基于TIM蛋白和IgG蛋白的融合蛋白的防治变应性疾病的药物及其制备方法与流程

文档序号：17456231发布日期：2019-04-20 03:20阅读：551来源：国知局

本发明属基因工程技术、基因功能应用及生物制药领域，具体涉及一种基于TIM蛋白和IgG蛋白的融合蛋白的防治变应性疾病的药物及其制备方法。

背景技术：

变应性疾病(atopic diseases)包括哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、药物过敏等，是一组有遗传易感性的个体在环境因素作用下引起的疾病。变应性疾病的流行趋势正在逐年增加。

支气管哮喘(简称哮喘)是常见的变应性疾病之一，是成人和儿童常见的慢性呼吸系统疾病，是全球关注的公共卫生问题。全世界有超过3亿人罹患哮喘，每年大约有25万人死于哮喘，其发病率在发达国家可达人群33％，随着工业化和城市化的进程，哮喘等过敏性疾病的发病率呈明显增加趋势。哮喘的病因和发病机制比较复杂，诸多环节尚未完全清楚。因此进一步探讨哮喘的发病机制、寻找新的防治靶点仍然是哮喘研究的重要内容。

随着研究的不断深入，哮喘发病机制的假说也不断增多，目前普遍认为哮喘的发生发展与气道慢性炎症、气道高反应性(AHR)、遗传机制、免疫反应、气道神经调节失调、神经信号传导机制及其相互作用有关，其中经典的免疫调节机制占据重要位置。经典免疫学说认为哮喘的发病机制与辅助性T细胞(T helper cells，Th cells)亚群功能失衡密切相关，主要表现为Th2细胞功能亢进，分泌Th2细胞因子如IL-4,IL-5,IL-13等可以诱导IgE产生并刺激嗜酸性粒细胞(EOS)增殖、活化脱颗粒，进而分泌多种促炎介质引起气道慢性炎症。研究表明在支气管哮喘免疫反应中，存在着Thl/Th2细胞的比例失衡，即Th2应答占主导的免疫过程是哮喘疾病发生发展的一个主要因素。所以调节两者之间的平衡，对减轻气道炎症、治疗哮喘进程起到重要作用。

但是在近来研究证实针对Th2型细胞因子采取的治疗措施并不能完全有效减轻哮喘的气道炎症，因此不能将哮喘的发病简单归于Th1/Th2功能失衡。并且除Thl/Th2细胞，研究发现Treg和Th17细胞之间的相互作用也参与调节自身免疫和过敏反应。Treg细胞在诱导免疫耐受和控制Th2细胞介导的炎症反应过程中起重要作用。当机体内Treg细胞分化和功能受损时，可增加个体对过敏性疾病的易感性，以及加重气道炎症的严重程度。Treg细胞可抑制一些参与哮喘的炎性细胞如Th2和Th17细胞，EOS和肥大细胞，从而抑制气道炎症的发生和AHR。Treg细胞还可减轻过敏原诱发的气道炎症。当Treg细胞数量显著减少时，过敏患者体内的免疫抑制功能将明显受损；脱敏治疗过敏患者可刺激Treg细胞，增强它的抑制功能，从而可获得长期的免疫耐受和抗过敏保护。与此相反，Th17细胞诱发过敏性气道炎症，包括重度支气管哮喘中的嗜中性粒细胞炎症反应AHR。正常体内，Th17的促炎症作用与Treg的抗炎作用形成平衡，维持机体稳态。而哮喘中Treg/Th17失衡，Th17活化，而Treg抑制是哮喘发生的重要机制，因此，Th17/Treg细胞平衡可介导哮喘的免疫反应，特别是过敏性表型。

共刺激分子及共刺激通路的研究一直是免疫学领域研究的热点。研究表明共刺激分子及共刺激通路通过调控T细胞的活化、Th1/Th2间的平衡及相应的细胞效应因子的产生，在哮喘中诱导免疫耐受和调控气道炎症中起重要作用。最新研究表明共刺激分子及共刺激通路参与对Th17与Treg细胞免疫调控[18-20]。这些对哮喘的治疗提供新途径。

采用定位克隆的方法在哮喘小鼠鉴定了一个新基因家族－T细胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM)基因家族，参与T细胞活化和分化调节，在免疫应答和免疫耐受中起重要作用。人类由3个成员组成(TIM-1、TIM-3和TIM-4)，位于人类染色体5q33.2上。TIM-1优先的表达于人和小鼠的Th2细胞表面，是哮喘、变应性过敏等Th2细胞介导的相关性疾病的一个重要易感基因，作为T细胞活化的共刺激分子，调节Th2细胞免疫应答。最新研究表明Tim-1信号与树突状细胞(DC)交联发生信号传递，会上调共刺激分子的表达、促炎症细胞因子的产生，促进效应T细胞的应答，而抑制Foxp3+Treg细胞的应答；小鼠Tim-1信号与T细胞交联发生信号传递，仅调节Th2细胞的应答；在体内采用高亲和力anti-Tim-1作为佐剂，会减弱Treg细胞免疫抑制功能，增强Th17促炎症反应。研究表明小鼠Tim-1信号传递可以提共刺激信号(Tim-1-Tim-4间相互作用可能足够刺激T细胞)，与传统信号1一起活化T细胞。

目前哮喘的基本治疗主要包括抗炎、对症和免疫治疗。哮喘的治疗目前主要采取吸入激素治疗，但吸入激素不能治愈哮喘，只能控制哮喘。世界卫生组织(WHO)及欧洲变态反应与临床免疫学会(EAACI)推荐的变应原特异性免疫治疗(SIT)是目前唯一针对病因有效的预防治疗，可以引起局部和全身不良反应，其疗效及安全性一直存在争论。因此，本领域亟需开发一种可有效治疗变应性疾病的新药。

技术实现要素：

基于本领域的上述需求，本发明的目的在于提供一种重组人TIM-1-Fc融合蛋白及其制备方法和用途。

本发明的技术方案如下：

用于防治变应性疾病的药物，其活性成分包括：包含了TIM家族蛋白序列与IgG家族蛋白序列的融合蛋白；和/或，

可表达所述融合蛋白的表达载体；和/或，

包含所述表达载体的转化体。

所述TIM家族蛋白序列为TIM家族蛋白胞外域序列；所述IgG蛋白序列为IgG蛋白Fc片段序列；

所述包含所述表达载体的转化体指可分泌所述融合蛋白的细胞株。

所述用于治疗变应性疾病的药物的活性成分选自由下述物质组成的组：连接了TIM-1蛋白胞外域序列和IgG1蛋白Fc片段序列的TIM-1-IgG Fc融合蛋白；

可表达所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白的表达载体；

包含所述表达载体的转化体。

所述TIM-1蛋白胞外域序列为TIM-1-IgG Fc融合蛋白的N端；所述IgG1蛋白Fc片段序列为TIM-1-IgGFc融合蛋白的C端；

所述TIM-1蛋白胞外域序列指TIM-1蛋白胞外域序列；

所述包含所述表达载体的转化体指：可分泌所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白的细胞株。

所述TIM-1蛋白胞外域序列选自：SEQ ID NO：1的氨基酸序列；或，SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

所述IgG1蛋白Fc片段序列选自：SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或，SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白为SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者，SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；

所述表达载体为原核表达载体，和或，真核表达载体，优选为pcDNA3.1(+)；所述可表达所述TIM-1-IgGFc融合蛋白的表达载体为连接有所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白对应的核苷酸序列的TIM-1-IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒；

所述的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞，所述宿主细胞转染TIM-1-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体；所述的宿主细胞优选为CHO细胞；所述包含所述表达载体的转化体优选为所述的CHO-TIM-1-Fc细胞株。

TIM家族蛋白和IgG蛋白在制备用于防治变应性疾病的药物方面的用途。

所述用途包括如下步骤：采用分子生物学的方法将TIM家族蛋白和IgG蛋白连接融合，制备得到包含TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列的融合蛋白；和/或，可表达所述融合蛋白的表达载体；和/或，包含所述表达载体的转化体。

所述连接指：所述TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列之间直接连接和/或通过接头连接；

优选地，所述连接为所述TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列之间直接连接；

更进一步地，所述TIM家族蛋白序列为TIM家族蛋白胞外域序列；优选地，所述TIM家族蛋白胞外域序列指TIM-1蛋白胞外域序列；更优选地，所述TIM-1蛋白为人源TIM-1蛋白；

所述接头选自：Glu Arg Pro Ser Phe Val，和/或，GlyGlyGlyGlySer；

所述IgG蛋白序列为IgG蛋白Fc片段序列；优选地，所述IgG蛋白Fc片段序列指IgG1蛋白Fc片段序列；更优选地，所述IgG1蛋白为人源IgG1蛋白；

进一步地，所述包含所述表达载体的转化体指：可分泌所述融合蛋白的细胞株；优选地，所述可分泌所述融合蛋白的细胞株指CHO-TIM-1-Fc细胞株。

如无特殊说明，本文使用的各类术语，例如“表达载体”、“转化体”、“细胞株”、“连接”、“融合蛋白”、“蛋白序列”、“片段”、“氨基酸序列”、“核苷酸序列”、“接头”等，都具备分子生物学领域各工具书和现有科技文献中记载的常规含义或者本领域技术人员通常理解的技术含义。

如无特殊说明，本文记载的“TIM-1-Fc”、“TIM-1-Fc融合蛋白”、“TIM-1-Fc分子”、“TIM-1-IgG1Fc融合蛋白”、“TIM-1-IgG1Fc”具有相同的含义，均指代同一种物质，即“TIM-1-Fc融合蛋白”。

本发明提供了T细胞免疫球蛋白粘蛋白-1蛋白和IgG蛋白在制备治疗变应性疾病的药物中的用途。

所述药物的作用靶点为表达于活化APC细胞表面的TIM-4或其他细胞表面的TIM-4和或其他与之相互作用配体分子。

所述的药物为通过TIM-1/TIM-4途径和或TIM-1/其他配体途径抑制T细胞活化异常的药物。

所述的药物为过变应性疾病或其他与TIM-1分子相关的疾病药物。

优选的，所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白是由TIM-1分子胞外段和IgG分子Fc片段组成的融合蛋白。

在本发明实施方案中，T细胞免疫球蛋白粘蛋白片段选自人或动物的T细胞免疫球蛋白粘蛋白的胞外域，为TIM胞外域全长或部分序列。

优选地，所述TIM胞外域是人TIM的胞外区。

优选地，所述TIM胞外域区是人TIM-1胞外区。

优选地，所述TIM-1胞外域序列具有：

SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少80％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在本发明实施方案中，免疫球蛋白Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，为Fc全长或部分序列。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG的Fc区。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区为：

SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列有至少70％同源性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4的核苷酸序列有至少70％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

优选地，所述融合蛋白为：

SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

本发明的另一个方面提供了一种编码重组TIM-1-Fc融合蛋白的多核苷酸分子。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：一种用于哺乳动物表达系统高表达TIM-1-Fc融合蛋白的核酸序列，包含：Kozak序列、人TIM-1信号肽编码序列、人TIM-1胞外成熟编码序列和Fc片段的编码序列，如SEQ ID NO:4所示所述TIM-1胞外序列的部分和免疫球蛋白Fc区之间直接连接和/或通过接头连接；本发明的TIM-1‐Fc融合蛋白中使用的接头可以是本领域用于连接两段肽段常用的接头，例如：GluArgProSerPheVal，和/或，GlyGlyGlyGlySer。本领域技术人员还可以根据本文公开的内容，出于连接TIM

蛋白和IgG蛋白的目的，常规选择本领域其它常见的接头或对已有接头的序列、长短进行合理调整。优选地，本发明的TIM-1-Fc融合蛋白的TIM-1胞外序列部分和免疫球蛋白Fc区之间的连接方式为直接连接。

编码重组TIM-1-Fc融合蛋白的多核苷酸序列是选自下列核苷酸序列的一种：

1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列至少70％相同的核苷酸序列；

3)在严谨杂交条件下能与SEQ ID NO:6或其互补的多核苷酸分子杂交的核苷酸序列；

4)编码与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

本发明还包括一种TIM-1-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体，所说的载体为真核载体。

所说的真核载体为哺乳动物细胞表达载体。由于原核表达体系所表达的产物，缺乏糖基化修饰功能，蛋白功能不能保证，因此在此发明中，优选哺乳动物细胞表达载体，如pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)。

本发明还包括一种TIM-1-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体的宿主细胞，所说的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。

所说的宿主细胞优选自CHO细胞。

本发明还提供了上述TIM-1-Fc融合蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：

a)将编码TIM-1胞外区域片段的核苷酸序列和编码人Ig G的Fc的核苷酸序列连接于表达载体，构建TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达载体；

b)将步骤a)中的重组表达载体转染至宿主细胞，转染后，依照筛选标记基因，筛选获得稳定表达TIM-1-Fc融合蛋白的工程细胞株；并进行培养。

c)培养步骤b)获得的工程细胞株；

d)从步骤c)中的培养产物中分离纯化TIM-1-Fc融合蛋白。

所述步骤a)中的表达载体可以选用各种已知的载体，优选为载体pCDNA3.1(+)。

所述步骤b)中的宿主细胞为CHO细胞、人NIH293细胞、COS细胞和/或MDCK细胞及它们的衍生细胞系中的一种或多种的组合。优选的，宿主细胞为CHO细胞。

所述步骤b)中重组表达载体转染至哺乳动物细胞中可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法；一种优选的转染方法是脂质体转染。

所述步骤d)中纯化分离TIM-1-Fc。多种层析方法均可以用于TIM-1-Fc的分离纯化，包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤。优选的方法是使用Protein A亲和层析纯化分离TIM-1-Fc。

所述重组TIM-1-Fc融合蛋白，所述重组子或所述细胞株用于治疗变应性疾病的用途。

在本发明的一个优选的实施例中，上述TIM-1-Fc融合蛋白的制备方法为：将经筛选得到的工程细胞株培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为：温度36℃～37.5℃，CO2浓度为5％。培养15天后，离心培养液得上清，Protein A亲和层析分离TIM-1-Fc融合蛋白。

本发明进一步提供了TIM-1-Fc融合蛋白作为介导细胞凋亡的磷脂酰丝氨酸(PS)受体及其生物学活性的用途。

本发明还进一步提供了TIM-1-Fc融合蛋白在制备用于治疗变应性疾病的药物中的应用。

目前人类TIM家族成员包括TIM-1、TIM-3、TIM-4，该蛋白家族的每个成员在治疗变应性疾病的机理上都是通过作用T细胞活化；同时，人类IgG家族包括四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，除IgG1外，本发明对TIM蛋白家族的3个成员和IgG蛋白家族的4个成员进行选择、组合，构建TIM-1-IgG1、TIM-1-IgG2、TIM-1-IgG3、TIM-1-IgG4、TIM-3-IgG1、TIM-3-IgG2、TIM-3-IgG3、TIM-3-IgG3、TIM-3-IgG4、TIM-4-IgG1、TIM-4-IgG2、TIM-4-IgG3、TIM-4-IgG4等融合蛋白，并能获得如本文所记载的类似的效果，起到治疗变应性疾病的作用。鉴于本文篇幅有限，不再一一罗列每个融合蛋白的具体实验数据。

鉴于Tim-1蛋白通过对T细胞活化，Th细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)的调节和共刺激信号通路作用在体内的免疫应答中可能起极为重要作用，本发明推测在哮喘疾病中，采用人共刺激分子TIM-1-Fc通过阻断TIM-1-TIM-4间相互作用途径，致使TIM-1-TIM-4共刺激信号通路受阻，从而调节患者中T细胞活化、增殖、分化，促进Th1反应及效应细胞因子的表达，抑制Th2应答及效应细胞因子的表达；抑制Th17细胞分化及相关促炎症细胞因子的表达，增强Treg的功能和数量及相关细胞因子的表达；促进患者中Th细胞亚群间的平衡，促使患者中体内的促炎/抗炎细胞平衡，达到改善和(或)治疗哮喘目的。

本发明提供的通过分子生物学的方法，构建TIM-1分子胞外段和IgG分子Fc片段的融合基因，将此构建好的融合基因在体外进行稳定表达TIM-1-Fc融合蛋白，通过PCR和Western Blot方法验证该融合蛋白表达成功，并通过亲和层析技术纯化重组蛋白。在体外细胞实验中，该融合蛋白具有较高的生物活性，同时在此基础上，建立哮喘小鼠模型；在小鼠体内试验中，腹腔注射和/或鼻腔滴注TIM-1-IgG1Fc融合蛋白的能够明显缓解哮喘的症状。因此，本发明表明TIM-1-IgG1Fc融合蛋白具有抑制和/或缓解哮喘发生发展的作用，而这种抑制作用与其能够调控T细胞的活化和T细胞亚群有关。该融合蛋白为临床上治疗哮喘等变应性疾病提供了新的候选靶点与药物选择，作为变应性疾病(如哮喘)治疗新药具有很好前景。

本发明的CHO-TIM-1-Fc细胞株的保藏信息如下：

命名：CHO-TIM-1-Fc细胞株

分类名称：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-TIM-1-Fc

保藏号：CCTCC NO:C201826

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏日期：2018年1月4日

附图说明

图1：TIM-1-Fc双酶切鉴定。1：TIM-1-Fc Nhe I和Kpn I双酶切结果；2：TIM-1-Fc Nhe I和Xho I双酶切结果；3：TIM-1-Fc Kpn I和Xho I双酶切结果；4：pcDNA3.1(+)空质粒Xho I单酶切结果；M1：DL10,000DNA marker；M2：150bp DNA Ladder Marker。

图2：TIM-1-Fc PCR产物。M:DNA marker；1：pcDNA3.1(+)稳转CHO细胞；2：pcDNA3.1-TIM-1-Fc稳转CHO细胞。

图3：TIM-1-Fc体外初步活性评价。

对照组：HepG2和CHO细胞有非常少的非特异性荧光，可能是染色时间过长或者洗涤不充分所致。

PV处理组：HepG2和CHO细胞的胞膜上出现明亮的绿色。

PV/TIM-1-Fc处理组：TIM-1-Fc预处理的PV诱导的HepG2和CHO细胞只有非常少的荧光。

图4：ELISA法筛选pcDNA3.1(+)-TIM-1-Fc单克隆细胞株。图中深兰色为ELISA法筛选pcDNA3.1(+)-TIM-1-Fc单克隆细胞株。

图5：TIM-1-Fc SDS-PAGE检测结果。M：蛋白质Marker；1,7：未纯化的TIM-1-Fc上清液；2,3，4，5,6,8不同时段流出的洗脱纯化的TIM-1-Fc融合蛋白。

图6：TIM-1-Fc WB结果。1：稳定转染pcDNA3.1(+)CHO上清液WB结果；2：TIM-1-Fc的WB结果(纯化)。

图7：小鼠肺部组织病理图。

图8：小鼠BALF HE染色结果。

图9：小鼠BALF中嗜酸粒细胞结果。

图10：小鼠BALF中上皮细胞结果。

图11：小鼠外周血中CD4+T细胞上Tim-1的流式结果。

图12：小鼠外周血中CD4+T细胞上Tim-1的表达结果。

图13：Tim-1小鼠脾细胞在Th17和Th2上的流式结果。

图14：Tim-1小鼠脾细胞在Th2上的表达结果。

图15：Tim-1小鼠脾细胞在Th17上的表达结果。

图16：Tim-1小鼠脾细胞在Treg上的流式结果。

图17：Tim-1小鼠脾细胞在Treg上的表达结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

生物材料的来源

小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF级BALB/c小鼠,6-8周龄,雌性,体重16-18g。

CHO细胞购自北京协和细胞资源中心(国家实验细胞资源共享平台)。

本发明实验过程中所使用的全部试剂与耗材都可通过商购获得。

第1组实施例、本发明的药物

本组实施例提供一种用于防治变应性疾病的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述药物的活性成分包括：包含了TIM家族蛋白序列与IgG家族蛋白序列的融合蛋白；和/或，可表达所述融合蛋白的表达载体；和/或，包含所述表达载体的转化体，或可分泌所述融合蛋白的细胞株。

在进一步的实施例中，所述TIM家族蛋白序列为TIM家族蛋白胞外域序列；所述IgG蛋白序列为IgG蛋白Fc片段序列。

在一些实施例中，所述药物的活性成分选自由下述物质组成的组：融合了TIM-1蛋白胞外域序列和IgG1蛋白Fc片段序列的TIM-1-IgG Fc融合蛋白；和/或，可表达所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白的表达载体；和/或，包含所述表达载体的转化体，或可分泌所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白的细胞株。

在更进一步的实施例中，所述TIM-1蛋白胞外域序列为TIM-1-IgG Fc融合蛋白的N端；所述IgG1蛋白Fc片段序列为TIM-1-IgG Fc融合蛋白的C端；所述TIM-1蛋白胞外域序列指TIM蛋白胞外域序列。

在具体的实施例中，所述TIM-1蛋白胞外域序列选自：SEQ ID NO：1的氨基酸序列；或，SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在另一些具体的实施例中，所述IgG1蛋白Fc片段序列选自：SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或，SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在更具体的实施例中，所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白为SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者，SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；

在一些实施例中，所述表达载体为真核表达载体，

在优选的实施例中，所述表达载体为pcDNA3.1(+)；

在具体的实施例中，所述可表达所述TIM-1-IgG Fc融合蛋白的表达载体优选为连接有所述TIM-1-IgGFc融合蛋白对应的核苷酸序列的TIM-1-IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒；所述的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞，所述宿主细胞转染TIM-1-Fc融合蛋白编码DNA序列的载体；所述的宿主细胞优选为CHO细胞。

在进一步的实施例中，所述包含所述表达载体的转化体为所述的CHO-TIM-1-Fc细胞株。

第2组实施例、TIM家族蛋白和IgG蛋白的制药用途

本组实施例提供TIM家族蛋白和IgG蛋白在制备用于防治变应性疾病的药物方面的用途。在本组所有的实施例中，所述用途都具备如下共同特征：采用分子生物学的方法将TIM家族蛋白和IgG蛋白连接融合，制备得到包含TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列的融合蛋白；和/或，可表达所述融合蛋白的表达载体；和/或，包含所述表达载体的转化体，或可分泌所述融合蛋白的细胞株。

在一些实施例中，所述连接指：所述TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列之间直接连接和/或通过接头连接；

在优选的实施例中，所述连接为所述TIM家族蛋白序列与IgG蛋白序列之间直接连接；

在更进一步的实施例中，所述TIM家族蛋白序列为TIM家族蛋白胞外域序列；

在优选的实施例中，所述TIM家族蛋白胞外域序列指TIM-1蛋白胞外域序列；

在更优选的实施例中，所述TIM-1蛋白为人源TIM-1蛋白；

在另一些实施例中，所述接头选自：Glu Arg Pro Ser Phe Val，和/或，GlyGlyGlyGlySer；所述“接头”具有本领域技术人员通常理解的含义；本领域技术人员可根据本文的公开，出于连接TIM蛋白和IgG蛋白的目的，合理选择或常规调整所述接头的种类、序列、长短。所述IgG蛋白序列为IgG蛋白Fc片段序列；

在优选的实施例中，所述IgG蛋白Fc片段序列指IgG1蛋白Fc片段序列；

在更优选的实施例中，所述IgG1蛋白为人源IgG1蛋白。

实验例1、人TIM-1与Fc融合蛋白表达质粒的构建

1.1获取人TIM-1胞外段和IgG1Fc段基因

根据NCBI资料报道的人TIM-1基因序列，选取含自身信号肽(TIM-1signal peptide)人TIM-1胞外基因序列和编码人IgG1Fc的基因序列进行PCR扩增和克隆构建TIM-1-IgG1Fc融合基因(TIM-1-Fc融合蛋白编码DNA序列如SEQ ID NO:6所示)；

1.1.1设计引物

根据NCBI资料，设计扩增TIM-1胞外段和IgG1Fc段基因的引物，同时为顺利插入pcDNA3.1(+)载体，加入合适的限制性内切酶酶切位点。

扩增人TIM-1胞外区全部序列，包含TIM-1自身分泌信号肽序列，上、下游引物分别引入Nhe I和KpnI位点。所用引物序列如下：

上游引物:

P1:(SEQ ID NO:7)

上游引物同时引入Kozak序列；

下游引物:

P2:(SEQ ID NO:8)

扩增人IgG1Fc段基因序列，上、下游引物分别引入Kpn I和Xho I位点。所用引物序列如下：

上游引物:

P3:(SEQ ID NO:9)

下游引物:

P4:(SEQ ID NO:10)

1.1.2提取人总RNA并反转录为cDNA

从人的外周血中分离单个核细胞，使用人淋巴细胞分离液分离人外周血单核淋巴细胞(PBMC)，提取人PBMC的总RNA，TRIZOL法抽提总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA第一条链，再以其为模板。

1.1.3克隆人TIM-1胞外段和IgG1Fc段基因

以人cDNA为模板，采用TAKARA公司的高保真DNA聚合酶，分别以TIM-1引物对和IgG1Fc引物对经经多聚酶链反应(PCR)法合成5’端带有Nhe I，3’端带有Kpn I酶切位点(Restriction site)TIM-1胞外区全部序列，和5’端带有Kpn I，3’端带有Xho I酶切位点(Restriction site)IgG1Fc片段。PCR扩增TIM-1胞外段和IgG1Fc段基因，反应条件：95℃预变性5min，94℃变性秒，58-63℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环，72℃终延伸5分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，回收纯化PCR产物。

1.2 TIM-1-Fc融合基因的构建

以pcDNA3.1(+)载体为骨架，构建TIM-1-IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒，其多克隆位点含有Nhe I、Kpn I和Xho I酶切位点。

1.2.1构建IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒

pcDNA3.1(+)质粒和IgG1Fc PCR片段分别使用Kpn I和Xho I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，以pcDNA3.1(+)为载体，使用T4DNA连接酶将IgG1Fc片段连接到载体上，将连接产物转化于感受态细胞DH5α，涂布于氨苄抗性的固体LB培养基上，倒置培养过夜，挑取单克隆菌落，提取质粒，Kpn I和Xho I双酶切鉴定，结果如图1所示，酶切鉴定正确产物送交上海生工生物公司测序鉴定。

1.2.2构建TIM-1-IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒

鉴定正确的IgG1Fc-pcDNA3.1(+)质粒和TIM-1胞外区域PCR片段分别使用Nhe I和Kpn I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，以IgG1Fc-pcDNA3.1(+)为载体，使用T4DNA连接酶将TIM-1片段连接到载体上，将连接产物转化于感受态细胞DH5α，涂布于氨苄抗性的固体LB培养基上，倒置培养过夜，挑取单克隆菌落，提取质粒，Nhe I和Kpn I双酶切鉴定，结果如图1所示，酶切鉴定正确的产物送交上海生工生物公司测序鉴定。

至此，构建完成TIM-1-IgG1Fc融合基因，并将其整合进pcDNA3.1(+)质粒，命名为CHO-TIM-1-Fc。表达产物为TIM-1-Fc段融合蛋白，结果如图2所示。

实验例2.TIM-1-Fc融合蛋白的体外生物学活性初步鉴定

利用TIM-1是凋亡细胞磷脂酰丝氨酸受体(Phosphatidylserine receptor,PSR),可以直接识别凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)，评价TIM-1-Fc融合蛋白的体外生物学活性。

2.1初步制备TIM-1-Fc和TIM-1-EGFP融合蛋白。

分别收集pcDNA3.1(+)TIM-1-Fc瞬时转染CHO细胞和本实验室已构建包含TIM-1胞外段(sTIM-1)的pEGFP-N1表达载体(pEGFP-N1-sTIM-1)瞬时转染CHO细胞48h上清液，将收集的上清液经12,000×g，4℃离心5min；上层液相分别转入灭菌的EP管中置-20或者-70℃冰箱中保存，以制备TIM-1-Fc和TIM-1-EGFP融合蛋白，观察TIM-1-Fc融合蛋白生物活性。

2.2 TIM-1-Fc融合蛋白生物活性初步评价

2.2.1过钒酸钠(Pervanadate，PV)制备方法

过钒酸钠(Pervanadate，PV)制备方法参考以前文献描述的方法制备浓度为200mM活性原钒酸钠，过滤灭菌保存(Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.Methods Enzymol,1991,201:477-82.)。每个实验所用的30mM PV按照以下的方法临时配制。按照以下顺序依次于一灭菌的EP管中加入150μl 200mM活性原钒酸钠、843μl PBS缓冲液、7μl 30％H2O2，混匀后避光15min。过量的H2O2用200mg/ml的过氧化氢酶5μl去除，混匀后室温避光5min。再将30mM PV加入到欲处理的培养细胞的培养基中，PV终浓度为100μM。

2.2.2 TIM-1-Fc融合蛋白生物活性初步评价

人HepG2和CHO细胞株在24孔培养板含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中维持生长。为了诱导培养细胞的凋亡，培养板中生长的细胞用或者不用过钒酸钠(Pervanadate，PV)(终浓度100μM)处理12h。经PV处理后，其中2组(HepG2和CHO细胞各1组)分别加入100μl上述的pcDNA3.1(+)TIM-1-Fc瞬时转染CHO细胞48h TIM-1-Fc融合蛋白质的48h收集的上清液，混匀孵育1h，然后，在相应孔中分别加入各自25μl含sTIM-1-EGFP融合蛋白质的48h收集的上清液，混匀避光孵育1h。经过1h孵育，用PBS缓冲液洗涤3次，然后在荧光显微镜下检测。结果表明TIM-1-EGF与凋亡细胞的效应被各自TIM-1-Fc融合蛋白所阻止。初步证明TIM-1-Fc融合蛋白具有生物活性，结果如图3所示。

实验例3.CHO稳定表达株(CHO-TIM-1细胞)筛选及鉴定

2.1、质粒纯化：使用质粒大提试剂盒提取纯化质粒pcDNA3.1-TIM-1-Fc，使用超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-2000)测定质粒的浓度及纯度。用于转染的质粒其浓度需≥1.0μg/μl，A260/A280＝1.7-1.9。若浓度不足，使用异丙醇沉淀质粒并浓缩至适当浓度。

2.2、CHO细胞活化：从液氮中取出冻存的CHO细胞，去除保护液，加适量低糖DMEM培养基至细胞密度为5×10⁵，于75ml摇瓶中，37℃，5％CO2条件下培养。细胞密度至2×10⁶时，使用适量培养基稀释至5×10⁵，直至细胞活力达90％以上。

2.3、转染：转染当天，细胞密度为1×10⁶，活力应大于90％。任意体积的细胞均可以进行转染，转染试剂与DNA依据转染试剂脂质体2000(Lipofectamine 2000Reagent,invitrogen)说明书比例进行混合。

2.5、稳定表达细胞的筛选：两天后待细胞生长状态恢复，用400-1200μg/ml的G418对阴性细胞进行筛选，观察细胞状态，每3天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行筛选高效表达细胞株，最终通过基因组PCR鉴定与抗IgG Fc ELISA检测TIM-1-Fc表达量和比较筛选，挑选分泌表达水平高的单克隆，得到稳定的高表达细胞株；将其中表达最高的分别扩增、保种，进行下一步表达和纯化，结果如图5所示。pcDNA3.1-TIM-1-Fc转化CHO细胞后，将稳定表达的细胞命名为CHO-TIM-1-Fc细胞株，并将该细胞株送保藏，其保藏信息如下：

命名：CHO-TIM-1-Fc细胞株

分类名称：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-TIM-1-Fc

保藏号：CCTCC NO:C201826

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏日期：2018年1月4日。

实验例4.制备TIM-1-Fc融合蛋白

3.1 CHO-TIM-1-Fc细胞培养及上清液收集：优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，先利用10％FBSDMEM(INVITROGEN，CA)培养基，用125ml培养瓶在37℃，5％CO2培养上述CHO工程细胞株6天，逐步替换成无血清DMEM培养基培养，无血清DMEM培养基培养后，每3天收集上清液一次，置-20或-80℃冰箱保存。

3.2 TIM-1-Fc融合蛋白纯化及鉴定：

无血清CHO-TIM-1-Fc培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经0.45μm滤膜过滤，然后用Protein A亲合层析柱分离提纯，最终得到TIM-1-Fc融合蛋白。具体步骤如下：用5倍体积的结合/冲洗缓冲液平衡柱子，以15滴/min的流速将样品上样到protein A柱上，用10倍体积的结合/冲洗缓冲液冲洗结合的hTIM-1-Fc和hTIM-4-Fc，用5倍体积的洗脱缓冲液洗脱即可，并向收集管中加入一定量的Tris 8.0缓冲液将蛋白调至PH中性。将纯化产物分装后冻存于-20℃或-80℃冰箱保存。纯化好的重组TIM-1-Fc融合蛋白经SDS-PAGE电泳和western blot鉴定。参照《蛋白质电泳实验技术》，配制10％的SDS-PAGE蛋白胶，用MOUSE anti-Human IgG-Fc一抗、Rabbit anti-MOUSE IgG(H+L)-HRP二抗进行SDS-PAGE及Western Blotting鉴定。在稳定转染pcDNA3.1(+)hTIM-4-Fc的CHO细胞培养上清中，用Western blot方法可检测到分子量约为60kDa处的融合蛋白；而在转染pcDNA3.1(+)空载体组及未转染质粒组则未检出(如图5、6所示)。

实验例5.本发明TIM-1-Fc融合蛋白治疗哮喘小鼠动物实验评估结果

5.1.哮喘动物模型：

致敏:哮喘组和干预组(n＝6)：分别于第1,7和14天，给予哮喘组和干预组小鼠腹腔内注射抗原混合溶液0.2mL(含卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，sigma公司25μg),氢氧化铝溶液0.10mL和生理盐水(NS)(或者PBS)0.10 mL)，对照组(n＝6)：给予腹腔注射生理盐水(或者PBS)0.2m1.

激发和干预:哮喘组和干预组(用纯化TIM-1-Fc干预，分为滴鼻组(每只小鼠每次给予(0.5-20μg/40μl)优选为1μg/40μl TIM-1-Fc滴鼻)和腹腔注射组(每只小鼠每次给予(0.5-20μg/200μl)优选为6μg/200μlTIM-1-Fc腹腔注射)：从实验第21夭起，给予滴鼻激发(in)，每天1次，连续7天，每只小鼠每次给予10mg/m1 OVA-NS 40μl滴鼻，滴鼻前均给予0.1％戊巴比妥钠(0.1ml/10 g体重)(严格控制)麻醉。干预组处理是0.1％戊巴比妥钠麻醉后，先滴鼻OVA-NS 40μl滴鼻，20 min后，再进行TIM-1-Fc干预，每天1次，连续7天。对照组：小鼠生理盐水替代。

上一段文字描述中提到的“TIM-1-Fc”指本发明第1组实施例任一项所述的本发明的药物。

5.2小鼠处死及标本收集与处理

(1)小鼠外周血与脾脏标本收集

采取小鼠摘眼球取血方法，将标本收集于EDTA-K2抗凝管备用。

(2)小鼠支气管肺泡灌洗收集

先分离出小鼠气管，通过口腔，用2ml注射器抽取2ml预冷生理盐水灌洗3次，回收率达80％-90％；胞计数板计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数，再于4℃,1500r/m离心10min，上清冻存于-70℃低温冰箱，沉淀细胞用PBS液重悬，取200μ1用细胞涂片机900r/m.10min涂片，再予HE染色以分类。

(3).分离肺组织

每组小鼠取左肺用4％多聚甲醛灌注固定24h以上，按矢状面在中、外1/3处取材制备石蜡切片，再予以苏木精伊红色染色。

与正常对照组小鼠相比，哮喘模型组小鼠在雾化过程中出现不同程度的烦躁不安或安静少动、呼吸加快加深、点头呼吸、弓背直立、前肢缩抬、二便失禁等哮喘速发相表现；而TIM-1-Fc干预的小鼠哮喘速发相反应动作明显减少，呼吸较哮喘模型组有所减慢，结果提示TIM-1-Fc干预可减轻哮喘小鼠急性发作症状。

如图7所示，肺组织病理切片H&E染色结果显示，肺组织病理切片发现:正常对照小鼠肺组织细支气管和肺泡结构清晰，基本无炎症细胞浸润；而哮喘模型组小鼠细支气管及伴行血管周围可见大量炎症细胞浸润，肺间质及肺泡腔可见嗜酸性粒细胞浸润，支气管粘膜皱壁减少，支气管平滑肌不同程度地肥厚增生，基底膜增厚且形态不规则，肺泡间隔不同程度增宽，提示成功建立小鼠哮喘模型；与哮喘模型组小鼠相比，TIM-1-Fc干预哮喘小鼠，哮喘小鼠炎症细胞浸润及平滑肌增生程度明显减轻，说明TIM-1-Fc融合蛋白对哮喘小鼠模型的预防作用效果是值得肯定的。

(4)小鼠支气管肺泡灌洗分类计数

对比正常组，哮喘组小鼠肺泡灌洗液中可见大量脱落的上皮细胞和嗜酸粒细胞，P<0.05。TIM-1-Fc治疗组上述改变明显减轻，结果如图8-10所示。

5.3小鼠外周血和脾细胞流式表达分析

小鼠外周血和脾细胞按照试剂盒中说明书进行(各类流式抗体购自BD公司)，设置阴性管、单阳管、样品管，调节好各个通道的电压及补偿，分别进行细胞膜表面荧光染色和细胞内细胞因子免疫荧光染色。

5.3.1小鼠Th细胞检测步骤

一、刺激/阻断

1)全血标本：取1ml全血标本，用RPMI 1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释到2ml。

2)脾脏：新鲜脾脏通过黏磨，300目的滤网过滤细胞，调成比例为1×10⁶/L，取1ml脾脏细胞，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释到2ml。

2)在标本中加入已37℃预热的刺激/阻断剂8μl(550583)，混匀放于24孔培养板中37℃，5％CO2培养箱培养3～6小时，期间注意相隔1～2小时需要混匀一次。

二、实验步骤：

1、设置阴性管、单阳管、样品管的各自组合

阴性管1：50μl刺激后的细胞+5μl Rat IgG1-AF488+5μl Rat IgG2b-PE+5μl Rat IgG2α-PE-Cy7+5μl Rat IgG1-Percp-cy5.5+5μl Rat IgG1-AF647

单阳管1：50μl刺激后的细胞+5μl IFN-γ-AF488+5μl Rat IgG2b-PE+5μl Rat IgG2α-PE-Cy7+5μl Rat IgG1-Percp-cy5.5+5μl Rat IgG1-AF647

单阳管2：50μl刺激后的细胞+5μl Rat IgG1-AF488+5μl Rat IgG2b-PE+5μl Rat IgG2α-PE-Cy7+5μl Rat IgG1-Percp-cy5.5+5μl Rat IgG1-AF647+CD4-AF700

样品管：50μl刺激后的细胞+5μl CD3+5μl CD4+5μl Tim-1+5μl IFN-γ+5μl IL-4+5μl IL-17A

2、正式实验步骤(样品管制备)

1)刺激和收获细胞(550583，刺激/阻断)

按照预实验的刺激/阻断条件刺激和收获细胞。1200rpm离心5min后用枪头吸取上清弃掉。

2)裂解红细胞(脾脏细胞此步省略)

按全血标本每100μl血+2ml的红细胞裂解液，轻轻混匀，避光孵育10min后离心去上清，2ml/管PBS清洗一遍，1200-1500 5min离心去上清。80μl的PBS重悬细胞，其中50μl做样品管(需要阻断Fc受体)，另外30μl+120μlPBS再次重悬，分装到3管阴性管和单阳管中(不用阻断Fc受体)。

3)阻断细胞膜表面Fc受体(553141，Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32)

样品管50μl的细胞悬液+5μl的Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32，室温孵育10min，不用洗。

4)细胞膜表面荧光染色

每管中加入相应适量的表面荧光抗体，轻轻吹打混匀，2℃-8℃避光孵育15min。

5)固定和破膜(554714，Fixation/Permeabilization Solution Kit)

①工作液配制：

1体积10×Perm/Wash Buffer+9体积的H2O，配制成1×Perm/Wash Buffer

②固定/破膜：加入250μl/管的1×Fix/Perm Buffer，轻轻吹打混匀细胞，2℃-8℃避光孵育20min。

③清洗：加1ml的1×Perm/Wash Buffer混匀后1200rpm离心5min，用移液枪吸取1ml的上清弃去(管底留250μl液体)。再加1ml的1×Perm/Wash Buffer重悬细胞，1200rpm离心，倒掉上清。

6)细胞内细胞因子免疫荧光染色

①加80-100μl的PBS重悬细胞，每管中加入相应适量的胞内荧光抗体，混匀，2℃-8℃避光孵育30min。

②清洗：加2ml的1×Perm/Wash Buffer重悬细胞，1200rpm离心5min，去上清

7)上机

每管加200μl-500μl的PBS重悬细胞，300目的滤网过滤细胞，充分混匀后上机测。(建议样本管的淋巴细胞门中收集5-10万个细胞)

5.3.2小鼠Treg细胞检测步骤

1、200μl全血+5μl CD3+5μl CD4+5μl CD25(抗抗小鼠)室温下避光孵育15min；

2、在每管中加入2ml的红细胞裂解液，室温下避光孵育10min；

3、将裂解好的外周血离心1200rpm，5min，去上清；

4、加入2ml的PBS，混匀；

5、离心1200rpm，5min，去上清；

固定/破膜(00-5523，Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set)

6、每管加1ml的Fixation/Permeabilization Concentrate，混匀；

7、室温或2-8℃下避光孵育30-60min。(鼠样品可以在2-8℃下避光孵育长达18h)；

8、每管加2ml的1×Permeabilization Buffer(1体积10×Permeabilization Buffer+9体积的Fixation/Permeabilization Diluent配制)后1200rpm离心5min。弃上清；

9、重复步骤8

10、50-100μl的PBS重悬后+10μl FoxP3抗体(Alexa647Rat anti-Mouse Foxp3Clone MF23)，避光孵育30min；

11、加2ml的1×Permeabilization Buffer后1200rpm离心5min，弃上清；

12、加200μl-500μl的PBS重悬，300目的滤网过滤细胞，充分混匀后上机测。(建议淋巴细胞门中收集5-10万个细胞)。

5.3.3小鼠外周血和脾细胞流式表达结果分析

(1)小鼠外周血中CD4+T细胞上膜分子Tim-1的表达分析

对比正常组，哮喘组Tim-1在CD4+T中上的表达增加，P<0.05。TIM-1-Fc干预能显著降低外周血中CD4+T细胞比例和CD4+T+Tim-1+细胞比例。结果如图11、12所示。

(2)Tim-1小鼠脾细胞在Th17和Th2中的表达分析

采用流式技术分析正常组和哮喘组TIM-1在正常组和哮喘组小鼠脾细胞在Th17和Th2中的表达变化，结果如图所示。对比正常组，哮喘组Tim-1在Th17和Th2中的表达增加，P<0.05。TIM-1-Fc干预能显著降低Th17和Th2细胞比例，并且能显著降低Th17和Th2细胞表面上的Tim-1表达。结果如图13-15所示。

(3)Tim-1小鼠脾细胞在Treg中的表达分析

采用流式技术分析正常组和哮喘组Tim-1在正常组和哮喘组小鼠脾细胞在Treg中的表达变化，结果如图所示。对比正常组，哮喘组Tim-1在Treg中的表达降低，P<0.05。TIM-1-Fc干预能显著增加Treg细胞比例，并且能增加Treg细胞表面上的Tim-1表达。结果如图16、17所示。

实验例6、动物实验治疗有效率统计

采用30只哮喘模型小鼠，哮喘模型小鼠的制备如实施例5所述，哮喘模型小鼠的典型症状包括：出现不同程度的烦躁不安或安静少动、呼吸加快加深、点头呼吸、弓背直立、前肢缩抬、二便失禁等哮喘速发相表现；将上述30只小鼠分组：15只为治疗组，另15只为对照组；治疗组的每只小鼠每天注射本发明第1组实施例任一所述的药物，剂量(0.5-20μg/200μl)优选为6μg/200μl，持续治疗7天；对照组小鼠每天注射同等剂量的生理盐水，持续注射天数与治疗组相同。进行上述治疗后，治疗组的全部小鼠的上述症状消失，且治疗前后每只小鼠体内的外周血中CD4+T+Tim-1+细胞比例显著降低(获得类似图11、12的结果，出于篇幅考虑，本文不再一一罗列)；Th17和Th2细胞比例与Th17和Th2细胞表面上的Tim-1表达显著降低(获得类似图13-15的结果，出于篇幅考虑，本文不再一一罗列)；Treg细胞比例及Treg细胞表面上的Tim-1表达显著升高(类似图16、17的结果，出于篇幅考虑，本文不再一一罗列)，P<0.05。上述结果说明本发明的药物在治疗哮喘模型小鼠方面的有效率为100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区人民医院

<120> 基于TIM蛋白和IgG蛋白的融合蛋白的治疗变应性疾病的药物及其制备方法

<130> P170880/GXR

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源（Homo sapiens）TIM-1胞外域的氨基酸序列

<400> 1

Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp

1 5 10 15

Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val

20 25 30

Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn

35 40 45

Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr

50 55 60

Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala

85 90 95

Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp

100 105 110

Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys

115 120 125

Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val

130 135 140

Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr

145 150 155 160

Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr

165 170 175

Thr Val Leu Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr

180 185 190

Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val

195 200 205

Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro

210 215 220

Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr

225 230 235 240

Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr

245 250 255

Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly

260 265 270

Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu

275 280 285

Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly

290 295

<210> 2

<211> 885

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源（Homo sapiens）TIM-1胞外域的核苷酸序列

<400> 2

atgcatcctc aagtggtcat cttaagcctc atcctacatc tggcagattc tgtagctggt 60

tctgtaaagg ttggtggaga ggcaggtcca tctgtcacac taccctgcca ctacagtgga 120

gctgtcacat ccatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180

attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240

ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300

ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360

tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420

gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aatgacgact 480

gttccaacga caactgttcc aacaacaatg agcattccaa cgacaacgac tgttctgacg 540

acaatgactg tttcaacgac aacgagcgtt ccaacgacaa cgagcattcc aacaacaaca 600

agtgttccag tgacaacaac tgtctctacc tttgttcctc caatgccttt gcccaggcag 660

aaccatgaac cagtagccac ttcaccatct tcacctcagc cagcagaaac ccaccctacg 720

acactgcagg gagcaataag gagagaaccc accagctcac cattgtactc ttacacaaca 780

gatgggaatg acaccgtgac agagtcttca gatggccttt ggaataacaa tcaaactcaa 840

ctgttcctag aacatagtct actgacggcc aataccacta aagga 885

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人（Homo sapiens）IgG1的Fc区的氨基酸序列

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 4

<211> 699

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人（Homo sapiens）IgG1的Fc区的核苷酸序列

<400> 4

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699

<210> 5

<211> 527

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TIM-1-Fc融合蛋白的氨基酸序列

<400> 5

Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp

1 5 10 15

Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val

20 25 30

Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn

35 40 45

Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr

50 55 60

Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala

85 90 95

Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp

100 105 110

Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys

115 120 125

Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val

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Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr

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Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr

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Thr Val Leu Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr

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Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val

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Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr

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Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr

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Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu

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Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

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Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

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<210> 6

<211> 1584

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TIM-1-Fc融合蛋白的核苷酸序列

<400> 6