肿瘤靶向合成腺病毒及其用途的制作方法

文档序号：18269738发布日期：2019-07-27 09:32阅读：217来源：国知局

本申请要求2016年12月12日提交的美国临时申请号62/433,140的优先权，该申请通过引用全文结合入本文。

本公开涉及运送至肿瘤部位的具有嵌合纤维蛋白和肝脏去靶向突变的合成腺病毒。本公开还涉及合成腺病毒在肿瘤中表达诊断性或治疗性转基因的用途。

背景技术：

腺病毒(ad)是天然的多基因表达载体。该病毒的某些编码区例如e1、e3和e4区对于培养中的复制而言并非是必要的，或者可以通过可用的细胞系补充。因此，这些区的每一个可以被非病毒基因替代，以驱动多个转基因自单一病毒的表达。有68种不同的人腺病毒血清型，其每一种均具有不同的特性。ad5是基础研究、基因疗法和溶瘤病毒疗法中使用的主要ad载体。但是，ad5的趋向性(tropism)有限，仅感染具有用于病毒摄入的柯萨奇腺病毒受体(car)的上皮细胞。而且，当静脉注射时，ad5与血液因子结合，导致其在肝脏中被隔离，在肝脏中它可能潜在地触发限制性炎症和毒性。因此，仍需要有在静脉施用之后能够感染特定细胞类型的修饰的腺病毒载体。

技术实现要素：

本文说明如下发现：表达具有腺病毒34型(ad34)隆突结构域(knobdomain)的纤维蛋白的肝脏去靶向合成腺病毒能够归巢至肿瘤部位。所述合成腺病毒可用于在肿瘤细胞(包括肿瘤基质细胞)中递送和表达诊断性或治疗性转基因。

本文提供在受试者肿瘤细胞中表达转基因的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：转基因、使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳和ad34纤维蛋白或包括腺病毒5型(ad5)轴结构域(shaftdomain)和ad34纽结构域的嵌合纤维蛋白。例如，所述转基因可以是诊断性转基因或治疗性转基因。

本文还提供诊断受试者患有肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：诊断性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。在一些例子中，所述诊断性转基因是正电子发射断层成像术(pet)报道基因。在其它例子中，所述诊断性转基因编码荧光蛋白或酶。

本文还提供治疗受试者中肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：治疗性转基因、使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。在一些例子中，所述治疗性转基因编码抗癌药剂或者破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。

本公开还提供与seqidno:2或seqidno:5具有至少95％序列同一性的合成腺病毒基因组。

以下详述参考附图进行，本公开内容的前述和其他目的和特征从以下详述将会更加地显而易见。

附图说明

图1a-1b.adsyn-co176归巢至胰腺肿瘤。(图1a)cre-loxpkras^g12d/p53胰腺肿瘤模型概述。命名为“kras；p53/p53”的小鼠编码kras^g12d致癌基因，该致癌基因位于编码loxp-终止密码子-loxp的序列的下游。该终止密码子在不存在cre重组酶的情况下阻断kras^g12d的表达。但是，在cre重组酶的存在下，终止密码子被移除并允许kras^g12d致癌基因的表达。在这些相同的小鼠中，p53基因的两个等位基因的侧翼为loxp位点(loxp-p53-loxp)。命名为“p53/p53；cre”的小鼠具有侧翼为loxp位点的p53基因的两个等位基因(loxp-p53-loxp)，并且还在胰十二指肠同源盒1(pdx1)启动子的驱动下表达cre重组酶转基因。pdx1是在胰腺细胞中被特异性表达的基因，因此胰腺细胞中缺失两个拷贝的p53。株系之间的繁殖产生这样的后代，其中pdx1启动子驱动的cre在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的两个等位基因的缺失和突变体kras^g12d的激活。命名为“kras；p53/p53；cre”的纯合子小鼠在5-7周内发展为胰腺肿瘤。(图1b)将具有包括ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白的合成腺病毒adsyn-co176静脉注射至kras；p53/p53和kras；p53/p53；cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描5分钟。kras；p53/p53小鼠具有正常的胰腺，且荧光素酶信号主要来自于脾。kras；p53/p53；cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自胰腺肿瘤。

图2a-2b.在cre-介导的基因操纵杂合模型中adsyn-co176在尾静脉注射之后感染胰腺肿瘤。(图2a)kras；p53/p53小鼠如图1a所示。命名为“p53/+；cre”的小鼠具有一个野生型p53等位基因和侧翼为loxp位点的p53等位基因(loxp-p53-loxp)。这两个株系之间的繁殖产生这样的后代，其中pdx1启动子驱动的cre重组酶在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的单个等位基因的缺失和突变体kras^g12d的激活。命名为“kras；p53/+；cre,”的这些杂合小鼠由于具有p53的一个野生型等位基因而在之后发展为肿瘤(4-9月龄时)。为使胰腺肿瘤发生，该野生型等位基因必须丧失或被突变。(图2b)将adsyn-co176静脉注射至p53/+；cre和kras；p53/+；cre小鼠(4个月大)中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描5分钟。p53/+；cre小鼠具有正常的胰腺，且信号主要来自于脾。4月龄的kras；p53/+；cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自肿瘤和肝脏。

图3a-3c.adsyn-co176在尾静脉注射之后可以感染和诊断早期胰腺肿瘤。杂合kras；p53/+；cre小鼠在4-9个月内发展为胰腺肿瘤。为了检验adsyn-co176是否可以感染肿瘤发展极早期(肿瘤可见之前)的胰腺肿瘤，将adsyn-176注射至2月龄的kras；p53/+；cre小鼠中，测量荧光素酶的表达。(图3a)将adsyn-co176静脉注射至2月龄的kras；p53/+；cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，并使用ivis^tm成像系统扫描5分钟。2月龄的kras；p53/+；cre小鼠的胰腺看起来是正常的，但是在该组织中发现了荧光素酶信号。(图3b)显示正常胰腺(a)和胰腺肿瘤(b)的典型组织学h&e染色。(图3c)来自2月龄的kras；p53/+；cre小鼠的胰腺的h&e染色，其表明小部分胰腺正在发展为肿瘤(如多边形中所示)。大多数胰腺看起来是正常的。该结果表明，adsyn-co176可以感染极早期胰腺肿瘤。

图4a-4b.adsyn-co176在胰腺肿瘤中感染基质细胞。在胰腺肿瘤中，仅有10％的细胞是癌细胞；其余90％是基质细胞。如通过免疫组织化学(ihc)和免疫荧光(if)染色确定，被adsyn-co176感染的细胞是基质细胞。(图4a)用adsyn-co176感染的胰腺肿瘤的ihc染色。ck19是肿瘤细胞标记物，而平滑肌肌动蛋白(sma)是基质细胞标记物。自adsyn-co176表达的gfp的染色，与sma染色重叠，表明adsyn-co176靶向基质细胞。(图4b)被adsyn-co176感染的胰腺肿瘤的if染色。gfp染色与sma染色重叠，证实了基质细胞的adsyn-co176感染。

图5a-5d.adsyn-co176在尾静脉注射之后感染成胶质细胞瘤。将合成腺病毒adsyn-co176通过尾静脉注射到具有成胶质细胞瘤的小鼠中，在成胶质细胞瘤中发现荧光素酶信号。(图5a)cre介导的基因操纵成胶质细胞瘤模型的示意图。将慢病毒直接注射到gfap-cre小鼠的大脑中。胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子驱动的cre重组酶将rfp自编码慢病毒的基因中切除，并诱导主要在星形细胞中的hras^v12和gfp的表达。编码慢病毒的u6-p53shrna的表达敲低了摄入病毒的脑细胞中的p53表达。从注射之后1周起，hras^v12的表达和p53的敲低诱导大脑中的肿瘤发生。gfp信号用来指示成胶质细胞瘤的形成。(图5b)将盐水、adsyn-co171或adsyn-co176经由静脉内(iv)施用注射到在4周前接受过肿瘤诱导慢病毒的gfap-cre小鼠中。注射病毒之后48小时，腹腔内注射荧光素之后，将小鼠用ivis^tm成像系统扫描1分钟。在adsyn-co176-感染的小鼠中检测到荧光素酶信号(箭头)，而在盐水处理或adsyn-co171-注射的小鼠中没有检测到信号。(图5c)给野生型小鼠(正常大脑)和注射有慢病毒的gfap-cre小鼠(发展为脑肿瘤)注射adsyn-co171或adsyn-co176。注射合成腺病毒之后72小时收集脑组织，与荧光素一起孵育5分钟，并用ivis^tm成像系统扫描5分钟。仅有注射有肿瘤诱导慢病毒的gfap-cre小鼠显示出来自adsyn-co176的荧光素酶信号。这说明adsyn-co176将仅在存在肿瘤时运送至脑组织。(图5d)还对脑组织进行gfp信号的扫描。gfp信号用于识别成胶质细胞瘤。接受过肿瘤诱导慢病毒的两种gfap-cre小鼠均在大脑中具有gfp信号，而没有接受过慢病毒的小鼠中没有检测到gfp。在接受过肿瘤诱导慢病毒和adsyn-co176的gfap-cre小鼠中，gfp信号与荧光素酶信号完美地重合。

图6a-6b.adsyn-co176运送至成胶质细胞瘤受肿瘤而非损伤驱动。注射肿瘤诱导慢病毒在注射部位处引起暂时的脑损伤。尽管合成腺病毒(adsyn-co171和adsyn-co176)在最初注射慢病毒之后4周注射，但仍不明确adsyn-co176运送至成胶质细胞瘤是通过肿瘤还是通过注射部位损伤来驱动。为了回答该问题，在无注射、假注射或注射肿瘤诱导慢病毒之后4周，给gfap-cre小鼠注射合成腺病毒。(图6a)给gfap-cre小鼠注射汉克斯平衡盐溶液(hanks’balancedsaltsolution,hbss)或肿瘤诱导腺病毒。4周之后，静脉内注射adsyn-co171。在任一组小鼠的脑中均没有来自adsyn-co171的荧光素酶信号。(图6b)给gfap-cre小鼠注射hbss或肿瘤诱导慢病毒，或者不接受注射。4周之后，给小鼠静脉内注射adsyn-co176。仅在接受了肿瘤诱导慢病毒的小鼠的大脑中检测到荧光素酶信号，而接受hbss或无注射的小鼠则不产生信号。这些结果说明，adsyn-co176的特异性是通过肿瘤驱动，而不是通过注射部位的损伤驱动。

图7a-7b.adsyn-co176可以运送至人成胶质细胞瘤异种移植肿瘤。(图7a)人成胶质细胞瘤异种移植物模型的示意图。将表达tdtomato荧光蛋白(u87-tdtomato)的人成胶质细胞瘤u87细胞颅内注射到nodscidgamma(nsg)小鼠中，以产生成胶质细胞瘤肿瘤。(图7b)接受u87-tdtomato颅内注射之后4周，将adsyn-co171和adsyn-co176通过尾静脉注射静脉内注射到nsg小鼠中。注射病毒之后48小时，收集图中指出的组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描1分钟。仅注射adsyn-co176的小鼠在大脑中显示出荧光素酶信号，该信号与tdtomato表达完全重合。

图8a-8c.施用具有治疗性转基因的合成腺病毒。(图8a)kpcl(kras^g12d；p53敲除；pdx1-cre；萤火虫荧光素酶)小鼠模型的示意图。kpcl小鼠与纯合的“kras；p53/p53；cre”小鼠类似，其在胰腺中特异性地表达kras^g12d，并且仅在胰腺中敲除p53基因。但是，kpcl小鼠在胰腺中还特异性地表达萤火虫荧光素酶。kpcl小鼠中肿瘤的发展也类似于“kras；p53/p53；cre”小鼠。(图8b)显示每种处理(每处理组至少4只小鼠)的kpcl小鼠的平均存活的表格。adsyn-co987是基于adsyn-co176的合成腺病毒。将单纯性疱疹病毒-1胸苷激酶(tk)/更昔洛韦(ganciclovir)(gcv)自杀基因克隆到adsyn-co176中，以代替萤火成荧光素酶/gfp基因。在adsyn-co176的基因组中在tk之后紧接着另外插入海肾荧光素酶(renillaluciferase)。通过将tk-p2a-海肾荧光素酶克隆到adsyn-co171中以代替原始的萤火虫荧光素酶/gfp基因，产生对照病毒adsyn-co989。在5-6周龄时，经由尾部静脉给kpcl小鼠静脉内注射1x10⁶噬斑形成单位(pfu)的所示病毒。2天之后，给小鼠腹腔内(i.p.)或静脉内(i.v.)注射gcv。使用3个对照组：adsyn-co989+gcv；adsyn-co987之后注射盐水(adsyn-co987+盐水)和仅gcv注射(i.p.或i.v.)。与对照相比，用adsyn-co987+gcv治疗延长了小鼠的存活。(图8c)显示萤火虫荧光素酶信号的代表性小鼠的图像。在治疗过程中对萤火虫荧光素酶信号(由肿瘤表达)进行分析，以监测肿瘤生长。对z619r小鼠的治疗为adsyn-co987+盐水，将其用作对照。将小鼠z601r和z607r用adsyn-co987+gcv(i.p.)治疗。尽管在对照小鼠z619r中萤火虫荧光素酶信号的强度增加(表明肿瘤大小的增加)，在小鼠z601r和z607r中信号降低(表明肿瘤大小的降低)。

图9a-9b.用adsyn-co987治疗的小鼠中的肿瘤组织学。(图9a)胰腺肿瘤的h&e染色图像。小鼠z655、1806、z619和z621均为对照小鼠。小鼠z655仅用i.p.注射的gcv治疗；小鼠1806仅用i.v.注射的gcv治疗；小鼠z619用adsyn-co987+盐水治疗；小鼠z621不接受治疗。小鼠z656接受adsyn-co987+gcvi.v.治疗。与对照相比，来自z656的肿瘤具有更多的坏死区(如箭头所示)。(图9b)放大的z656的肿瘤中的代表性坏死区。该区也在图9a中示出。

序列表

所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用37c.f.r.1.822中定义的核苷酸碱基标准字母缩写和氨基酸三字母代码显示。每个核酸序列仅示出一条链，但应理解，在任何提及所展示的链时，其互补链也包括在内。序列表以ascii文本文档提交，于2017年11月30日生成，215kb，其通过引用并入本文。在所附序列表中：

seqidno:1是合成腺病毒adsyn-co171的核苷酸序列。

seqidno:2是合成腺病毒adsyn-co176的核苷酸序列。

seqidno:3是ad5六邻体的氨基酸序列。

seqidno:4是ad5六邻体e451q的氨基酸序列。

seqidno:5是合成腺病毒adsyn-co987的核苷酸序列。

seqidno:6是合成腺病毒adsyn-co989的核苷酸序列。

具体实施方式

i.缩写

ad腺病毒

car柯萨奇腺病毒受体

cea癌胚抗原

egf表皮生长因子

egfr表皮生长因子受体

flt3fms-相关酪氨酸激酶3

gcv更昔洛韦

gfap胶质原纤维酸性蛋白

gfp绿色荧光蛋白

gm-csf粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

h&e苏木精和曙红

hsv单纯性疱疹病毒

icam细胞间粘附分子

if免疫荧光

ihc免疫组织化学

il白介素

ires内部核糖体进入位点

i.p.腹腔内

i.v.静脉内

kpclkras^g12d；p53敲除；pdx1-cre；萤火虫荧光素

lfa淋巴细胞功能相关抗原

mir微小rna

muc1粘蛋白1

nod非肥胖型糖尿病

nsgnodscidgamma

pd-1程序性细胞死亡蛋白1

pdgf血小板源性生长因子

pet正电子发射断层成像术

pfu噬斑形成单位

shrna短发卡rna

sma平滑肌肌动蛋白

tgf转化生长因子

tk胸苷激酶

tnf肿瘤坏死因子

utr非翻译区

vegf血管内皮生长因子

wt野生型

ii.术语和方法

除非另外指出，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可见于benjaminlewin,genesv,由oxforduniversitypress出版,1994(isbn0-19-854287-9)；kendrewetal.(eds.),theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellscienceltd.出版,1994(isbn0-632-02182-9)；和roberta.meyers(ed.),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由vchpublishers,inc.出版,1995(isbn1-56081-569-8)。

为了便于审阅本公开的各个实施方式，提供以下特定术语的解释：

腺病毒:具有线性双链dna基因组和二十面体衣壳的无包膜病毒。目前已知有68种人腺病毒血清型，将其分成7个种类(种类a、b、c、d、e、f和g)。腺病毒的不同血清型与不同类型的疾病相关，其中一些血清型导致呼吸道疾病(主要是种类b和c)、结膜炎(种类b和d)和/或肠胃炎(种类f和g)。

施用:通过任何有效路径提供或给予受试者药剂，例如治疗性药剂(例如重组病毒)。示例性的施用路径包括，但不限于，注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹腔内、瘤内和静脉内)、口服、管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入路径。

嵌合:由至少2个具有不同来源的部分组成。在本公开的上下文中，“嵌合腺病毒”是具有源自至少2个不同血清型(例如源自ad5和第二血清型腺病毒)的基因材料和/或蛋白质的腺病毒。在该上下文中，“衣壳交换(capsid-swapped)”腺病毒是指其中衣壳蛋白源自一血清型腺病毒并且其余蛋白质源自另一腺病毒血清型的嵌合腺病毒。类似地，“嵌合纤维”是具有源自至少2种不同血清型腺病毒的氨基酸序列的纤维蛋白。例如，嵌合纤维可以由来自ad5的纤维轴和来自第二血清型腺病毒的纤维隆突组成。

接触:置于直接的物理结合下；包括固体和液体形式。

简并变体:在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码肽的多核苷酸，所述肽包括由于遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸，其大多数由一种以上的密码子指定。因此，编码肽的所有简并核苷酸序列均包括在内，只要由核苷酸序列编码的氨基酸序列不变即可。

去靶向：在本公开的上下文中，“去靶向”腺病毒是包括一个或多个修饰的重组或合成腺病毒，所述修饰改变病毒的趋向性，使得不再感染、或者基本上不再感染特定的细胞或组织类型。在一些实施方式中，所述重组或合成腺病毒包括衣壳突变，例如，六邻体蛋白中的突变(例如e451q)。在一些实施方式中，所述重组或合成腺病毒包括来自天然地不感染、或基本上不感染特定细胞或组织类型的腺病毒的天然衣壳。在一些实施方式中，所述重组或合成腺病毒是肝脏去靶向和/或脾去靶向的。

e1a：腺病毒早期区域1a(e1a)基因和自该基因表达的多肽。所述e1a蛋白质通过驱动细胞进入细胞周期而在病毒基因组复制中发挥作用。如本文所用，术语“e1a蛋白质”是指自e1a基因表达的蛋白质，该术语包括任何腺病毒血清型产生的e1a蛋白质。

纤维：腺病毒纤维蛋白是介导与细胞表面受体结合的三聚蛋白质。纤维蛋白包括长的n-端轴和球形的c-端隆突。

融合蛋白:含有来自至少2种不同(异源性)蛋白质或肽的氨基酸片段的蛋白质。例如，通过自编码2种不同(异源性)蛋白质的至少一部分的核酸序列改造的核酸序列的表达，可以产生融合蛋白。为了产生融合蛋白，核酸序列必须位于相同阅读框中，并不含内部终止密码子。融合蛋白，特别是短的融合蛋白，也可以通过化学合成产生。

成胶质细胞瘤：快速生长的中枢神经系统肿瘤类型，其由脑和脊髓的神经胶质组织形成。成胶质细胞瘤通常在成人中发生，比起脊髓，更经常地感染大脑。成胶质细胞瘤是最常见、最具侵袭性的起始于大脑的癌症。成胶质细胞瘤也称作成胶质细胞瘤多形性细胞瘤(gbm)和iv级星形细胞瘤。

异源性：异源性蛋白质或基因是指蛋白质或基因源自不同的来源或物种。

六邻体：主要的腺病毒衣壳蛋白。来自ad5的示例性六邻体序列在本文中描述为seqidno:3。包括e451q置换的突变六邻体序列在本文中描述为seqidno:4。

分离：“分离的”生物组分(例如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经基本上与该组分天然存在的有机体的细胞或组织或者有机体自身中的其他生物组分(例如其他染色体或染色体外dna和rna、蛋白质和细胞)分离或从其中纯化。经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

微小rna(mirna或mir)：调节植物、动物和病毒中基因表达的单链rna分子。对编码微小rna的基因进行转录，以形成初级转录物微小rna(pri-mirna)，对其进行加工，以形成称作前体微小rna(pre-mirna)的短茎环分子，然后进行内切核苷酸切割，以形成成熟微小rna。成熟微小rna长度为大约21-23核苷酸，并且与一个或多个目标信使rna(mrna)的3'utr部分互补。微小rna通过促进靶mrna的切割或者阻断细胞转录物的翻译来调节基因表达。在本公开的上下文中，“肝脏特异性微小rna”是优先在肝脏中表达的微小rna，例如仅在肝脏中表达的微小rna，或者与其他器官或组织类型相比在肝脏中的表达显著更多的微小rna。在一些实施方式中，所述微小rna是mir-122。在本公开的上下文中，“脾特异性微小rna”是优先在脾中表达的微小rna，例如仅在脾中表达的微小rna，或者与其他器官或组织类型相比在脾中的表达显著更多的微小rna。在一些实施方式中，所述微小rna是mir-142-3p。

修饰：核酸或蛋白质序列的序列改变。例如，氨基酸序列修饰包括，例如，置换、插入和缺失或其组合。插入包括氨基和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。缺失特征在于自蛋白质序列移除一个或多个氨基酸残基。在本文的一些实施方式中，修饰(例如置换、插入或缺失)导致功能上的变化，例如蛋白质特定活性的降低或提高。如本文所用，“δ”或“delta”是指缺失。置换修饰是其中至少一个残基被移除并在其位置中插入不同残基的修饰。氨基酸置换典型地是单个残基的，但也可以一次在若干个不同位置上发生。置换、缺失、插入或其任意组合可以结合起来，以获得最终的突变序列。这些修饰物可以通过修饰编码蛋白质的dna中的核苷酸、从而产生编码该修饰的dna而制备。在具有已知序列的dna中的预定位置处进行插入、缺失和置换突变的技术是本领域公知的。“修饰的”蛋白质、核酸或病毒是具有上述一种或多种修饰者。

可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录和表达，则所述启动子与所述编码序列可操作连接。通常，可操作连接的dna序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区结合在相同的阅读框中。

胰腺癌：在胰腺组织中开始的癌症。胰腺癌典型地迅速扩散，且极少在早期被检测到，导致大多数确诊患者的预后不良。最常见的胰腺癌类型是胰腺腺癌(pancreaticadenocarcinoma)，其在胰腺癌病例中占大约85％。

药学可接受的载体：本公开中可用的药学可接受的载体(媒介物)是常规的。remington’spharmaceuticalsciences(e.w.martin,mackpublishingco.,easton,pa,第15版(1975))描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或药剂(例如本文公开的合成病毒)的药学递送的组合物和制剂。

通常，载体的性质取决于采用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的流体作为载体，该流体包括药学和生理学可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体以外，待施用的药物组合物还可以含有微量的无毒辅剂，例如润湿或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或去水山梨糖醇月桂酸酯。

多肽、肽或蛋白质：其中单体是通过酰胺键结合在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用l-光学异构体或d-光学异构体。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”包括指结合到蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。

多肽中的保守置换是将蛋白质序列中的一氨基酸残基置换成具有相似生化特性的不同氨基酸残基。典型地，保守置换对产生的多肽的活性几乎没有或没有影响。例如，包括一个或多个保守置换(例如不多于1、2、3、4或5个置换)的蛋白质或肽保持野生型蛋白质或肽的结构和功能。通过使用例如标准方法如定点诱变或pcr操纵编码多肽的核苷酸序列，可以产生含有一个或多个保守置换的多肽。在一例子中，这些变体可以通过检验抗体交叉反应性或其诱导免疫反应的能力容易地选择。保守置换的例子显示如下。

保守置换通常保持(a)置换区中多肽骨架的结构，例如保持成折叠或螺旋构象，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。

通常预期产生蛋白质特性极大改变的置换将是非保守的，例如，如下改变，其中(a)亲水性残基例如丝氨酰基或苏氨酰基置换成(为)疏水性残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换成(为)其他残基；(c)具有电正性侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换成(为)电负性残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸置换成(为)没有侧链的残基例如甘氨酸。

正电子发射断层成像术(pet)：用于观察体内代谢过程的成像技术。pet检测在生物活性分子上引入至体内的正电子发射放射性核素直接发射的γ射线对。pet报道基因编码为pet探针提供靶标的分子(例如受体或酶)，其然后可以通过成像得以检测。pet报道基因通常分成三类：(1)编码对特异性pet报道基因探针进行磷酸化的酶、导致其胞内捕获(intracellularentrapment)的报道基因；(2)编码可以被特异性pet报道基因探针结合的蛋白质受体的报道基因；和(3)编码将放射性核素报道基因转运到表达报道基因的细胞中的蛋白质转运体的报道基因(yaghoubietal.,theranostics2(4):374-391,2012)。如本文所用，“pet报道基因”包括任何编码蛋白质的基因，该蛋白质能够以允许探针通过分子成像得以检测的方式与pet报道基因探针相互作用。示例性的pet报道基因包括，但不限于，单纯性疱疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)及其突变形式、水痘-带状疱疹病毒(vsv)tk、人线粒体tk及其突变体、脱氧胞苷激酶的突变体、多巴胺2受体突变体、人雌激素受体α配体结合结构域(herl)、人生长抑素受体亚型2(hsstr2)、重组人癌胚抗原(cea)、改造的抗体片段、人源化膜锚定抗-聚乙二醇(peg)、钠碘同向转运体(nis)和人去甲肾上腺素转运体(hnet)(参见yaghoubietal.(2012)，pet报道基因和对应的报道基因探针的综述)。

预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全进展。“治疗”是指在疾病或病理状态已经开始发展之后减轻其迹象或症状的治疗性干预。“减轻”是指降低疾病迹象或症状的数量或严重程度。

启动子：dna指导/引发核酸(例如基因)转录的区域。启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列。典型地，启动子位于其转录的基因附近。启动子还可以任选地包括远端增强子或阻遏子元件(repressorelements)，其可以位于距离转录起始位点数千个碱基对处。“组成型启动子”是连续活性并不受外部信号或分子调节的启动子。与此相反，“诱导型启动子”的活性受外部信号或分子(例如转录因子或四环素)调节。“组织特异性启动子”是基本上仅在特定组织或多个组织中有活性的启动子。

蛋白质ix(pix)：腺病毒衣壳与六邻体蛋白缔合的次要组分。

纯化：术语“纯化”不要求绝对纯度；相反，它意在是相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其他化合物是整体上与天然结合的蛋白质和其他污染物全部或部分分离者。在某些实施方式中，术语“基本上纯化”是指肽、蛋白质、病毒或其他化合物已经自细胞、细胞培养基或其他粗制剂中分离出，并进行过分级(fractionation)，以除去初始制剂中的各种组分，例如蛋白质、细胞碎片和其他组分。

重组：重组核酸分子、蛋白质或病毒是具有非天然序列或者具有通过将两个本分离的序列片段人工组合产生的序列的核酸分子、蛋白质或病毒。这种人工组合可以通过化学合成或者通过诸如基因改造技术的人工操纵分离的核酸分子片段来实现。术语“重组”还包括已单独地通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失而改变的核酸、蛋白质和病毒。

序列同一性：两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性，其表示为序列之间的同一性或相似性。序列同一性可以测量为同一性百分比；百分比越高，序列越一致。序列相似性可以测量为相似性百分比(其考虑了保守氨基酸置换)；百分比越高，序列越相似。当用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直向同源物具备相对高度的序列同一性/相似性。与关系更远的物种相比(例如人和秀丽隐杆线虫(c.elegans)的序列)，当直向同源性蛋白质或cdna源自更加密切相关的物种时(例如人和小鼠的序列)，这种同源性更加显著。

用于比较的序列比对方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于：smith&waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson&lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins&sharp,gene,73:237-44,1988；higgins&sharp,cabios5:151-3,1989；corpetetal.,nuc.acidsres.16:10881-90,1988；huangetal.computerappls.inthebiosciences8,155-65,1992和pearsonetal.,meth.mol.bio.24:307-31,1994。altschuletal.,j.mol.biol.215:403-10,1990介绍了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

ncbi基础局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool)(blast)(altschuletal.,j.mol.biol.215:403-10,1990)可获自若干来源，包括美国生物信息中心(thenationalcenterforbiologicalinformation)(ncbi)和互联网，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。其他信息可见于ncbi网站。

血清型：通过特征性抗原组区分的一类密切相关的微生物(例如病毒)。

基质：上皮器官或肿瘤的支持性组织，由结缔组织和血管组成。基质细胞是构成基质的细胞，主要是成纤维细胞和周细胞。肿瘤基质主要由成纤维细胞、细胞外基质、免疫细胞、血管和基膜构成(bremnesetal.,jthoraconcol6:209-217,2011)。肿瘤基质细胞已知在癌症的生长和进展中发挥重要作用。

受试者：活的多细胞脊椎动物有机体，包括人和非人哺乳动物的种类。

合成：通过人工方法在实验室中产生，例如，可以在实验室中化学合成的合成核酸或蛋白质。

治疗性药剂：适当地施用给受试者时能够诱导所需治疗性或预防性效果的化合物、小分子、重组病毒或其他组合物，例如反义化合物、抗体、肽或核酸分子。

治疗有效量：特定的药物或治疗药剂(例如重组病毒)足以在用该药剂治疗的受试者中或细胞中实现所需效果的量。药剂的有效量可以取决于若干因素，其包括但不限于，被治疗的受试者或细胞和治疗性组合物的施用方式。

转基因：被插入到不同有机体(例如病毒)的基因组中的基因。转基因也可以称作异源性基因。如本文所用，“诊断性转基因”是指编码可检测产物的任意转基因，上述可检测产物例如，但不限于，荧光蛋白、酶或pet报道基因。如本文所用，“治疗性转基因”是指编码具有治疗性应用的产物的任意转基因。在本公开的上下文中，治疗性转基因可以是，例如，抗癌药剂或者破坏或杀死肿瘤基质的药剂。

uexon：位于早期e3区和纤维基因之间的l链(向左转录)上的开放阅读框(tollefsonetal.,jvirol81(23):12918-12926)。

载体：允许外来核酸在不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的情况下插入的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个选择标记基因和其他基因元件。表达载体是含有允许插入的一个或多个基因转录和翻译所必需的调控序列的载体。

iii.若干实施方式总览

本文公开了表达具有ad34隆突结构域的纤维蛋白的肝脏去靶向合成腺病毒能够归巢至肿瘤部位。所述合成腺病毒可以用于，例如，在肿瘤细胞(包括肿瘤基质细胞)中递送和表达诊断性或治疗性转基因。

本文提供在受试者肿瘤细胞中表达转基因的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括所述转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。

在一些实施方式中，所述转基因是诊断性转基因。在一些例子中，所述诊断性转基因编码荧光蛋白，例如，但不限于，绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、青色荧光蛋白(cfp)、红色荧光蛋白(rfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或橙色荧光蛋白(例如morange)。在其它例子中，所述诊断性转基因编码酶，例如荧光素酶。在其他的例子中，所述诊断性转基因包括正电子发射断层成像术(pet)报道基因。

在其它实施方式中，所述转基因是治疗性转基因。在一些例子中，所述治疗性转基因编码抗癌药剂。在具体例子中，所述抗癌药剂是促炎性分子或细胞因子，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、cd40配体(cd40l)、fms-相关酪氨酸激酶3(flt3)配体、白介素(il)-1b、il-2、il-4、il-6、il-12、肿瘤坏死因子(tnf)-α、干扰素、趋化因子、b7-1、细胞间粘附分子(icam)-1、淋巴细胞功能相关抗原(lfa)-3、转化生长因子(tgf)-β、血小板源性生长因子(pdgf)或表皮生长因子(egf)。在其他具体例子中，所述抗癌药剂是抗血管生成因子，例如血管内皮生长因子(vegf)抑制剂。在其他具体例子中，所述抗癌药剂是kras抑制剂(例如sirna或shrna抑制剂)。在其他具体例子中，所述抗癌药剂是细胞毒性t淋巴细胞相关分子(ctla)-4、程序性细胞死亡蛋白质1(pd-1)、程序性死亡配体1(pd-l1)、癌胚抗原(cea)或粘蛋白1(muc1)的抑制剂。在一些例子中，所述治疗性转基因编码破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。在具体例子中，所述药剂是rexin-g、单纯性疱疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)、p53、tnf-α、fas/fasl或白喉毒素a。

本文还提供诊断受试者患有肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括诊断性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。

在一些实施方式中，所述诊断性转基因包括正电子发射断层成像术(pet)报道基因。在一些例子中，所述pet报道基因是病毒或人胸苷激酶(或其突变形式)、脱氧胞苷激酶的突变体、多巴胺2受体突变体、人雌激素受体α配体结合结构域(herl)、人生长抑素受体亚型2(hsstr2)、重组人cea、改造的抗体片段、人源化膜锚定抗-聚乙二醇(peg)、钠碘同向转运体(nis)或人去甲肾上腺素转运体(hnet)。

在其他实施方式中，所述诊断性转基因编码荧光蛋白。在一些例子中，所述荧光蛋白包括gfp、yfp、cfp、rfp、bfp或橙色荧光蛋白。

在其他实施方式中，所述诊断性转基因编码酶。在一例子中，所述酶是荧光素酶。

本文还提供治疗受试者中肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括治疗性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。

在一些实施方式中，所述治疗性转基因编码抗癌药剂。在一些例子中，所述抗癌药剂是促炎性分子或细胞因子，例如gm-csf、cd40l、flt3、il-1b、il-2、il-4、il-6、il-12、tnf-α、干扰素、趋化因子、b7-1、icam-1、lfa-3、tgf-β、pdgf或egf。在其他例子中，所述抗癌药剂是抗血管生成因子，例如vegf抑制剂。在其它例子中，所述抗癌药剂是kras抑制剂(例如sirna或shrna抑制剂)。在其他例子中，所述抗癌药剂是ctla-4、pd-1、cea或muc1的抑制剂。在其他实施方式中，所述治疗性转基因编码破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。在一些例子中，所述药剂是rexin-g、hsv-tk、p53,tnf-α、fas/fasl或白喉毒素a。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述合成腺病毒包括使合成腺病毒自肝脏去靶向的修饰的衣壳。在一些例子中，所述合成腺病毒包括修饰的六邻体蛋白，例如e451q突变(在本文中如seqidno:4所示)。在其它实施方式中，所述合成腺病毒具有使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然(未修饰)衣壳(例如，来自天然地不感染肝脏的腺病毒血清型的衣壳)。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述合成腺病毒还包括针对肝脏特异性微小rna的一个或多个结合位点，例如2或3个结合位点。在一些例子中，所述肝脏特异性微小rna是mir-122。在一些例子中，所述一个或多个结合位点位于转基因的3′utr中。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述合成腺病毒还包括针对脾特异性微小rna的一个或多个结合位点，例如2或3个结合位点。在一些例子中，所述脾特异性微小rna是mir142-3p。在一些例子中，所述一个或多个结合位点位于转基因的3′utr中。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述转基因受组织特异性启动子调节，例如，在胰腺或中枢神经系统细胞中有活性的启动子。在其他实施方式中，所述转基因受肿瘤特异性启动子调节。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述合成腺病毒由ad5载体基因组产生。在一些例子中，所述合成腺病毒包括ad5衣壳蛋白和包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在其他实施方式中，所述肿瘤是成胶质细胞瘤。在其它实施方式中，所述肿瘤是乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、骨癌或黑色素瘤。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述肿瘤的特征在于p53肿瘤抑制活性的丧失。在一些例子中，所述肿瘤在p53中表现出突变。在一些例子中，所述肿瘤表现出野生型p53等位基因的丧失。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述肿瘤的特征在于ras基因例如kras、hras或nras中的突变。在本文公开的一些方法实施方式中，所述肿瘤的特征在于神经纤维瘤1型(nf1)、表皮生长因子受体(egfr)、brca1、brca2或her2中的改变或突变。

在本文公开的一些方法实施方式中，所述合成腺病毒的基因组包括与seqidno:2的同一性为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列。在一些例子中，所述合成腺病毒的基因组包括seqidno:2的核苷酸序列或者由其组成。

在本文公开的其他方法实施方式中，所述合成腺病毒的基因组包括与seqidno:5的同一性为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列。在一些例子中，所述合成腺病毒的基因组包括seqidno:5的核苷酸序列或者由其组成。

本文还提供与seqidno:2或seqidno:5的同一性为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的合成腺病毒基因组。在一些例子中，所述合成腺病毒的基因组包括seqidno:2或seqidno:5的核苷酸序列或者由其组成。

iv.合成腺病毒

adsembly、adslicr和rapad技术使得能够进行模块化设计并产生具有独特能力的腺病毒(参见pct公开号wo2012/024351和wo2013/138505，将其全文通过引用并入本文)。设计具有新功能和特性的定制病毒的能力使得能够通过让宿主原位产生蛋白质而扩展腺病毒作为递送治疗性蛋白质的用途。这提供了将难以制造的人蛋白质用于治疗目的独特能力，并能够将几乎任何蛋白质灵活递送至疾病组织。

本文公开的具体修饰参考腺病毒5(ad5)基因组序列加以描述，但也可以使用任意腺病毒血清型。腺病毒是天然的多基因表达载体。e1、e3和e4区在培养中对复制并非必要，或者可以用可用的细胞系进行补充。这些区中的每一个均具有独立的启动子元件，如果需要，该启动子元件可以被细胞启动子取代，以经由另外的剪接驱动多基因产物的表达。

如本文所公开，为了产生用于体内使用和转基因递送的ad5表达载体，使e1a/e1b基因缺失，并用至少一个转基因代替。在一些实施方式中，所述转基因是ef1α驱动的荧光素酶-gfp融合物。

本文公开的合成腺病毒还可以包括使病毒自肝脏去靶向的修饰。ad5六邻体可以在血液中与因子x结合，这会导致其在肝脏中被库普弗细胞(kuppfercell)吸收，其防止全身扩散和限制性炎症。为了克服这一点，将合成腺病毒改造成在e1中包括额外的基因组修饰，并包括防止肝脏中腺病毒摄入和转基因表达的核心模块，如下文中所进一步描述。

a.用于去靶向的ad34纤维和嵌合纤维蛋白

尽管ad5纤维蛋白和许多其他血清型已经显示出与柯萨奇腺病毒受体(car)结合用于细胞附着，其他血清型也显示使用cd46(gaggaretal.,natmed9:1408-1412,2003)、桥粒芯蛋白(desmoglein)2(wangetal.,natmed17:96-104,2011)、唾液酸(nilssonetal.,natmed17:105-109,2011)或其他(arnberg,trendspharmacolsci33:442-448,2012)。许多血清型的受体利用尚未深入考察，并且认为cd46在成熟小鼠中不表达。由于纤维蛋白c-端处的球形隆突通常负责受体结合，通过将ad5纤维隆突用来自ad34的纤维隆突取代，产生嵌合体(参见下文实施例1)。所述合成病毒包括含有e1a/e1b缺失的e1模块和由ef1α启动子驱动的荧光素酶-gfp融合物。所述合成腺病毒还在六邻体蛋白中包括肝脏去靶向修饰(e451q)，并在转基因的3′utr中包括针对微小rna的结合位点，上述微小rna在肝脏中特异性表达(mir-122)，以防止转基因的脱靶表达。

本文公开的数据说明了能够结合来自其他血清型的修饰部分以改善基于ad5的载体。在该情形下，允许快速组装针对进入肿瘤细胞而优化的病毒。

b.肝脏去靶向修饰

天然ad5载体将仅感染肺部(经由吸入)或肝脏(经由静脉内施用)。ad5六邻体在血液中与因子x结合，这导致其在肝脏中被库普弗细胞吸收，防止全身扩散并诱导病毒限制性炎症。为了克服这一点并能够静脉内递送可全身行进至肿瘤部位的病毒，将合成腺病毒改造成在e1中包括额外的基因组修饰，并包括防止肝脏中的摄入和表达的核心模块。

为了防止病毒通过ad5六邻体结合因子x在肝脏中摄入和隔离，将病毒改造成在六邻体中具有额外的防止肝脏摄入的突变(e451q)。例如，adsyn-co171不在肝脏中累积，而是能够靶向其他器官例如脾和淋巴结。因此，在本文一些实施方式中，所述合成腺病毒包括具有e451q置换的修饰的六邻体蛋白。

为了防止肝脏中的脱靶转基因表达，将病毒改造成在转基因的3′非翻译区(utr)中包括针对微小rna的结合位点，上述微小rna在肝脏中特异性表达。在具体实施方式中，选择mir122作为肝脏特异性微小rna，因为其表达和结合位点在人和小鼠肝细胞中都是保守的。在一些例子中，在转基因的3′utr中插入针对肝脏特异性mir122的两个微小rna结合位点，以防止肝脏中任何残余转基因表达。

本文公开了具有mir-122结合位点和六邻体突变的合成腺病毒不会在肝脏中积累，而是能够靶向肿瘤。在一些实施方式中，针对肝脏特异性微小rna的一个或多个结合位点位于转基因的3′-utr中。在一些例子中，所述肝脏特异性微小rna是mir-122、mir-30或mir-192。

本文考虑了腺病毒六邻体基因的其他突变，以防止腺病毒在肝脏中积累。例如，通过将六邻体的9个高变区用来自不同血清型的高变区取代，可以使合成腺病毒自肝脏去靶向。

在一些例子中，所述重组腺病毒包括六邻体蛋白，该六邻体蛋白包括seqidno:3或seqidno:4的氨基酸序列或者由其组成。

c.用于避开中和抗体的衣壳交换

大多数人群体已经具有识别ad5的抗体，ad5是在研究和治疗应用中最常用的血清型。而且，一旦在患者中使用特定的腺病毒血清型，将会产生识别病毒衣壳的新抗体，使得重复施用相同的载体成为问题。因此，本公开还考虑开发天然的腺病毒模块，以产生能够避开现有中和抗体的嵌合病毒。例如，本文公开的重组腺病毒还可以包括完整的‘衣壳’模块交换(几乎60％的基因组)，这使其对于现有的抗体“不可见”，能够重复接种。

在一些实施方式中，基因组的e1、e3和e4区源自第一腺病毒血清型，基因组的e2b、l1、l2、l3、e2a和l4区源自第二腺病毒血清型，例如ad34。在一些例子中，第一腺病毒血清型的e1区被修饰成编码来自第二腺病毒血清型的pix蛋白质；和/或第一腺病毒血清型的e3区被修饰成编码来自第二腺病毒血清型的uexon和纤维蛋白。在具体例子中，所述第一腺病毒血清型是ad5，且所述第二腺病毒血清型是ad34。

d.用于诊断性和治疗性应用的转基因的表达

本文公开了包括具有ad34隆突结构域和肝脏去靶向突变的嵌合纤维蛋白的重组腺病毒能够靶向肿瘤。还公开了所述重组腺病毒能够在肿瘤组织中例如在肿瘤基质细胞中表达转基因。在一例子中，所述转基因是报道基因，例如能够检测病毒转导细胞的荧光素酶-gfp报道基因。在另一例子中，所述转基因是治疗性转基因，例如抗癌分子。本公开提供包括用于诊断和治疗肿瘤的诊断性或治疗性转基因的合成腺病毒。

本文提供诊断受试者患有肿瘤的方法，通过给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括诊断性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。例如，所述诊断性转基因可以是pet报道基因、荧光蛋白或酶。

本文还提供治疗受试者中肿瘤的方法，通过给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括治疗性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和ad34纤维蛋白或包括ad5轴结构域和ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。例如，所述治疗性转基因可以是抗癌药剂或者破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。

在一些实施方式中，所述转基因插入e1到或e3区中。合适的转基因插入位点是本领域公知的(参见，例如，pct公开号wo2012/024351)。

所述转基因例如编码荧光蛋白的基因与启动子可操作连接。在一些实施方式中，所述启动子是异源性启动子。在一些例子中，所述启动子是ef1α启动子。启动子的选择在本领域技术人员的能力范围之内。在一些情形中，所述启动子是诱导型启动子或组织特异性启动子。用于在胰腺组织中表达的示例性组织特异性启动子是pdx1。

在一些情形中，使用单一启动子来调节多种基因的表达，其可以通过使用内部核糖体进入位点(ires)或2a肽实现。

v.药物组合物及其施用

本文提供包括合成腺病毒(或者编码合成腺病毒的一种或多种核酸或载体)的组合物。任选地，所述组合物适合于在体内或体外配制和施用。任选地，所述组合物包括一种或多种重组腺病毒和药学可接受的载体。合适的载体及其制剂描述于以下文献中：remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版,loydv.allenetal.,editors,pharmaceuticalpress(2012)。药学可接受的载体包括在生物学上或其他方面并不是不合意的材料，即，将材料施用给受试者，而不会造成不合意的生物效果或者以有害的方式与包含其的药物组合物的其他组分相互作用。如果施用给受试者，任选地选择载体以使活性成分的降解最小化并使受试者中的有害副作用最小化。

根据已知方法施用重组病毒(或者编码重组腺病毒的一种或多种核酸或载体)，例如静脉内施用，例如，作为推注(bolus)或者通过一段时间内连续输注，通过肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、囊内、口服、局部、肿瘤内或吸入路径。所述施用可以是局部的或全身的。所述组合物可以经由若干施用路径中的任意者施用，其包括局部、口服、肠胃外、静脉内、关节内、腹腔内、肌肉内、皮下、腔内、经皮、肝内(intrahepatically)、颅内、雾化/吸入或通过经由支气管镜安装。因此，所述组合物以若干种方式施用，其取决于需要局部还是全身治疗，以及待治疗的区域。

在一些实施方式中，用于施用的组合物将包括溶解在药学可接受的载体、优选含水载体中的本文所述的重组腺病毒(或重组基因组)。可以使用许多种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，且通常不含不合意的物质。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术进行灭菌。所述组合物可以含有为接近生理条件所需的药学可接受的辅剂，，例如，ph调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以宽泛地变化，并将根据所选的具体施用方式和受试者的需求主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。

具体地，重组病毒的药物制剂可以通过将具有所需纯度的重组腺病毒(或编码重组腺病毒的一种或多种核酸)与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备。这些制剂可以是冻干制剂或水溶液。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机盐；抗氧化剂(例如抗坏血酸)防腐剂、低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶，或者亲水性聚合物例如聚乙烯吡洛烷酮；和氨基酸、单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；和离子型和非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯)；成盐抗衡离子例如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂。重组腺病毒(或编码重组腺病毒的一种或多种核酸)可以任意适当浓度的感染单位进行配制。

适合于口服施用的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，例如悬浮在稀释剂例如水、盐水或peg400中的有效量的重组腺病毒；(b)胶囊、小袋剂(sachets)或片剂，其每种均含有预订量的作为液体、固体、颗粒或明胶的活性成分；(c)适当液体中的悬液；和(d)适当的乳液。片剂形式可以包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、染料、崩解剂和药学可接受的载体。锭剂形式可以在香料例如蔗糖中包括活性成分，以及在惰性基质中包括活性成分的软锭剂(pastilles)，上述惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等，其除活性成分以外还含有本领域已知的载体。

单独的或者与其他适当组分结合的重组腺病毒(或编码重组腺病毒的一种或多种核酸)可以制成气溶胶制剂(即，它们可被“雾化”)，以经由吸入施用。气溶胶制剂可以置于加压的可接受推进剂中，例如，二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

适合于肠胃外施用(例如，诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、肿瘤内、皮内、腹腔内和皮下路径)的制剂包括含水的或非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与既定接受者的血液等渗的溶质；和含水的或非水性的无菌悬液，其可以含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在提供的方法中，组合物可以通过，例如静脉内输注、口服、局部、腹腔内、膀胱内、肿瘤内或鞘内施用。肠胃外施用、肿瘤内施用和静脉内施用是优选的施用方法。化合物的制剂可以置于单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿或小瓶。

注射溶液和悬液可以由之前所述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。药物制剂优选为单位剂型。在该形式中，将制剂分成含有适量活性成份的单位剂量。因此，药物组合物可以根据施用方法以许多种单位剂型施用。例如，适合于口服施用的单位剂型包括，但不限于，粉剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。

在一些实施方式中，所述组合物包括至少2种不同的重组腺病毒，例如编码不同转基因的重组腺病毒。在一些例子中，所述组合物包括2、3、4、5或6种不同的重组腺病毒。

在治疗性应用中，以有效的量或剂量给受试者施用重组腺病毒或其组合物。根据需要可以单一或多次施用组合物。“患者”或“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，这些方法可应用于人的疗法和兽医应用。

重组腺病毒的有效量基于个体确定，并且至少部分地基于所用的特定重组腺病毒；个体的大小、年龄、性别和总体健康。例如，对于人的施用，取决于所存在的增殖细胞或肿瘤的类型、大小和数量，使用至少10³噬斑形成单位(pfu)的重组病毒，例如至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²pfu，例如大约10³至10¹²pfu的重组病毒。有效量可以是大约1.0pfu/kg体重至大约10¹⁵pfu/kg体重(例如，大约10²pfu/kg体重至大约10¹³pfu/kg体重)。重组腺病毒以单一剂量或多剂量施用(例如，2、3、4、6或更多剂量)。多剂量可以同时或相继(例如在数天或数周时间内)施用。

在一些实施方式中，所提供的方法包括给受试者施用一种或多种治疗性药剂，例如一种或多种治疗癌症例如胰腺癌或成胶质细胞瘤的药剂。

本文所述的具有治疗性转基因的合成腺病毒的施用可以伴随着其他抗癌药剂或治疗性治疗(例如手术切除肿瘤)的施用。任何合适的抗癌药剂均可以与本文公开的重组病毒联合施用。示例性的抗癌药剂包括，但不限于，化疗药剂，例如，诸如有丝分裂抑制剂、烷基化药剂、抗代谢物、嵌入型抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活药剂、生物反应调节剂、抗激素(例如抗雄激素)、cdk抑制剂和抗血管生成药剂。其他抗癌治疗包括放疗和特异性靶向癌细胞的其他抗体(例如生物制剂)。

烷基化药剂的非限定性例子包括氮芥类(例如，氮芥、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸酯(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲佐菌素或达卡巴嗪)。

抗代谢物的非限定性例子包括叶酸类似物(例如氨甲喋呤)、嘧啶类似物(例如5-fu或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，例如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。

天然产物的非限定性例子包括长春花生物碱(例如长春花碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(例如更生霉素、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素c)和酶(例如l-天冬酰胺酶)。

其他药剂的非限定性例子包括铂配位化合物(例如顺式-二胺-二氯铂ii，也称作顺铂)、取代的脲(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如甲苄肼)和肾上腺皮质抑制剂(例如米托坦和氨鲁米特)。

激素和拮抗剂的非限定性例子包括肾上腺皮质激素类药(例如强的松)、孕酮(例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚和乙炔雌二醇)、抗雌激素(例如他莫昔芬)和雄激素(例如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的例子包括阿霉素、爱克兰、ara-c、bicnu、白消安、ccnu、卡铂、顺铂、环磷酰胺、道诺霉素、dtic、5-fu、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、氨甲喋呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其他紫杉烷，例如多西紫杉醇)、长春花碱、长春新碱、vp-16，而一些更新的药物包括吉西他滨(gemzar)、赫赛汀、伊立替康(camptosar,cpt-11)、leustatin、长春瑞滨、rituxansti-571、taxotere、拓扑替康(hycamtin)、希罗达(卡培他滨)、zevelin和骨化三醇。

可以使用的免疫调节剂的非限定性例子包括as-101(wyeth-ayerstlabs.)、溴匹立明(bropirimine)(upjohn)、γ干扰素(genentech)、gm-csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；geneticsinstitute)、il-2(cetus或hoffman-laroche)、人免疫球蛋白(cutterbiological)、imreg(获自imregofneworleans,la.)、sk&f106528和tnf(肿瘤坏死因子；genentech)。

另一种常用于一些类型癌症的治疗是手术治疗，例如，手术切除癌症或其一部分。治疗的另一例子是放疗，例如，向肿瘤部位施用放射性材料或能量(例如体外射线疗法)，以帮助根除肿瘤或者在手术切除之前使其缩小。

cdk(周期蛋白依赖性激酶)抑制剂是抑制cdk功能的药剂。用于所提供方法的cdk抑制剂的非限定性例子包括ag-024322、at7519、azd5438、夫拉平度(flavopiridol)、吲地磺胺(indisulam)、p1446a-05、pd-0332991和p276-00(参见，例如，lapennaetal.,naturereviews,8:547-566,2009)。其他cdk抑制剂包括ly2835219、帕博西尼(palbociclib)、lee011(novartis)、pan-cdk抑制剂at7519、seliciclib、cyc065、丁内酯i、hymenialdisine、su9516、cink4、pd0183812或fascaplysin。

在一些例子中，所述cdk抑制剂是广谱抑制剂(例如夫拉平度、奥罗莫星(olomoucine)、罗可嘌呤(roscovitine)、kenpaullone、sns-032、at7519、ag-024322、(s)-罗可嘌呤或r547)。在其它例子中，所述cdk抑制剂是特异性抑制剂(例如fascaplysin、ryuvidine、purvalanola、nu2058、bml-259、su9516、pd0332991或p-276–00)。

药剂和剂量的选择可以由本领域技术人员基于被治疗的指定疾病容易地确定。药剂和组合物的组合可以伴随地施用(例如，作为混合物)，分别地但是同时施用(例如，经由分别的静脉导管)，或者相继施用(例如，首先施用一种药剂，然后施用第二药剂)。因此，术语组合用于指两种或更多中药剂或组合物的伴随、同时或相继施用。

提供以下实施例，以说明某些具体特征和/或实施方式。这些实施例不应理解成将本公开限定于所描述的具体特征或实施方式。

实施例

实施例1:表达ad5/ad34嵌合纤维蛋白和肝脏去靶向修饰的合成腺病毒

尽管ad5的纤维蛋白和许多其他血清型已经显示出与car结合用于细胞附着，其他血清型也显示使用cd46(gaggaretal.,natmed9:1408-1412,2003)、桥粒芯蛋白2(wangetal.,natmed17:96-104,2011)、唾液酸(nilssonetal.,natmed17:105-109,2011)或其他(arnberg,trendspharmacolsci33:442-448,2012)。许多血清型的受体利用尚未深入考察，且认为cd46在成熟小鼠中不表达。

使用adsembly/adslic(参见pct公开号wo2012/024351，其通过引用并入本文)产生具有嵌合纤维蛋白的合成腺病毒。由于纤维蛋白c-端处的球形隆突通常负责受体结合，通过将ad5纤维隆突用来自ad34的纤维隆突取代，产生具有嵌合纤维蛋白的病毒(adsyn-co176)。对照病毒(adsyn-co171)含有ad5纤维蛋白(即，轴和隆突结构域均来自ad5)。两种病毒用相同的e1模块构建，该模块含有e1a/e1b缺失和由ef1α启动子驱动的荧光素酶-gfp融合物(表1)。所述重组病毒还包括肝脏去靶向修饰。天然ad5载体仅感染肺部(经由吸入)或肝脏(经由静脉内施用)。ad5六邻体在血液中与因子x结合，这导致其在肝脏中被库普弗细胞吸收，防止全身扩散并诱导病毒限制性炎症。为了克服这一点并允许对替代细胞类型的全身施用，将所述合成腺病毒改造成在e1中包括额外的基因组修饰，并包括防止肝脏中的摄入和表达的核心模块。具体地，两种病毒均在转基因的3′utr中包括针对在肝脏中特异性表达的微小rna(mir-122)的结合位点，并在六邻体中包括e451q突变。

表1.具有嵌合纤维蛋白和肝脏去靶向修饰的腺病毒

实施例2：表达ad34隆突结构域的合成腺病毒表现出对肿瘤基质的趋向性

该实施例说明了以下发现：表达具有ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白的adsyn-co176特异性地运送至肿瘤基质。

胰腺肿瘤模型

图1a示出cre-loxpkras^g12d/p53胰腺肿瘤模型的示意性概况。命名为“kras；p53/p53”的小鼠编码kras^g12d致癌基因，该致癌基因位于编码loxp-终止密码子-loxp的序列的下游。所述终止密码子在不存在cre重组酶的情况下阻断突变体kras(kras^g12d)的表达。但是，在cre重组酶的存在下，所述终止密码子被除去，并允许kras^g12d致癌基因的表达。在这些相同的小鼠中，p53基因的两个等位基因的侧翼为loxp位点(loxp-p53-loxp)。命名为“p53/p53；cre”的小鼠也具有侧翼为loxp的p53基因的两个等位基因(loxp-p53-loxp)，并且它们在胰十二指肠同源盒1(pdx1)启动子的驱动下表达cre重组酶转基因。pdx1是在胰腺细胞中特异性表达的基因，因此胰腺细胞中两个拷贝的p53缺失。株系之间的繁殖产生了这样的后代，其中pdx1启动子驱动的cre在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的两个等位基因的缺失和突变体kras^g12d的激活。命名为“kras；p53/p53；cre”的纯合子小鼠在5-7周内发展为胰腺肿瘤。将adsyn-co176静脉注射至kras；p53/p53和kras；p53/p53；cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描5分钟。如图1b所示，所述kras；p53/p53小鼠具有正常的胰腺，且荧光素酶信号主要来自于脾。与此相反，所述kras；p53/p53；cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自胰腺肿瘤。

另一项研究在cre-介导的基因操纵杂合模型中进行(图2a)。命名为“p53/+；cre”的小鼠具有一个野生型p53等位基因和一个侧翼为loxp位点的p53等位基因(loxp-p53-loxp)。kras；p53/p53和p53/+；cre株系之间的繁殖产生了这样的后代，其中pdx1启动子驱动的cre重组酶在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的单个等位基因的缺失和突变体kras^g12d的激活。命名为“kras；p53/+；cre,”的这些杂合小鼠由于具有p53的一个野生型等位基因而在之后发展为肿瘤(4-9月龄时)。为使胰腺肿瘤发生，该野生型等位基因必须丧失或被突变。将adsyn-co176静脉注射至四个月大的p53/+；cre和kras；p53/+；cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描1分钟。所述p53/+；cre小鼠具有正常的胰腺，且信号主要来自于脾。与此相反，4月龄的kras；p53/+；cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自肿瘤和肝脏。

杂合kras；p53/+；cre小鼠在4-9个月内发展为胰腺肿瘤。为了检验adsyn-co176是否可以感染肿瘤发展极早期(肿瘤可见之前)的胰腺肿瘤，将adsyn-co176静脉注射至2月龄的kras；p53/+；cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，并使用ivis^tm成像系统扫描4分钟。2月龄时kras；p53/+；cre小鼠的胰腺看起来是正常的，但是在该组织中发现了荧光素酶信号(图3a)。进行h&e染色，以评价用adsyn-co176感染之后胰腺的组织学。出于比较，图3b显示正常胰腺组织和胰腺肿瘤组织的典型组织学。来自2月龄kras；p53/+；cre小鼠的胰腺的h&e染色表明，小部分胰腺正在发展为肿瘤(图3c，通过多边形示出)，而大多数胰腺组织看起来是正常的。该结果表明，adsyn-co176可以感染极早期胰腺肿瘤。

在胰腺肿瘤中，仅有10％的细胞是癌细胞；其余90％是基质细胞。为了确定adsyn-co176靶向哪种细胞类型，进行ihc和if染色。ck19是肿瘤细胞标志物，而平滑肌肌动蛋白(sma)是基质细胞标记物。用adsyn-co176感染的胰腺肿瘤的ihc染色表明，自adsyn-co176表达的gfp与sma染色重叠，说明adsyn-co176靶向基质细胞(图4a)。被adsyn-co176感染的胰腺肿瘤的if染色也表明gfp与sma染色重叠(图4b)，证实了adsyn-co176感染基质细胞。

成胶质细胞瘤模型

图5a显示cre-介导的基因操纵成胶质细胞瘤模型的示意图。将慢病毒直接注射到gfap-cre小鼠的大脑中。胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子驱动的cre重组酶将rfp自编码慢病毒的基因中切除，并诱导主要在星形细胞中的hras^v12和gfp的表达。编码慢病毒的u6-p53shrna的表达敲低了摄入病毒的脑细胞中的p53表达。从注射之后1周起，hras^v12的表达和p53的敲低诱导大脑中的肿瘤发生。gfp信号用来指示成胶质细胞瘤的形成。将盐水、adsyn-co171或adsyn-co176经由静脉内(iv)施用注射到在4周前接受过肿瘤诱导慢病毒的gfap-cre小鼠中。注射病毒之后48小时，腹腔内注射荧光素之后，将小鼠用ivis^tm成像系统扫描1分钟(图5b)。在注射adsyn-co176的小鼠中检测到荧光素酶信号，但在注射盐水或adsyn-co171的小鼠中没有检测到信号。

给野生型小鼠(正常大脑)和接受过肿瘤诱导慢病毒注射的gfap-cre小鼠注射adsyn-co171或adsyn-co176。注射合成腺病毒之后72小时收集脑组织，与荧光素一起孵育5分钟，并用ivis^tm成像系统扫描5分钟(图5c)。仅有注射有肿瘤诱导慢病毒的gfap-cre小鼠显示出来自adsyn-co176的荧光素酶信号。这说明adsyn-co176仅在存在肿瘤时运送至脑组织。另外对脑组织进行gfp信号的扫描(图5d)。gfp信号用于识别成胶质细胞瘤。接受过肿瘤诱导慢病毒的两种gfap-cre小鼠均在大脑中具有gfp信号，而野生型小鼠中没有检测到gfp。在接受过肿瘤诱导慢病毒和adsyn-co176的gfap-cre小鼠中，gfp信号与荧光素酶信号完美地重合。

注射肿瘤诱导慢病毒在注射部位处引起暂时的脑损伤。尽管合成腺病毒(adsyn-co171和adsyn-co176)在最初注射慢病毒之后4周注射，但仍不明确adsyn-co176运送至成胶质细胞瘤是通过肿瘤还是通过注射部位损伤来驱动。为了回答该问题，在无注射、假注射或注射肿瘤诱导慢病毒之后4周，给gfap-cre小鼠注射合成腺病毒。给gfap-cre小鼠注射hanks’平衡盐溶液(hbss)或肿瘤诱导腺病毒。4周之后，静脉内注射adsyn-co171。如图6a所示，在任一组小鼠的脑中均没有来自adsyn-co171的荧光素酶信号。给gfap-cre小鼠注射hbss或肿瘤诱导慢病毒，或者不接受注射。4周之后，给小鼠静脉内注射adsyn-co176。如图6b所示，仅在接受了肿瘤诱导慢病毒的小鼠的大脑中检测到荧光素酶信号，而接受hbss或无注射的小鼠则不产生信号。这些结果说明，adsyn-co176的特异性是通过肿瘤驱动，而不是通过注射部位的损伤驱动。

实施例3：在异种移植模型中运送至人成胶质细胞瘤肿瘤的adsyn-co176

该实施例说明了以下发现：表达具有ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白的合成腺病毒能够靶向人成胶质细胞瘤肿瘤。

u87-tdtomato细胞系是表达tdtomato荧光蛋白作为报道物以能够监测肿瘤生长的人成胶质细胞瘤细胞系。当u87-tdtomato细胞颅内注射到nsg小鼠中以产生成胶质细胞瘤肿瘤时，肿瘤发展通常需要4-8周(图7a)。使用该成胶质细胞瘤异种移植模型确定adsyn-co176是否可以运送至人成胶质细胞瘤肿瘤。小鼠接受u87-tdtomato细胞的颅内注射之后4周，将adsyn-co171(seqidno:1)和adsyn-co176(seqidno:2)通过尾静脉注射静脉内注射到nsg小鼠中。注射病毒之后48小时，收集肝脏、脾和脑组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用ivis^tm成像系统扫描1分钟。如图7b所示，仅有注射了adsyn-co176的小鼠在大脑中显示出荧光素酶信号，该信号与tdtomato表达完全重合。因此，这些结果说明，adsyn-co176可以运送至人成胶质细胞瘤肿瘤，而adsyn-co171则不能。

实施例4：靶向肿瘤基质并表达治疗性转基因的合成腺病毒在动物模型中降低肿瘤大小

该实施例说明：表达具有ad34隆突结构域和治疗性负荷(payload)的嵌合纤维蛋白的合成腺病毒能够运送至肿瘤制剂，并降低肿瘤大小。

进行多项研究，以确定治疗性转基因是否可以被整合到adsyn-co176(seqidno:2)中以实现肿瘤治疗。为了进行该研究，使用kpcl(kras^g12d；p53敲除；pdx1-cre；萤火虫荧光素酶)小鼠模型(图8a)。kpcl小鼠与纯合的“kras；p53/p53；cre”小鼠类似，其在胰腺中特异性表达kras^g12d，并且仅在胰腺中敲除p53基因。但是，kpcl小鼠在胰腺中还特异性地表达萤火虫荧光素酶。kpcl小鼠中肿瘤的发展也类似于“kras；p53/p53；cre”小鼠。

产生两种其他的合成腺病毒–adsyn-co987(seqidno:5)和adsyn-co989(seqidno:6)。adsyn-co987是基于adsyn-co176的合成腺病毒。将单纯性疱疹病毒-1胸苷激酶(tk)/更昔洛韦(gcv)自杀基因克隆到adsyn-co176中，以代替萤火成荧光素酶/gfp基因。在adsyn-co176的基因组中在tk之后紧接着还插入海肾荧光素酶。通过将tk-p2a-海肾荧光素酶克隆到adsyn-co171中以代替原始的萤火虫荧光素酶/gfp基因，产生对照病毒adsyn-co989。

在5-6周龄时给kpcl小鼠经由尾部静脉静脉内注射1x10⁶pfuadsyn-co987或adsyn-co989。2天之后，给小鼠i.p.或i.v.注射gcv。使用3个对照组：adsyn-co989+gcv；adsyn-co987之后注射盐水(adsyn-co987+盐水)和仅gcv注射(i.p.或i.v.)。图8b提供的表显示每个治疗组的kpcl小鼠的平均存活期。与对照相比，用adsyn-co987+gcv治疗延长了小鼠的存活。

治疗过程中对肿瘤表达的萤火虫荧光素酶信号进行分析，以监测肿瘤生长。结果显示于图8c。对于z619r小鼠的治疗为adsyn-co987+盐水，将其用作对照。用adsyn-co987+gcv(i.p.)治疗小鼠z601r和z607r。尽管在对照小鼠z619r中萤火虫荧光素酶信号的强度增加(表明肿瘤大小的增加)，但在小鼠z601r和z607r中信号降低(表明肿瘤大小的降低)。

另外通过h&e染色对胰腺肿瘤的组织学进行了评价(图9a)。小鼠z655、1806、z619和z621均为对照小鼠。小鼠z655仅用i.p.注射的gcv治疗；小鼠1806仅用i.v.注射的gcv治疗；小鼠z619用adsyn-co987+盐水治疗；小鼠z621不接受治疗。小鼠z656接受adsyn-co987+gcvi.v.的治疗。与对照相比，来自z656的肿瘤具有更多的坏死区(图9b)。

鉴于可应用本公开原理的许多可能的实施方式，应当认识到，所示的实施方式仅仅是本发明的例子，不应当视作是对本发明的范围进行限定。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神以内的所有发明。

序列表

<110>萨克生物研究学院

<120>肿瘤靶向合成腺病毒及其用途

<130>7158-96599-02

<150>us62/433,140

<151>2016-12-12

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>36913

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成腺病毒基因组(adsyn-co171)

<400>1

catcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagt60

ttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgt120

gatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttg180

gtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtag240

taaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagagga300

agtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggg360

gactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttc420

cgggtcaaagttggcgttttattattaaaccgtattaccgccatgcatttaatggagtgc480

ctcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaa540

gttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactg600

ggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatat660

aagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggt720

aagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgcc780

ttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaag840

tgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttga900

ggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtct960

cgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttt1020

tttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttt1080

tggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcgggg1140

cctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctct1200

ggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtc1260

ggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaa1320

atggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggc1380

ctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggca1440

cctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggtttta1500

tgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcactt1560

gatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcc1620

tcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgacgctagcgctaccg1680

gactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccggatccatggaag1740

acgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctg1800

gagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgctttta1860

cagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggt1920

tggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtg1980

aaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttg2040

cgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagc2100

ctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagc2160

tcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagt2220

cgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgc2280

cagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactg2340

gtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgcca2400

gagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccat2460

tccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcg2520

tcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattc2580

aaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgaca2640

aatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaag2700

tcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctca2760

ctgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcg2820

gtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgg2880

gcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaa2940

acaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagaca3000

tagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgatta3060

agtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacacccca3120

acatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccg3180

ccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcg3240

ccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtac3300

cgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggcca3360

agaagggcggaaagatcgccgtggcagccgcagccaccatggtgagcaagggcgaggagc3420

tgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagt3480

tcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttca3540

tctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacg3600

gcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccg3660

ccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactaca3720

agacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagg3780

gcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaaca3840

gccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaaga3900

tccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaccc3960

ccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccc4020

tgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccg4080

ccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcgactctagatcataatcag4140

ccatacccaaacaccattgtcacactccaatcgattcaaacaccattgtcacactccaac4200

atttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaaca4260

taaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaata4320

aagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtgg4380

tttgtccaaactcatcaatgtaagtttaaacggcgcgcctgaaatgtgtgggcgtggctt4440

aagggtgggaaagaatatataaggtgggggtcttatgtagttttgtatctgttttgcagc4500

agccgccgccgccatgagcaccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgac4560

aacgcgcatgcccccatgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatgg4620

tcgccccgtcctgcccgcaaactctactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgcc4680

gttggagactgcagcctccgccgccgcttcagccgctgcagccaccgcccgcgggattgt4740

gactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagcttcccgttcatccgcccg4800

cgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaacttaatgt4860

cgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccc4920

tcccaatgcggtttaaaacacaacttttctatacaaagttgtaaataaaaaaccagactc4980

tgtttggatttggatcaagctaagtgtcttgctgtctttatttaggggttttgcgcgcgc5040

ggtaggcccgggaccagcggtctcggtcgttgagggtcctgtgtattttttccaggacgt5100

ggtaaaggtgactctggatgttcagatacatgggcataagcccgtctctggggtggaggt5160

agcaccactgcagagcttcatgctgcggggtggtgttgtagatgatccagtcgtagcagg5220

agcgctgggcgtggtgcctaaaaatgtctttcagtagcaagctgattgccaggggcaggc5280

ccttggtgtaagtgtttacaaagcggttaagctgggatgggtgcatacgtggggatatga5340

gatgcatcttggactgtatttttaggttggctatgttcccagccatatccctccggggat5400

tcatgttgtgcagaaccaccagcacagtgtatccggtgcacttgggaaatttgtcatgta5460

gcttagaaggaaatgcgtggaagaacttggagacgcccttgtgacctccaagattttcca5520

tgcattcgtccataatgatggcaatgggcccacgggcggcggcctgggcgaagatatttc5580

tgggatcactaacgtcatagttgtgttccaggatgagatcgtcataggccatttttacaa5640

agcgcgggcggagggtgccagactgcggtataatggttccatccggcccaggggcgtagt5700

taccctcacagatttgcatttcccacgctttgagttcagatggggggatcatgtctacct5760

gcggggcgatgaagaaaacggtttccggggtaggggagatcagctgggaagaaagcaggt5820

tcctgagcagctgcgacttaccgcagccggtgggcccgtaaatcacacctattaccggct5880

gcaactggtagttaagagagctgcagctgccgtcatccctgagcaggggggccacttcgt5940

taagcatgtccctgactcgcatgttttccctgaccaaatccgccagaaggcgctcgccgc6000

ccagcgatagcagttcttgcaaggaagcaaagtttttcaacggtttgagaccgtccgccg6060

taggcatgcttttgagcgtttgaccaagcagttccaggcggtcccacagctcggtcacct6120

gctctacggcatctcgatccagcatatctcctcgtttcgcgggttggggcggctttcgct6180

gtacggcagtagtcggtgctcgtccagacgggccagggtcatgtctttccacgggcgcag6240

ggtcctcgtcagcgtagtctgggtcacggtgaaggggtgcgctccgggctgcgcgctggc6300

cagggtgcgcttgaggctggtcctgctggtgctgaagcgctgccggtcttcgccctgcgc6360

gtcggccaggtagcatttgaccatggtgtcatagtccagcccctccgcggcgtggccctt6420

ggcgcgcagcttgcccttggaggaggcgccgcacgaggggcagtgcagacttttgagggc6480

gtagagcttgggcgcgagaaataccgattccggggagtaggcatccgcgccgcaggcccc6540

gcagacggtctcgcattccacgagccaggtgagctctggccgttcggggtcaaaaaccag6600

gtttcccccatgctttttgatgcgtttcttacctctggtttccatgagccggtgtccacg6660

ctcggtgacgaaaaggctgtccgtgtccccgtatacagacttgagaggcctgtcctcgag6720

cggtgttccgcggtcctcctcgtatagaaactcggaccactctgagacaaaggctcgcgt6780

ccaggccagcacgaaggaggctaagtgggaggggtagcggtcgttgtccactagggggtc6840

cactcgctccagggtgtgaagacacatgtcgccctcttcggcatcaaggaaggtgattgg6900

tttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtggg6960

ggcgcgttcgtcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtga7020

gtactccctctgaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacga7080

ggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcatccatctg7140

gtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttggtggcaaacgacccgtagagggcgtt7200

ggacagcaacttggcgatggagcgcagggtttggtttttgtcgcgatcggcgcgctcctt7260

ggccgcgatgtttagctgcacgtattcgcgcgcaacgcaccgccattcgggaaagacggt7320

ggtgcgctcgtcgggcaccaggtgcacgcgccaaccgcggttgtgcagggtgacaaggtc7380

aacgctggtggctacctctccgcgtaggcgctcgttggtccagcagaggcggccgccctt7440

gcgcgagcagaatggcggtagggggtctagctgcgtctcgtccggggggtctgcgtccac7500

ggtaaagaccccgggcagcaggcgcgcgtcgaagtagtctatcttgcatccttgcaagtc7560

tagcgcctgctgccatgcgcgggcggcaagcgcgcgctcgtatgggttgagtgggggacc7620

ccatggcatggggtgggtgagcgcggaggcgtacatgccgcaaatgtcgtaaacgtagag7680

gggctctctgagtattccaagatatgtagggtagcatcttccaccgcggatgctggcgcg7740

cacgtaatcgtatagttcgtgcgagggagcgaggaggtcgggaccgaggttgctacgggc7800

gggctgctctgctcggaagactatctgcctgaagatggcatgtgagttggatgatatggt7860

tggacgctggaagacgttgaagctggcgtctgtgagacctaccgcgtcacgcacgaagga7920

ggcgtaggagtcgcgcagcttgttgaccagctcggcggtgacctgcacgtctagggcgca7980

gtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctc8040

gcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggc8100

ctccgaacggtaagagcctagcatgtagaactggttgacggcctggtaggcgcagcatcc8160

cttttctacgggtagcgcgtatgcctgcgcggccttccggagcgaggtgtgggtgagcgc8220

aaaggtgtccctgaccatgactttgaggtactggtatttgaagtcagtgtcgtcgcatcc8280

gccctgctcccagagcaaaaagtccgtgcgctttttggaacgcggatttggcagggcgaa8340

ggtgacatcgttgaagagtatctttcccgcgcgaggcataaagttgcgtgtgatgcggaa8400

gggtcccggcacctcggaacggttgttaattacctgggcggcgagcacgatctcgtcaaa8460

gccgttgatgttgtggcccacaatgtaaagttccaagaagcgcgggatgcccttgatgga8520

aggcaattttttaagttcctcgtaggtgagctcttcaggggagctgagcccgtgctctga8580

aagggcccagtctgcaagatgagggttggaagcgacgaatgagctccacaggtcacgggc8640

cattagcatttgcaggtggtcgcgaaaggtcctaaactggcgacctatggccattttttc8700

tggggtgatgcagtagaaggtaagcgggtcttgttcccagcggtcccatccaaggttcgc8760

ggctaggtctcgcgcggcagtcactagaggctcatctccgccgaacttcatgaccagcat8820

gaagggcacgagctgcttcccaaaggcccccatccaagtataggtctctacatcgtaggt8880

gacaaagagacgctcggtgcgaggatgcgagccgatcgggaagaactggatctcccgcca8940

ccaattggaggagtggctattgatgtggtgaaagtagaagtccctgcgacgggccgaaca9000

ctcgtgctggcttttgtaaaaacgtgcgcagtactggcagcggtgcacgggctgtacatc9060

ctgcacgaggttgacctgacgaccgcgcacaaggaagcagagtgggaatttgagcccctc9120

gcctggcgggtttggctggtggtcttctacttcggctgcttgtccttgaccgtctggctg9180

ctcgaggggagttacggtggatcggaccaccacgccgcgcgagcccaaagtccagatgtc9240

cgcgcgcggcggtcggagcttgatgacaacatcgcgcagatgggagctgtccatggtctg9300

gagctcccgcggcgtcaggtcaggcgggagctcctgcaggtttacctcgcatagacgggt9360

cagggcgcgggctagatccaggtgatacctaatttccaggggctggttggtggcggcgtc9420

gatggcttgcaagaggccgcatccccgcggcgcgactacggtaccgcgcggcgggcggtg9480

ggccgcgggggtgtccttggatgatgcatctaaaagcggtgacgcgggcgagcccccgga9540

ggtagggggggctccggacccgccgggagagggggcaggggcacgtcggcgccgcgcgcg9600

ggcaggagctggtgctgcgcgcgtaggttgctggcgaacgcgacgacgcggcggttgatc9660

tcctgaatctggcgcctctgcgtgaagacgacgggcccggtgagcttgaacctgaaagag9720

agttcgacagaatcaatttcggtgtcgttgacggcggcctggcgcaaaatctcctgcacg9780

tctcctgagttgtcttgataggcgatctcggccatgaactgctcgatctcttcctcctgg9840

agatctccgcgtccggctcgctccacggtggcggcgaggtcgttggaaatgcgggccatg9900

agctgcgagaaggcgttgaggcctccctcgttccagacgcggctgtagaccacgccccct9960

tcggcatcgcgggcgcgcatgaccacctgcgcgagattgagctccacgtgccgggcgaag10020

acggcgtagtttcgcaggcgctgaaagaggtagttgagggtggtggcggtgtgttctgcc10080

acgaagaagtacataacccagcgtcgcaacgtggattcgttgatatcccccaaggcctca10140

aggcgctccatggcctcgtagaagtccacggcgaagttgaaaaactgggagttgcgcgcc10200

gacacggttaactcctcctccagaagacggatgagctcggcgacagtgtcgcgcacctcg10260

cgctcaaaggctacaggggcctcttcttcttcttcaatctcctcttccataagggcctcc10320

ccttcttcttcttctggcggcggtgggggaggggggacacggcggcgacgacggcgcacc10380

gggaggcggtcgacaaagcgctcgatcatctccccgcggcgacggcgcatggtctcggtg10440

acggcgcggccgttctcgcgggggcgcagttggaagacgccgcccgtcatgtcccggtta10500

tgggttggcggggggctgccatgcggcagggatacggcgctaacgatgcatctcaacaat10560

tgttgtgtaggtactccgccgccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaa10620

aacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcg10680

ggcggcagcgggcggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaatta10740

aagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgacagaagcaccatgtccttgggtccggcc10800

tgctgaatgcgcaggcggtcggccatgccccaggcttcgttttgacatcggcgcaggtct10860

ttgtagtagtcttgcatgagcctttctaccggcacttcttcttctccttcctcttgtcct10920

gcatctcttgcatctatcgctgcggcggcggcggagtttggccgtaggtggcgccctctt10980

cctcccatgcgtgtgaccccgaagcccctcatcggctgaagcagggctaggtcggcgaca11040

acgcgctcggctaatatggcctgctgcacctgcgtgagggtagactggaagtcatccatg11100

tccacaaagcggtggtatgcgcccgtgttgatggtgtaagtgcagttggccataacggac11160

cagttaacggtctggtgacccggctgcgagagctcggtgtacctgagacgcgagtaagcc11220

ctcgagtcaaatacgtagtcgttgcaagtccgcaccaggtactggtatcccaccaaaaag11280

tgcggcggcggctggcggtagaggggccagcgtagggtggccggggctccgggggcgaga11340

tcttccaacataaggcgatgatatccgtagatgtacctggacatccaggtgatgccggcg11400

gcggtggtggaggcgcgcggaaagtcgcggacgcggttccagatgttgcgcagcggcaaa11460

aagtgctccatggtcgggacgctctggccggtcaggcgcgcgcaatcgttgacgctctag11520

accgtgcaaaaggagagcctgtaagcgggcactcttccgtggtctggtggataaattcgc11580

aagggtatcatggcggacgaccggggttcgagccccgtatccggccgtccgccgtgatcc11640

atgcggttaccgcccgcgtgtcgaacccaggtgtgcgacgtcagacaacgggggagtgct11700

ccttttggcttccttccaggcgcggcggctgctgcgctagcttttttggccactggccgc11760

gcgcagcgtaagcggttaggctggaaagcgaaagcattaagtggctcgctccctgtagcc11820

ggagggttattttccaagggttgagtcgcgggacccccggttcgagtctcggaccggccg11880

gactgcggcgaacgggggtttgcctccccgtcatgcaagaccccgcttgcaaattcctcc11940

ggaaacagggacgagccccttttttgcttttcccagatgcatccggtgctgcggcagatg12000

cgcccccctcctcagcagcggcaagagcaagagcagcggcagacatgcagggcaccctcc12060

cctcctcctaccgcgtcaggaggggcgacatccgcggttgacgcggcagcagatggtgat12120

tacgaacccccgcggcgccgggcccggcactacctggacttggaggagggcgagggcctg12180

gcgcggctaggagcgccctctcctgagcggcacccaagggtgcagctgaagcgtgatacg12240

cgtgaggcgtacgtgccgcggcagaacctgtttcgcgaccgcgagggagaggagcccgag12300

gagatgcgggatcgaaagttccacgcagggcgcgagctgcggcatggcctgaatcgcgag12360

cggttgctgcgcgaggaggactttgagcccgacgcgcgaaccgggattagtcccgcgcgc12420

gcacacgtggcggccgccgacctggtaaccgcatacgagcagacggtgaaccaggagatt12480

aactttcaaaaaagctttaacaaccacgtgcgtacgcttgtggcgcgcgaggaggtggct12540

ataggactgatgcatctgtgggactttgtaagcgcgctggagcaaaacccaaatagcaag12600

ccgctcatggcgcagctgttccttatagtgcagcacagcagggacaacgaggcattcagg12660

gatgcgctgctaaacatagtagagcccgagggccgctggctgctcgatttgataaacatc12720

ctgcagagcatagtggtgcaggagcgcagcttgagcctggctgacaaggtggccgccatc12780

aactattccatgcttagcctgggcaagttttacgcccgcaagatataccataccccttac12840

gttcccatagacaaggaggtaaagatcgaggggttctacatgcgcatggcgctgaaggtg12900

cttaccttgagcgacgacctgggcgtttatcgcaacgagcgcatccacaaggccgtgagc12960

gtgagccggcggcgcgagctcagcgaccgcgagctgatgcacagcctgcaaagggccctg13020

gctggcacgggcagcggcgatagagaggccgagtcctactttgacgcgggcgctgacctg13080

cgctgggccccaagccgacgcgccctggaggcagctggggccggacctgggctggcggtg13140

gcacccgcgcgcgctggcaacgtcggcggcgtggaggaatatgacgaggacgatgagtac13200

gagccagaggacggcgagtactaagcggtgatgtttctgatcagatgatgcaagacgcaa13260

cggacccggcggtgcgggcggcgctgcagagccagccgtccggccttaactccacggacg13320

actggcgccaggtcatggaccgcatcatgtcgctgactgcgcgcaatcctgacgcgttcc13380

ggcagcagccgcaggccaaccggctctccgcaattctggaagcggtggtcccggcgcgcg13440

caaaccccacgcacgagaaggtgctggcgatcgtaaacgcgctggccgaaaacagggcca13500

tccggcccgacgaggccggcctggtctacgacgcgctgcttcagcgcgtggctcgttaca13560

acagcggcaacgtgcagaccaacctggaccggctggtgggggatgtgcgcgaggccgtgg13620

cgcagcgtgagcgcgcgcagcagcagggcaacctgggctccatggttgcactaaacgcct13680

tcctgagtacacagcccgccaacgtgccgcggggacaggaggactacaccaactttgtga13740

gcgcactgcggctaatggtgactgagacaccgcaaagtgaggtgtaccagtctgggccag13800

actattttttccagaccagtagacaaggcctgcagaccgtaaacctgagccaggctttca13860

aaaacttgcaggggctgtggggggtgcgggctcccacaggcgaccgcgcgaccgtgtcta13920

gcttgctgacgcccaactcgcgcctgttgctgctgctaatagcgcccttcacggacagtg13980

gcagcgtgtcccgggacacatacctaggtcacttgctgacactgtaccgcgaggccatag14040

gtcaggcgcatgtggacgagcatactttccaggagattacaagtgtcagccgcgcgctgg14100

ggcaggaggacacgggcagcctggaggcaaccctaaactacctgctgaccaaccggcggc14160

agaagatcccctcgttgcacagtttaaacagcgaggaggagcgcattttgcgctacgtgc14220

agcagagcgtgagccttaacctgatgcgcgacggggtaacgcccagcgtggcgctggaca14280

tgaccgcgcgcaacatggaaccgggcatgtatgcctcaaaccggccgtttatcaaccgcc14340

taatggactacttgcatcgcgcggccgccgtgaaccccgagtatttcaccaatgccatct14400

tgaacccgcactggctaccgccccctggtttctacaccgggggattcgaggtgcccgagg14460

gtaacgatggattcctctgggacgacatagacgacagcgtgttttccccgcaaccgcaga14520

ccctgctagagttgcaacagcgcgagcaggcagaggcggcgctgcgaaaggaaagcttcc14580

gcaggccaagcagcttgtccgatctaggcgctgcggccccgcggtcagatgctagtagcc14640

catttccaagcttgatagggtctcttaccagcactcgcaccacccgcccgcgcctgctgg14700

gcgaggaggagtacctaaacaactcgctgctgcagccgcagcgcgaaaaaaacctgcctc14760

cggcatttcccaacaacgggatagagagcctagtggacaagatgagtagatggaagacgt14820

acgcgcaggagcacagggacgtgccaggcccgcgcccgcccacccgtcgtcaaaggcacg14880

accgtcagcggggtctggtgtgggaggacgatgactcggcagacgacagcagcgtcctgg14940

atttgggagggagtggcaacccgtttgcgcaccttcgccccaggctggggagaatgtttt15000

aaaaaaaaaaaaaaagcatgatgcaaaataaaaaactcaccaaggccatggcaccgagcg15060

ttggttttcttgtattccccttagtatgcggcgcgcggcgatgtatgaggaaggtcctcc15120

tccctcctacgagagtgtggtgagcgcggcgccagtggcggcggcgctgggttctccctt15180

cgatgctcccctggacccgccgtttgtgcctccgcggtacctgcggcctaccggggggag15240

aaacagcatccgttactctgagttggcacccctattcgacaccacccgtgtgtacctggt15300

ggacaacaagtcaacggatgtggcatccctgaactaccagaacgaccacagcaactttct15360

gaccacggtcattcaaaacaatgactacagcccgggggaggcaagcacacagaccatcaa15420

tcttgacgaccggtcgcactggggcggcgacctgaaaaccatcctgcataccaacatgcc15480

aaatgtgaacgagttcatgtttaccaataagtttaaggcgcgggtgatggtgtcgcgctt15540

gcctactaaggacaatcaggtggagctgaaatacgagtgggtggagttcacgctgcccga15600

gggcaactactccgagaccatgaccatagaccttatgaacaacgcgatcgtggagcacta15660

cttgaaagtgggcagacagaacggggttctggaaagcgacatcggggtaaagtttgacac15720

ccgcaacttcagactggggtttgaccccgtcactggtcttgtcatgcctggggtatatac15780

aaacgaagccttccatccagacatcattttgctgccaggatgcggggtggacttcaccca15840

cagccgcctgagcaacttgttgggcatccgcaagcggcaacccttccaggagggctttag15900

gatcacctacgatgatctggagggtggtaacattcccgcactgttggatgtggacgccta15960

ccaggcgagcttgaaagatgacaccgaacagggcgggggtggcgcaggcggcagcaacag16020

cagtggcagcggcgcggaagagaactccaacgcggcagccgcggcaatgcagccggtgga16080

ggacatgaacgatcatgccattcgcggcgacacctttgccacacgggctgaggagaagcg16140

cgctgaggccgaagcagcggccgaagctgccgcccccgctgcgcaacccgaggtcgagaa16200

gcctcagaagaaaccggtgatcaaacccctgacagaggacagcaagaaacgcagttacaa16260

cctaataagcaatgacagcaccttcacccagtaccgcagctggtaccttgcatacaacta16320

cggcgaccctcagaccggaatccgctcatggaccctgctttgcactcctgacgtaacctg16380

cggctcggagcaggtctactggtcgttgccagacatgatgcaagaccccgtgaccttccg16440

ctccacgcgccagatcagcaactttccggtggtgggcgccgagctgttgcccgtgcactc16500

caagagcttctacaacgaccaggccgtctactcccaactcatccgccagtttacctctct16560

gacccacgtgttcaatcgctttcccgagaaccagattttggcgcgcccgccagcccccac16620

catcaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggacgctaccgctgcg16680

caacagcatcggaggagtccagcgagtgaccattactgacgccagacgccgcacctgccc16740

ctacgtttacaaggccctgggcatagtctcgccgcgcgtcctatcgagccgcactttttg16800

agcaagcatgtccatccttatatcgcccagcaataacacaggctggggcctgcgcttccc16860

aagcaagatgtttggcggggccaagaagcgctccgaccaacacccagtgcgcgtgcgcgg16920

gcactaccgcgcgccctggggcgcgcacaaacgcggccgcactgggcgcaccaccgtcga16980

tgacgccatcgacgcggtggtggaggaggcgcgcaactacacgcccacgccgccaccagt17040

gtccacagtggacgcggccattcagaccgtggtgcgcggagcccggcgctatgctaaaat17100

gaagagacggcggaggcgcgtagcacgtcgccaccgccgccgacccggcactgccgccca17160

acgcgcggcggcggccctgcttaaccgcgcacgtcgcaccggccgacgggcggccatgcg17220

ggccgctcgaaggctggccgcgggtattgtcactgtgccccccaggtccaggcgacgagc17280

ggccgccgcagcagccgcggccattagtgctatgactcagggtcgcaggggcaacgtgta17340

ttgggtgcgcgactcggttagcggcctgcgcgtgcccgtgcgcacccgccccccgcgcaa17400

ctagattgcaagaaaaaactacttagactcgtactgttgtatgtatccagcggcggcggc17460

gcgcaacgaagctatgtccaagcgcaaaatcaaagaagagatgctccaggtcatcgcgcc17520

ggagatctatggccccccgaagaaggaagagcaggattacaagccccgaaagctaaagcg17580

ggtcaaaaagaaaaagaaagatgatgatgatgaacttgacgacgaggtggaactgctgca17640

cgctaccgcgcccaggcgacgggtacagtggaaaggtcgacgcgtaaaacgtgttttgcg17700

acccggcaccaccgtagtctttacgcccggtgagcgctccacccgcacctacaagcgcgt17760

gtatgatgaggtgtacggcgacgaggacctgcttgagcaggccaacgagcgcctcgggga17820

gtttgcctacggaaagcggcataaggacatgctggcgttgccgctggacgagggcaaccc17880

aacacctagcctaaagcccgtaacactgcagcaggtgctgcccgcgcttgcaccgtccga17940

agaaaagcgcggcctaaagcgcgagtctggtgacttggcacccaccgtgcagctgatggt18000

acccaagcgccagcgactggaagatgtcttggaaaaaatgaccgtggaacctgggctgga18060

gcccgaggtccgcgtgcggccaatcaagcaggtggcgccgggactgggcgtgcagaccgt18120

ggacgttcagatacccactaccagtagcaccagtattgccaccgccacagagggcatgga18180

gacacaaacgtccccggttgcctcagcggtggcggatgccgcggtgcaggcggtcgctgc18240

ggccgcgtccaagacctctacggaggtgcaaacggacccgtggatgtttcgcgtttcagc18300

cccccggcgcccgcgccgttcgaggaagtacggcgccgccagcgcgctactgcccgaata18360

tgccctacatccttccattgcgcctacccccggctatcgtggctacacctaccgccccag18420

aagacgagcaactacccgacgccgaaccaccactggaacccgccgccgccgtcgccgtcg18480

ccagcccgtgctggccccgatttccgtgcgcagggtggctcgcgaaggaggcaggaccct18540

ggtgctgccaacagcgcgctaccaccccagcatcgtttaaaagccggtctttgtggttct18600

tgcagatatggccctcacctgccgcctccgtttcccggtgccgggattccgaggaagaat18660

gcaccgtaggaggggcatggccggccacggcctgacgggcggcatgcgtcgtgcgcacca18720

ccggcggcggcgcgcgtcgcaccgtcgcatgcgcggcggtatcctgcccctccttattcc18780

actgatcgccgcggcgattggcgccgtgcccggaattgcatccgtggccttgcaggcgca18840

gagacactgattaaaaacaagttgcatgtggaaaaatcaaaataaaaagtctggactctc18900

acgctcgcttggtcctgtaactattttgtagaatggaagacatcaactttgcgtctctgg18960

ccccgcgacacggctcgcgcccgttcatgggaaactggcaagatatcggcaccagcaata19020

tgagcggtggcgccttcagctggggctcgctgtggagcggcattaaaaatttcggttcca19080

ccgttaagaactatggcagcaaggcctggaacagcagcacaggccagatgctgagggata19140

agttgaaagagcaaaatttccaacaaaaggtggtagatggcctggcctctggcattagcg19200

gggtggtggacctggccaaccaggcagtgcaaaataagattaacagtaagcttgatcccc19260

gccctcccgtagaggagcctccaccggccgtggagacagtgtctccagaggggcgtggcg19320

aaaagcgtccgcgccccgacagggaagaaactctggtgacgcaaatagacgagcctccct19380

cgtacgaggaggcactaaagcaaggcctgcccaccacccgtcccatcgcgcccatggcta19440

ccggagtgctgggccagcacacacccgtaacgctggacctgcctccccccgccgacaccc19500

agcagaaacctgtgctgccaggcccgaccgccgttgttgtaacccgtcctagccgcgcgt19560

ccctgcgccgcgccgccagcggtccgcgatcgttgcggcccgtagccagtggcaactggc19620

aaagcacactgaacagcatcgtgggtctgggggtgcaatccctgaagcgccgacgatgct19680

tctgaatagctaacgtgtcgtatgtgtgtcatgtatgcgtccatgtcgccgccagaggag19740

ctgctgagccgccgcgcgcccgctttccaagatggctaccccttcgatgatgccgcagtg19800

gtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctggtgca19860

gtttgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggt19920

ggcgcctacgcacgacgtgaccacagaccggtcccagcgtttgacgctgcggttcatccc19980

tgtggaccgtgaggatactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtga20040

taaccgtgtgctggacatggcttccacgtactttgacatccgcggcgtgctggacagggg20100

ccctacttttaagccctactctggcactgcctacaacgccctggctcccaagggtgcccc20160

aaatccttgcgaatgggatgaagctgctactgctcttgaaataaacctagaagaagagga20220

cgatgacaacgaagacgaagtagacgagcaagctgagcagcaaaaaactcacgtatttgg20280

gcaggcgccttattctggtataaatattacaaaggagggtattcaaataggtgtcgaagg20340

tcaaacacctaaatatgccgataaaacatttcaacctgaacctcaaataggagaatctca20400

gtggtacgaaactgaaattaatcatgcagctgggagagtccttaaaaagactaccccaat20460

gaaaccatgttacggttcatatgcaaaacccacaaatgaaaatggagggcaaggcattct20520

tgtaaagcaacaaaatggaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactac20580

tgaggcgaccgcaggcaatggtgataacttgactcctaaagtggtattgtacagtgaaga20640

tgtagatatagaaaccccagacactcatatttcttacatgcccactattaaggaaggtaa20700

ctcacgagaactaatgggccaacaatctatgcccaacaggcctaattacattgcttttag20760

ggacaattttattggtctaatgtattacaacagcacgggtaatatgggtgttctggcggg20820

ccaagcatcgcagttgaatgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctttcata20880

ccagcttttgcttgattccattggtgatagaaccaggtacttttctatgtggaatcaggc20940

tgttgacagctatgatccagatgttagaattattgaaaatcatggaactgaagatgaact21000

tccaaattactgctttccactgggaggtgtgattaatacagagactcttaccaaggtaaa21060

acctaaaacaggtcaggaaaatggatgggaaaaagatgctacagaattttcagataaaaa21120

tcaaataagagttggaaataattttgccatggaaatcaatctaaatgccaacctgtggag21180

aaatttcctgtactccaacatagcgctgtatttgcccgacaagctaaagtacagtccttc21240

caacgtaaaaatttctgataacccaaacacctacgactacatgaacaagcgagtggtggc21300

tcccgggttagtggactgctacattaaccttggagcacgctggtcccttgactatatgga21360

caacgtcaacccatttaaccaccaccgcaatgctggcctgcgctaccgctcaatgttgct21420

gggcaatggtcgctatgtgcccttccacatccaggtgcctcagaagttctttgccattaa21480

aaacctccttctcctgccgggctcatacacctacgagtggaacttcaggaaggatgttaa21540

catggttctgcagagctccctaggaaatgacctaagggttgacggagccagcattaagtt21600

tgatagcatttgcctttacgccaccttcttccccatggcccacaacaccgcctccacgct21660

tgaggccatgcttagaaacgacaccaacgaccagtcctttaacgactatctctccgccgc21720

caacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccg21780

caactgggcggctttccgcggctgggccttcacgcgccttaagactaaggaaaccccatc21840

actgggctcgggctacgacccttattacacctactctggctctataccctacctagatgg21900

aaccttttacctcaaccacacctttaagaaggtggccattacctttgactcttctgtcag21960

ctggcctggcaatgaccgcctgcttacccccaacgagtttgaaattaagcgctcagttga22020

cggggagggttacaacgttgcccagtgtaacatgaccaaagactggttcctggtacaaat22080

gctagctaactacaacattggctaccagggcttctatatcccagagagctacaaggaccg22140

catgtactccttctttagaaacttccagcccatgagccgtcaggtggtggatgatactaa22200

atacaaggactaccaacaggtgggcatcctacaccaacacaacaactctggatttgttgg22260

ctaccttgcccccaccatgcgcgaaggacaggcctaccctgctaacttcccctatccgct22320

tataggcaagaccgcagttgacagcattacccagaaaaagtttctttgcgatcgcaccct22380

ttggcgcatcccattctccagtaactttatgtccatgggcgcactcacagacctgggcca22440

aaaccttctctacgccaactccgcccacgcgctagacatgacttttgaggtggatcccat22500

ggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgtgtgcaccg22560

gccgcaccgcggcgtcatcgaaaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgc22620

cacaacataaagaagcaagcaacatcaacaacagctgccgccatgggctccagtgagcag22680

gaactgaaagccattgtcaaagatcttggttgtgggccatattttttgggcacctatgac22740

aagcgctttccaggctttgtttctccacacaagctcgcctgcgccatagtcaatacggcc22800

ggtcgcgagactgggggcgtacactggatggcctttgcctggaacccgcactcaaaaaca22860

tgctacctctttgagccctttggcttttctgaccagcgactcaagcaggtttaccagttt22920

gagtacgagtcactcctgcgccgtagcgccattgcttcttcccccgaccgctgtataacg22980

ctggaaaagtccacccaaagcgtacaggggcccaactcggccgcctgtggactattctgc23040

tgcatgtttctccacgcctttgccaactggccccaaactcccatggatcacaaccccacc23100

atgaaccttattaccggggtacccaactccatgctcaacagtccccaggtacagcccacc23160

ctgcgtcgcaaccaggaacagctctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgc23220

agccacagtgcgcagattaggagcgccacttctttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaa23280

taatgtactagagacactttcaataaaggcaaatgcttttatttgtacactctcgggtga23340

ttatttacccccacccttgccgtctgcgccgtttaaaaatcaaaggggttctgccgcgca23400

tcgctatgcgccactggcagggacacgttgcgatactggtgtttagtgctccacttaaac23460

tcaggcacaaccatccgcggcagctcggtgaagttttcactccacaggctgcgcaccatc23520

accaacgcgtttagcaggtcgggcgccgatatcttgaagtcgcagttggggcctccgccc23580

tgcgcgcgcgagttgcgatacacagggttgcagcactggaacactatcagcgccgggtgg23640

tgcacgctggccagcacgctcttgtcggagatcagatccgcgtccaggtcctccgcgttg23700

ctcagggcgaacggagtcaactttggtagctgccttcccaaaaagggcgcgtgcccaggc23760

tttgagttgcactcgcaccgtagtggcatcaaaaggtgaccgtgcccggtctgggcgtta23820

ggatacagcgcctgcataaaagccttgatctgcttaaaagccacctgagcctttgcgcct23880

tcagagaagaacatgccgcaagacttgccggaaaactgattggccggacaggccgcgtcg23940

tgcacgcagcaccttgcgtcggtgttggagatctgcaccacatttcggccccaccggttc24000

ttcacgatcttggccttgctagactgctccttcagcgcgcgctgcccgttttcgctcgtc24060

acatccatttcaatcacgtgctccttatttatcataatgcttccgtgtagacacttaagc24120

tcgccttcgatctcagcgcagcggtgcagccacaacgcgcagcccgtgggctcgtgatgc24180

ttgtaggtcacctctgcaaacgactgcaggtacgcctgcaggaatcgccccatcatcgtc24240

acaaaggtcttgttgctggtgaaggtcagctgcaacccgcggtgctcctcgttcagccag24300

gtcttgcatacggccgccagagcttccacttggtcaggcagtagtttgaagttcgccttt24360

agatcgttatccacgtggtacttgtccatcagcgcgcgcgcagcctccatgcccttctcc24420

cacgcagacacgatcggcacactcagcgggttcatcaccgtaatttcactttccgcttcg24480

ctgggctcttcctcttcctcttgcgtccgcataccacgcgccactgggtcgtcttcattc24540

agccgccgcactgtgcgcttacctcctttgccatgcttgattagcaccggtgggttgctg24600

aaacccaccatttgtagcgccacatcttctctttcttcctcgctgtccacgattacctct24660

ggtgatggcgggcgctcgggcttgggagaagggcgcttctttttcttcttgggcgcaatg24720

gccaaatccgccgccgaggtcgatggccgcgggctgggtgtgcgcggcaccagcgcgtct24780

tgtgatgagtcttcctcgtcctcggactcgatacgccgcctcatccgcttttttgggggc24840

gcccggggaggcggcggcgacggggacggggacgacacgtcctccatggttgggggacgt24900

cgcgccgcaccgcgtccgcgctcgggggtggtttcgcgctgctcctcttcccgactggcc24960

atttccttctcctataggcagaaaaagatcatggagtcagtcgagaagaaggacagccta25020

accgccccctctgagttcgccaccaccgcctccaccgatgccgccaacgcgcctaccacc25080

ttccccgtcgaggcacccccgcttgaggaggaggaagtgattatcgagcaggacccaggt25140

tttgtaagcgaagacgacgaggaccgctcagtaccaacagaggataaaaagcaagaccag25200

gacaacgcagaggcaaacgaggaacaagtcgggcggggggacgaaaggcatggcgactac25260

ctagatgtgggagacgacgtgctgttgaagcatctgcagcgccagtgcgccattatctgc25320

gacgcgttgcaagagcgcagcgatgtgcccctcgccatagcggatgtcagccttgcctac25380

gaacgccacctattctcaccgcgcgtaccccccaaacgccaagaaaacggcacatgcgag25440

cccaacccgcgcctcaacttctaccccgtatttgccgtgccagaggtgcttgccacctat25500

cacatctttttccaaaactgcaagatacccctatcctgccgtgccaaccgcagccgagcg25560

gacaagcagctggccttgcggcagggcgctgtcatacctgatatcgcctcgctcaacgaa25620

gtgccaaaaatctttgagggtcttggacgcgacgagaagcgcgcggcaaacgctctgcaa25680

caggaaaacagcgaaaatgaaagtcactctggagtgttggtggaactcgagggtgacaac25740

gcgcgcctagccgtactaaaacgcagcatcgaggtcacccactttgcctacccggcactt25800

aacctaccccccaaggtcatgagcacagtcatgagtgagctgatcgtgcgccgtgcgcag25860

cccctggagagggatgcaaatttgcaagaacaaacagaggagggcctacccgcagttggc25920

gacgagcagctagcgcgctggcttcaaacgcgcgagcctgccgacttggaggagcgacgc25980

aaactaatgatggccgcagtgctcgttaccgtggagcttgagtgcatgcagcggttcttt26040

gctgacccggagatgcagcgcaagctagaggaaacattgcactacacctttcgacagggc26100

tacgtacgccaggcctgcaagatctccaacgtggagctctgcaacctggtctcctacctt26160

ggaattttgcacgaaaaccgccttgggcaaaacgtgcttcattccacgctcaagggcgag26220

gcgcgccgcgactacgtccgcgactgcgtttacttatttctatgctacacctggcagacg26280

gccatgggcgtttggcagcagtgcttggaggagtgcaacctcaaggagctgcagaaactg26340

ctaaagcaaaacttgaaggacctatggacggccttcaacgagcgctccgtggccgcgcac26400

ctggcggacatcattttccccgaacgcctgcttaaaaccctgcaacagggtctgccagac26460

ttcaccagtcaaagcatgttgcagaactttaggaactttatcctagagcgctcaggaatc26520

ttgcccgccacctgctgtgcacttcctagcgactttgtgcccattaagtaccgcgaatgc26580

cctccgccgctttggggccactgctaccttctgcagctagccaactaccttgcctaccac26640

tctgacataatggaagacgtgagcggtgacggtctactggagtgtcactgtcgctgcaac26700

ctatgcaccccgcaccgctccctggtttgcaattcgcagctgcttaacgaaagtcaaatt26760

atcggtacctttgagctgcagggtccctcgcctgacgaaaagtccgcggctccggggttg26820

aaactcactccggggctgtggacgtcggcttaccttcgcaaatttgtacctgaggactac26880

cacgcccacgagattaggttctacgaagaccaatcccgcccgccaaatgcggagcttacc26940

gcctgcgtcattacccagggccacattcttggccaattgcaagccatcaacaaagcccgc27000

caagagtttctgctacgaaagggacggggggtttacttggacccccagtccggcgaggag27060

ctcaacccaatccccccgccgccgcagccctatcagcagcagccgcgggcccttgcttcc27120

caggatggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaata27180

ctgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactg27240

ggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcacc27300

ctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctac27360

aacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatggga27420

caccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaaca27480

acagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgca27540

agactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggc27600

cttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcgg27660

cagcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatagcaaga27720

ctctgacaaagcccaagaaatccacagcggcggcagcagcaggaggaggagcgctgcgtc27780

tggcgcccaacgaacccgtatcgacccgcgagcttagaaacaggatttttcccactctgt27840

atgctatatttcaacagagcaggggccaagaacaagagctgaaaataaaaaacaggtctc27900

tgcgatccctcacccgcagctgcctgtatcacaaaagcgaagatcagcttcggcgcacgc27960

tggaagacgcggaggctctcttcagtaaatactgcgcgctgactcttaaggactagtttc28020

gcgccctttctcaaatttaagcgcgaaaactacgtcatctccagcggccacacccggcgc28080

cagcacctgtcgtcagcgccatttcaactttgtatacaaaagttgtgatgagcaaggaaa28140

ttcccacgccctacatgtggagttaccagccacaaatgggacttgcggctggagctgccc28200

aagactactcaacccgaataaactacatgagcgcgggaccccacatgatatcccgggtca28260

acggaatacgcgcccaccgaaaccgaattctcctggaacaggcggctattaccaccacac28320

ctcgtaataaccttaatccccgtagttggcccgctgccctggtgtaccaggaaagtcccg28380

ctcccaccactgtggtacttcccagagacgcccaggccgaagttcagatgactaactcag28440

gggcgcagcttgcgggcggctttcgtcacagggtgcggtcgcccgggcagggtataactc28500

acctgacaatcagagggcgaggtattcagctcaacgacgagtcggtgagctcctcgcttg28560

gtctccgtccggacgggacatttcagatcggcggcgccggccgctcttcattcacgcctc28620

gtcaggcaatcctaactctgcagacctcgtcctctgagccgcgctctggaggcattggaa28680

ctctgcaatttattgaggagtttgtgccatcggtctactttaaccccttctcgggacctc28740

ccggccactatccggatcaatttattcctaactttgacgcggtaaaggactcggcggacg28800

gctacgactgaatgttaagtggagaggcagagcaactgcgcctgaaacacctggtccact28860

gtcgccgccacaagtgctttgcccgcgactccggtgagttttgctactttgaattgcccg28920

aggatcatatcgagggcccggcgcacggcgtccggcttaccgcccagggagagcttgccc28980

gtagcctgattcgggagtttacccagcgccccctgctagttgagcgggacaggggaccct29040

gtgttctcactgtgatttgcaactgtcctaaccctggattacatcaagatctttgttgcc29100

atctctgtgctgagtataataaatacagaaattaaaatatactggggctcctatcgccat29160

cctgtaaacgccaccgtcttcacccgcccaagcaaaccaaggcgaaccttacctggtact29220

tttaacatctctccctctgtgatttacaacagtttcaacccagacggagtgagtctacga29280

gagaacctctccgagctcagctactccatcagaaaaaacaccaccctccttacctgccgg29340

gaacgtacgagtgcgtcaccggccgctgcaccacacctaccgcctgaccgtaaaccagac29400

tttttccggacagacctcaataactctgtttaccagaacaggaggtgagcttagaaaacc29460

cttagggtattaggccaaaggcgcagctactgtggggtttatgaacaattcaagcaactc29520

tacgggctattctaattcaggtttctctagaatcggggttggggttattctctgtcttgt29580

gattctctttattcttatactaacgcttctctgcctaaggctcgccgcctgctgtgtgca29640

catttgcatttattgtcagctttttaaacgctggggtcgccacccaagatgattaggtac29700

ataatcctaggtttactcacccttgcgtcagcccacggtaccacccaaaaggtggatttt29760

aaggagccagcctgtaatgttacattcgcagctgaagctaatgagtgcaccactcttata29820

aaatgcaccacagaacatgaaaagctgcttattcgccacaaaaacaaaattggcaagtat29880

gctgtttatgctatttggcagccaggtgacactacagagtataatgttacagttttccag29940

ggtaaaagtcataaaacttttatgtatacttttccattttatgaaatgtgcgacattacc30000

atgtacatgagcaaacagtataagttgtggcccccacaaaattgtgtggaaaacactggc30060

actttctgctgcactgctatgctaattacagtgctcgctttggtctgtaccctactctat30120

attaaatacaaaagcagacgcagctttattgaggaaaagaaaatgccttaatttactaag30180

ttacaaagctaatgtcaccactaactgctttactcgctgcttgcaaaacaaattcaaaaa30240

gttagcattataattagaataggatttaaaccccccggtcatttcctgctcaataccatt30300

cccctgaacaattgactctatgtgggatatgctccagcgctacaaccttgaagtcaggct30360

tcctggatgtcagcatctgactttggccagcacctgtcccgcggatttgttccagtccaa30420

ctacagcgacccaccctaacagagatgaccaacacaaccaacgcggccgccgctaccgga30480

cttacatctaccacaaatacaccccaagtttctgcctttgtcaataactgggataacttg30540

ggcatgtggtggttctccatagcgcttatgtttgtatgccttattattatgtggctcatc30600

tgctgcctaaagcgcaaacgcgcccgaccacccatctatagtcccatcattgtgctacac30660

ccaaacaatgatggaatccatagattggacggactgaaacacatgttcttttctcttaca30720

gtatgattaaatgagacatgattcctcgagtttttatattactgacccttgttgcgcttt30780

tttgtgcgtgctccacattggctgcggtttctcacatcgaagtagactgcattccagcct30840

tcacagtctatttgctttacggatttgtcaccctcacgctcatctgcagcctcatcactg30900

tggtcatcgcctttatccagtgcattgactgggtctgtgtgcgctttgcatatctcagac30960

accatccccagtacagggacaggactatagctgagcttcttagaattctttaattatgaa31020

atttactgtgacttttctgctgattatttgcaccctatctgcgttttgttccccgacctc31080

caagcctcaaagacatatatcatgcagattcactcgtatatggaatattccaagttgcta31140

caatgaaaaaagcgatctttccgaagcctggttatatgcaatcatctctgttatggtgtt31200

ctgcagtaccatcttagccctagctatatatccctaccttgacattggctggaacgcaat31260

agatgccatgaaccacccaactttccccgcgcccgctatgcttccactgcaacaagttgt31320

tgccggcggctttgtcccagccaatcagcctcgcccaccttctcccacccccactgaaat31380

cagctactttaatctaacaggaggagatgactgacaccctagatctagaaatggacggaa31440

ttattacagagcagcgcctgctagaaagacgcagggcagcggccgagcaacagcgcatga31500

atcaagagctccaagacatggttaacttgcaccagtgcaaaaggggtatcttttgtctgg31560

taaagcaggccaaagtcacctacgacagtaataccaccggacaccgccttagctacaagt31620

tgccaaccaagcgtcagaaattggtggtcatggtgggagaaaagcccattaccataactc31680

agcactcggtagaaaccgaaggctgcattcactcaccttgtcaaggacctgaggatctct31740

gcacccttattaagaccctgtgcggtctcaaagatcttattccctttaactaataaaaaa31800

aaataataaagcatcacttacttaaaatcagttagcaaatttctgtccagtttattcagc31860

agcacctccttgccctcctcccagctctggtattgcagcttcctcctggctgcaaacttt31920

ctccacaatctaaatggaatgtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactatc31980

ttcatgttgttgcagatgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtat32040

ccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcc32100

cccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctcta32160

gttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggcc32220

ggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtca32280

aacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggct32340

gccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacactcaccatgcaatcacaggccccgcta32400

accgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaagga32460

aagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatc32520

actgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagccc32580

atttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagac32640

gacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttg32700

caaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgta32760

gcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccg32820

tttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactca32880

gcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaat32940

tccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagcc33000

atagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaat33060

cccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcct33120

aaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaat33180

aatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgca33240

gagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctaca33300

gtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgct33360

catcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggaccca33420

gaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgtt33480

ggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaac33540

attgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattaca33600

ctaaacggtacacaggaaacaggagacacaactccaagtgcatactctatgtcattttca33660

tgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacatcctcttacactttt33720

tcatacattgcccaagaataaagaatcgtttgtgttatgtttcaacgtgtttatttttca33780

attgcagaaaatttcaagtcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatagctt33840

atacagatcaccgtacctcaactttgtataataaagttgtaatcaaactcacagaaccct33900

agtattcaacctgccacctccctcccaacacacagagtacacagtcctttctccccggct33960

ggccttaaaaagcatcatatcatgggtaacagacatattcttaggtgttatattccacac34020

ggtttcctgtcgagccaaacgctcatcagtgatattaataaactccccgggcagctcact34080

taagttcatgtcgctgtccagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgctt34140

aacgggcggcgaaggagaagtccacgcctacatgggggtagagtcataatcgtgcatcag34200

gatagggcggtggtgctgcagcagcgcgcgaataaactgctgccgccgccgctccgtcct34260

gcaggaatacaacatggcagtggtctcctcagcgatgattcgcaccgcccgcagcataag34320

gcgccttgtcctccgggcacagcagcgcaccctgatctcacttaaatcagcacagtaact34380

gcagcacagcaccacaatattgttcaaaatcccacagtgcaaggcgctgtatccaaagct34440

catggcggggaccacagaacccacgtggccatcataccacaagcgcaggtagattaagtg34500

gcgacccctcataaacacgctggacataaacattacctcttttggcatgttgtaattcac34560

cacctcccggtaccatataaacctctgattaaacatggcgccatccaccaccatcctaaa34620

ccagctggccaaaacctgcccgccggctatacactgcagggaaccgggactggaacaatg34680

acagtggagagcccaggactcgtaaccatggatcatcatgctcgtcatgatatcaatgtt34740

ggcacaacacaggcacacgtgcatacacttcctcaggattacaagctcctcccgcgttag34800

aaccatatcccagggaacaacccattcctgaatcagcgtaaatcccacactgcagggaag34860

acctcgcacgtaactcacgttgtgcattgtcaaagtgttacattcgggcagcagcggatg34920

atcctccagtatggtagcgcgggtttctgtctcaaaaggaggtagacgatccctactgta34980

cggagtgcgccgagacaaccgagatcgtgttggtcgtagtgtcatgccaaatggaacgcc35040

ggacgtagtcatatttcctgaagcaaaaccaggtgcgggcgtgacaaacagatctgcgtc35100

tccggtctcgccgcttagatcgctctgtgtagtagttgtagtatatccactctctcaaag35160

catccaggcgccccctggcttcgggttctatgtaaactccttcatgcgccgctgccctga35220

taacatccaccaccgcagaataagccacacccagccaacctacacattcgttctgcgagt35280

cacacacgggaggagcgggaagagctggaagaaccatgtttttttttttattccaaaaga35340

ttatccaaaacctcaaaatgaagatctattaagtgaacgcgctcccctccggtggcgtgg35400

tcaaactctacagccaaagaacagataatggcatttgtaagatgttgcacaatggcttcc35460

aaaaggcaaacggccctcacgtccaagtggacgtaaaggctaaacccttcagggtgaatc35520

tcctctataaacattccagcaccttcaaccatgcccaaataattctcatctcgccacctt35580

ctcaatatatctctaagcaaatcccgaatattaagtccggccattgtaaaaatctgctcc35640

agagcgccctccaccttcagcctcaagcagcgaatcatgattgcaaaaattcaggttcct35700

cacagacctgtataagattcaaaagcggaacattaacaaaaataccgcgatcccgtaggt35760

cccttcgcagggccagctgaacataatcgtgcaggtctgcacggaccagcgcggccactt35820

ccccgccaggaaccatgacaaaagaacccacactgattatgacacgcatactcggagcta35880

tgctaaccagcgtagccccgatgtaagcttgttgcatgggcggcgatataaaatgcaagg35940

tgctgctcaaaaaatcaggcaaagcctcgcgcaaaaaagaaagcacatcgtagtcatgct36000

catgcagataaaggcaggtaagctccggaaccaccacagaaaaagacaccatttttctct36060

caaacatgtctgcgggtttctgcataaacacaaaataaaataacaaaaaaacatttaaac36120

attagaagcctgtcttacaacaggaaaaacaacccttataagcataagacggactacggc36180

catgccggcgtgaccgtaaaaaaactggtcaccgtgattaaaaagcaccaccgacagctc36240

ctcggtcatgtccggagtcataatgtaagactcggtaaacacatcaggttgattcacatc36300

ggtcagtgctaaaaagcgaccgaaatagcccgggggaatacatacccgcaggcgtagaga36360

caacattacagcccccataggaggtataacaaaattaataggagagaaaaacacataaac36420

acctgaaaaaccctcctgcctaggcaaaatagcaccctcccgctccagaacaacatacag36480

cgcttccacagcggcagccataacagtcagccttaccagtaaaaaagaaaacctattaaa36540

aaaacaccactcgacacggcaccagctcaatcagtcacagtgtaaaaaagggccaagtgc36600

agagcgagtatatataggactaaaaaatgacgtaacggttaaagtccacaaaaaacaccc36660

agaaaaccgcacgcgaacctacgcccagaaacgaaagccaaaaaacccacaacttcctca36720

aatcgtcacttccgttttcccacgttacgtcacttcccattttaagaaaactacaattcc36780

caacacatacaagttactccgccctaaaacctacgtcacccgccccgttcccacgccccg36840

cgccacgtcacaaactccaccccctcattatcatattggcttcaatccaaaataaggtat36900

attattgatgatg36913

<210>2

<211>36943

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成腺病毒基因组(adsyn-co176)

<400>2