乳液的比率大约是8.5:1。然后将25％(wt％)的吐温80的溶液加入至骤冷液以实现大约2％的总体吐温80。然后通过离心或超滤/渗滤分离纳米粒。然后可以用冷冻保护剂(诸如10wt％蔗糖)冷冻纳米粒悬浮液。
实施例7：psma靶向的多西他赛纳米粒制备-乳化方法
通过乳化方法制备前列腺特异性膜抗原(psma)靶向的多西他赛纳米粒，用于有关下文实施例8中所述的研究。在第一步中，在有机溶剂(5.53kg乙酸乙酯和1.47kg苯甲醇)存在下，通过将实施例3的2.34kg(23.4％)pla-peg(16kda-5kda)与实施例4的0.06kg(0.6％)pla-peg-gl2(16kda-5kda)和6％多西他赛相混合，形成包含30％固体(wt％)的有机相。苯甲醇部分用于溶解多西他赛。
在下一步中，将有机相与含水相以约1:2的重量比(有机相:含水相)混合。通过将0.2kg胆酸钠、0.4kg苯甲醇和0.8kg乙酸乙酯(wt％)在水(18.6kg)中混合形成含水相。
通过使用顶置分批高剪切混合器将两相组合形成初级乳液。通过使用高压均化器将初级乳液形成细乳液。
然后通过在混合下加入冷却(0-5℃)的去离子水使细乳液骤冷。骤冷液:乳液的比率为约10:1。然后将35％吐温80(15kg)水溶液(wt％)加入骤冷液中以溶解任何未包封的多西他赛。
分离所得纳米粒并通过超滤/渗滤浓缩。将蔗糖和羟丙基-β-环糊精加入到纳米粒悬浮液中以用作冷冻保护剂/冻干保护剂，所加量得到含有5wt％蔗糖和7.5％羟丙基-β-环糊精的最终悬浮液。使纳米粒悬浮液通过终止于0.2微米灭菌级过滤器的过滤组。将纳米粒悬浮液填充到玻璃小瓶中，冻干、塞住并通过加盖密封。
实施例8：多西他赛纳米粒的体内研究
进行小鼠体内同源异种移植研究以评估检查点抑制剂、抗pd-1和实施例7的psma靶向的多西他赛聚合物纳米粒的组合活性。在带有皮下小鼠结肠ct-26肿瘤的6至8周龄雌性balb/c小鼠中进行研究。
当肿瘤大小达到约100mm3时，小鼠用以下治疗：
i)同种型对照(2a3克隆，10mg/kgi.p.)；
ii)小鼠抗pd-1(rmp1-14克隆，10mg/kgi.p.)；
iii)多西他赛纳米粒(实施例710mg/kgi.v.)；
iv)多西他赛(泰索帝，2.5mg/kgi.v.)；
v)多西他赛纳米粒(实施例7)与抗pd-1组合，按每4天时间表(q4d)同时给药，共5剂；或者
vi)多西他赛与抗pd-1按每4天时间表(q4d)同时给药，共5剂。
将数据绘制为平均值和sem，每个治疗组10只小鼠。数据显示，当多西他赛(泰索帝)以良好耐受的剂量与抗pd-1组合进行试验时，没有组合活性(图9)。然而，所进行的研究表明，将抗pd-1与多西他赛纳米粒组合增强ct26小鼠异种移植模型中的抗肿瘤反应，与单剂治疗的47-66％肿瘤生长抑制相比，导致第22天肿瘤生长抑制(tgi)为88％以及2只完全消退(图3)。
等同
本领域技术人员仅使用常规实验即会识别或能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同。这些等同意在被以下权利要求涵盖。
援引加入
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序列表
<110>辉瑞公司
s·e·扎莱
<120>包含治疗剂的治疗性纳米粒及其制备和使用方法
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