化合物FG-4592在制备治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂中的应用的制作方法

本发明涉及使用fg-4592作为甲状腺激素受体thr激动剂，尤其是涉及化合物fg-4592在制备治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂中的应用。

背景技术：

化合物fg-4592，又称roxadustat，cas号为808118-40-3，结构式如下：

fg-4592是一种hifα脯氨酰羟化酶抑制剂，同时诱导epo产生，在临床上用于治疗与慢性肾病和终末期肾病相关的贫血。该口服小分子是通过抑制低氧诱导因子hif1α羟化酶，稳固hif1α与hifβ异源二聚体，从而调控下游靶基因，促进促红细胞生成素(epo)产生、抑制炎症、下调铁调素水平(游离铁封存的激素)和上调其他促进铁相关的基因,确保有效动员和利用人体自身的储存铁。恢复身体的自然平衡过程的红细胞生成(beuck,s.,w.schanzer,andm.thevis,drugtestanal,2012.4(11):p.830-45)。

核受体是一种配体激活的转录因子。甲状腺激素受体(thrs)是人体48种核受体中非常重要的一员，有thrα和thrβ两种亚型。thrs在天然配体激动剂甲状腺激素t3、t4转录激活调控下促进人体的生长、分化与代谢等各种生理活动。thr的配体介导的药理作用原理是甲状腺激素配体通过与thr的配体结合域(lbd)结合，调控thr招募各类辅激活因子(或辅抑制因子)来调节下游靶基因的转录。

甲状腺生成的t4和t3处于多重负反馈调控之下。tsh(也称为促甲状腺激素)负责正常的甲状腺功能和甲状腺激素分泌调控，tsh在脑垂腺千叶合成，并且其分泌由下丘脑中合成的促甲状腺激素释放激素(trh)控制。在通常水平，这种神经、激素类反馈调节保持人体的体重、新成代谢率、体温、心情和影响血清低密度脂蛋白(ldl)水平。因此，在甲状腺功能衰退时或甲状腺激素抵抗症下，有体重增加，糖尿病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、肥胖症、内分泌系统疾病。

甲状腺功能减退症或低下症(hypothyroidism)，简称甲减，是指由于不同原因引起甲状腺激素缺乏,使机体的代谢和全身各个系统功能减退,所引起的临床综合。临床表现包括记忆力减退、智力低下、共济失调；心动过缓，心输出量减少，可并发冠心病；厌食、腹胀、便秘、可导致恶性贫血与缺铁性贫血；肌肉软弱无力、疼痛、强直，可伴有关节病变如慢性关节炎；女性月经过多，久病闭经，不育症；男性阳痿，性欲减退；病情严重时，不当等应激可诱发昏迷，休克，心肾功能衰竭等。早期轻型病例以口服甲状腺片或左甲状腺素等甲状腺激素受体(thr)的激动剂为主(国家卫生计生委权威医学科普项目传播网络平台/百科名医网)。

甲状腺激素抵抗综合征(thyroidhormoneresistancesyndrome，srth)也称甲状腺激素不应症或甲状腺激素不敏感综合征(thyroidhormoneinsensitivitysyndrome，this)。目前对于该综合征下的治疗药物严重缺乏。根据其发病及临床表现可分为3种类型：1、全身性甲状腺激素不应症，垂体与周围组织均受累，本型又可分为甲状腺功能代偿性正常型及甲状腺功能减退症型；2、选择性垂体对甲状腺激素不应症，特点为垂体多有受累，对甲状腺激素不反应，而其余外周组织均不受累，可对甲状腺激素反应正常，其临床表现有甲亢；3、选择性外周组织对甲状腺激素不应症，本型特点为周围组织对甲状腺激素不反应或不敏感，而垂体多无受累，对甲状腺激素正常反应。临床表现甲状腺肿大，无聋哑及骨骺变化，虽甲状腺激素正常及tsh正常，但临床有甲状腺功能低下表现，心动过缓，水肿、乏力、腹胀及便秘等异常。本型可表现为智力差，发育落后，可有骨成熟落后表现。绝大多数甲状腺激素抵抗综合征是由于甲状腺激素受体基因发生突变，使甲状腺激素受体的氨基酸顺序发生变化，导致受体结构和功能的变化，对甲状腺激素t3、t4发生抵抗或不敏感。因此，寻找结构区别于天然甲状腺激素t3、t4的甲状腺激素受体的激动剂有望治疗甲状腺激素抵抗综合征。

甲状腺功能亢进症简称“甲亢”，是由于甲状腺合成释放过多的甲状腺激素，造成机体代谢亢进和交感神经兴奋，引起心悸、出汗、进食和便次增多和体重减少的病症。多数患者还常常同时有突眼、眼睑水肿、视力减退等症状。

thrs和认知障碍与抑郁症：

甲状腺激素稳态变化导致情感性精神障碍是引起个体患病的原因之一，尽管可能患者短期表现为甲状腺机能正常。然而，在患者的亚群中，临床上甲状腺功能不足与亢进的发生率表现为明显增加趋势。甲状腺激素对中枢神经系统发育是至关重要的，特别是大脑。精神疾病患者尤其是认知障碍和抑郁，甲状腺激素代谢和甲状腺系统免疫功能异常对此疾病发生发展是至关重要的。因而甲状腺激素被频繁用于加速和增强抗抑郁药药物的治疗，支持双相障碍的维持治疗情感障碍，即使是甲状腺机能正常的患者(bauer,m.,etal.,molpsychiatry,2002.7(2):p.140-56)给予甲状腺机能不足患者注射甲状腺激素t4导致情绪和学习能力的改善，并且积极的实验结果与增加的游离甲状腺激素浓度成正相关(bunevicius,r.,curropinpsychiatry,2009.22(4):p.391-5)。

甲状腺激素对中枢神经系统有重要影响，而精神障碍，尤其是情绪紊乱，通常会与大脑中甲状腺激素代谢紊乱相关(bauer,m.,etal.,jneuroendocrinol,2008.20(10):p.1101-14)。长期以来，t3一直被用于单独治疗抑郁症患者或与其它抗抑郁药联合使用，增强或加速抗抑郁药物对甲状腺抑郁患者的影响。比如，t3与三环类抗抑郁药联合使用对治疗抗抑郁患者的临床试验中明显加速三环类抗抑郁药，显示了这种治疗方法的明显疗效(aronson,r.,etal.,archgenpsychiatry,1996.53(9):p.842-8)。此外，t3与另一类主流抗抑郁药选择性5-羟色胺转运体抑制剂联合用药治疗重度抑郁症的有效性与安全性也被证实(cooper-kazaz,r.andb.lerer,intjneuropsychopharmacol,2008.11(5):p.685-99)。这些数据表明，确保中枢神经系统的正常发育与成熟，需要特异性增强thrs活性，从而增强神经系统中的代谢、生长调控和信号传导，从而增加学习能力和避免认知障碍，以及治疗抑郁症类等情感障碍。

thrs和高胆固醇系列疾病：

甲状腺激素通过thrβ调节脂质和胆固醇代谢作用明显，但临床使用天然甲状腺激素和甲状腺受体激动剂治疗高胆固醇血症仅在甲状腺功能障碍的患者中应用。原因就在于非特异性的激动剂会激活thrα受体，从而产生心血管疾病方面的负面影响。因此寻找高效且特异性的激活thrβ而非thrα将成为治疗脂质代谢异常，高胆固醇引起的系列疾病的坚实方向。因此，寻找有效且特异性的甲状腺激素受体β激动剂，调节脂质代谢，降低胆固醇，从而治疗血脂异常，脂肪肝，高胆固醇血症、动脉粥样硬化等疾病任然十分必要。

thrs与非酒精性脂肪炎：

最近的临床报道指出甲状腺激素受体β特异性激动剂可以保护肝组织、促进肝功能，以及治疗非酒精性脂肪肝(nafld)。此项在madrigal制药公司公布的数据中研究进展被誉为超过fxr,pparα/δ治疗非酒精性脂肪肝炎的全新有效途径。独立于此发现的是，另有科学家kimd等发现亚临床的甲减患者患有的非酒精性脂肪肝炎(nash)和肝纤维化与他们的甲状腺功能低下有直接关系。在甲状腺功能较低的受试者中，非酒精性脂肪肝炎和晚期纤维化的比例较高。甲状腺功能低下的患者有更严重的肝脂肪变性，以及更严重的球囊变性和纤维变性(kim,d.,etal.,clingastroenterolhepatol,2018.16(1):p.123-131e1)。于此类似的是，另一组科学家miyake等发现甲亢患者具有明显改善非酒精性脂肪性肝炎的病理状态，根据他们的研究发现这一效果与肝脏酶水平随着甲状腺激素水平的升高而提高有关，随着甲状腺激素水平的提高，肝酶水平升高。因此，甲状腺机能亢进症可改善非酒精性脂肪肝炎的病理状态(miyake,t.,etal.,internmed,2016.55(15):p.2019-23)。这些数据都显示预防及治疗非酒精性脂肪肝疾病，靶向甲状腺激素受体，提高受体活性，是一个有效的方式。

甲状腺激素类似物发展方向：

目前，鉴于甲状腺激素受体治疗甲状腺功能低下、甲状腺激素抵抗综合征和抑郁症等疾病的有效性与广泛性，研发更强的甲状腺激素激动剂成为攻克的主要方向。然而目前此研发领域尚有两大问题亟待解决，第一，正如前文所述，天然甲状腺激素t3在结合两个thr亚型(thrα和thrβ)方面未显示出任何选择性。因此，施用t3虽然能在动物模型和人中降低血浆胆固醇、低密度脂蛋白(ldl)、甘油三酯水平相关指标，然而，由于t3对心脏的副作用(如心动过速,心律不齐和肌肉萎缩)，限制了它的应用。对敲除动物进行的研究以及一些选择性配体的结果表明这些心脏副作用可归因于thrα的激活。因此，现有的甲状腺激素激动剂研发主要是提高对thrβ选择性激活而降低对thrα的激活。另一个主要问题就是基因突变带来的不利影响。甲状腺激素抵抗(refetoff综合症)描述了一种罕见的症状，甲状腺激素水平升高，但甲状腺刺激激素(tsh)水平没有被抑制，或者没有被预期完全抑制。本质上，这是降低了甲状腺激素效应器对甲状腺激素的反应(refetoff,s.,etal.,jclinendocrinolmetab,1967.27(2):p.279-94)。因此，尽管提高了血清甲状腺激素的水平，个体仍可能出现甲状腺功能无变化。最常见的症状是甲状腺肿大和心动过速。它也与一些注意缺陷多动障碍(adhd)以及抑郁有关(hauser,p.,etal.,nengljmed,1993.328(14):p.997-1001；fardella,c.e.,etal.,endocrine,2007.31(3):p.272-8)。该综合症的最常见的原因是基因thrβ基因的突变，现已有超过100种不同的甲状腺激素受体β位点突变导致甲状腺激素抵抗综合征的病例，而且还在有着新的突变位点报道(beato-vibora,p.,j.etal.,eurjobstetgynecolreprodbiol，2013.167(1):p.118-9)。甲状腺激素抵抗综合征目前仍缺乏有效的治疗手段，甲状腺激素受体蛋白的突变使原本天然配体如t3和多种thrβ选择性激动剂失去作用，全新、适应多型甲状腺素抵抗综合征的药物亟待开发。

因此，基于上述背景，开发更具特异性和选择性的甲状腺激素受体配体，尤其是thrβ选择性激动剂以及可以激活thrs突变体的新型激动剂，可导致对多种疾病，如甲状腺功能低下、甲状腺激素抵抗综合征和抑郁症等，进行特异性预防和治疗，而避免天然甲状腺对心血管的刺激和其它毒性的药物依然十分迫切。

技术实现要素：

本发明的目的在于使用化合物fg-4592(或羟基奎宁类药物)在制备一种甲状腺激素受体(thr)的激动剂中的应用，以及在制备预防或治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂中的应用。

所述化合物fg-4592(或羟基奎宁类药物)的结构式如下：

所述化合物fg-4592或其在药学上可接受的盐，可在制备一种甲状腺激素受体(thr)的激动剂中应用，所述thr包括thrα与thrβ，所述激动剂包括完全激动剂或部分激动剂。

所述化合物fg-4592或其在药学上可接受的盐，可在制备一种thrβ的选择性激动剂中应用。

所述化合物fg-4592或其在药学上可接受的盐，可在制备预防或治疗甲状腺激素受体介导疾病药物制剂中应用。所述甲状腺激素受体介导疾病包括甲状腺激素低下症、甲状腺激素减退症、多型甲状腺激素抵抗综合征、精神疾病、非酒精性脂肪肝等。所述精神疾病包括但不限于注意缺陷多动障碍(adhd)、抑郁、精神发育迟滞和认知功能障碍。

所述多型甲状腺激素抵抗综合征包括但不限于临床上已知的thrβ受体蛋白配体结合域上突变的位点病变，所述位点突变包括但不限于所导致的甲状腺激素抵抗综合征v264d、a268d、r282s、v283a、m310t、e311k、s314c、a317t、r320c、n331d、g332e、g332r、l346f、l346v、h435l、r438h、f459c、f459l等。

所述化合物fg-4592或其在药学上可接受的盐，可在制备与其它预防或治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂联合使用的药物组合物中的应用。

所述化合物fg-4592为药物组合物，所述药物组合物包括有效剂量的fg-4592或其在药学上可接受的盐。

所述化合物fg-4592具有良好的thr激动效应，实验证明，化合物fg-4592能与核受体甲状腺激素受体(thr)结合，诱导thr募集辅调节因子，而激活thr的靶基因的表达，表明所述化合物是核受体thr的小分子“调控剂”或“thr配体”，因此，其可作为thr激动剂用于预防或治疗thr介导的相关疾病。其中所述thr激动剂包括thrα与thrβ的完全激动剂或部分激动剂。

alphascreen实验证明，fg-4592能诱导thrα和thrβ募集辅激活因子。因为辅激活因子能够直接激活thr下游通路，表明fg-4592是核受体thr的激动剂。报告基因实验证明，fg-4592能激活核受体thrα和thrβ对其靶基因的转录活性，表明fg-4592是核受体thr的激动剂。结晶学手段从原子水平进一步阐明了thrβ与fg-4592相互结合的结合模式。因此利用多种方法证明，fg-4592甲状腺激素受体thr的激动剂可以作为甲状腺激素类似物来预防或治疗thr介导的相关疾病。

实验证明，fg-4592对多型产生甲状腺激素抵抗综合征的thrβ突变体的转录活性有显著激活，可以用来治疗甲状腺激素抵抗综合征。由于这些突变体使thr配体结合域(lbd)构象变化，失去了与甲状腺激素t3、t4的强结合能力。然而fg-4592与甲状腺激素t3、t4结构显著不同，因而fg-4592能够结合这些thrβ受体蛋白位点病变体，并显著激活它们的转录活性，所以fg-4592可以用来治疗甲状腺激素抵抗综合征。

以上实验表明，fg-4592是核受体thrβ的激动剂，可以通过结合靶标thrβ调节thrβ在机体中参与的能量代谢、脂代谢、胆固醇-胆酸代谢等代谢、炎症、肿瘤、肝硬化、血祖细胞分化等方面的功能。

fg-4592是可口服小分子治疗慢性肾病贫血(ckd)的羟基奎宁类药物，主要用于第二代低氧诱导因子脯氨酸羟化酶抑制剂(hif-phi)从而治疗与慢性肾病和终末期肾病相关的贫血。迄今未见任何有关其在治疗甲状腺激素抵抗症、甲状腺激素低下或减退症等甲状腺激素受体介导疾病的药物中应用。因此本发明给出的fg-4592在这些疾病方面具有治疗功能，都是关于fg-4592的新应用方法，具有创造性。

甲状腺激素抵抗症、甲状腺激素低下或减退症等甲状腺激素受体介导疾病严重影响人类的健康和生命，因此，本发明给出的这种fg-4592在制备治疗这些重大疾病的药物制剂方面的实用功能，具有重要的社会价值和巨大的经济价值，具有实用性。

在一些实施方案中，本发明所述方法中的化合物可配制成药物组合物在一些给药方案中应用。本发明药物的组合物可包含所述化合物自身和其给药可用的盐或给药载体。这样的组合物还可选择性地包含其它治疗剂。

某些药剂或疗法可与本发明所述化合物进行联合给药，如基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增生化合物。

本发明所用术语“组合”及其相关词汇依次对应的是治疗剂与本发明化合物是同时或按顺序施用的，例如，所述某化合物可以同时或相继与另一治疗剂在单一单位剂型中施用。因此，本发明提供一种单一单位剂型，包含所述化合物、一种额外的治疗剂。在许多给药方案中，当患者或个体同时暴露于至少两种药剂时，如果患者或个体在某个特定靶组织或样本(例如，在脑部、在血清等)同时显示出所用试剂的相关治疗效果，通常认为它们是以“组合”的形式发挥作用的。

如果这些化合物是本发明化合物的药学可用盐制品，那么用到的盐应优先来自无机或有机酸和碱。酸性盐包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸、甲苯磺酸盐和十一酸盐等中的一种。碱盐包括铵盐、碱金属盐、碱土金属盐与有机碱盐；所述碱金属盐包括钠盐和钾盐，所述碱土金属盐包括钙盐和镁盐，所述有机碱盐包括二环己基胺盐、n-甲基-d-葡糖胺盐、或带有氨基酸如精氨酸、赖氨酸等盐中的一种。

本发明的药物组合物可配制成固体或液体的形式，包括以下适合的给药形式：(1)口服给药，如灌药剂(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，颊、舌下和全身吸收剂，大丸剂，散剂，颗粒剂，舌下用的糊剂；(2)肠胃外给药，制备为无菌溶液或悬浮液或持续释放剂，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，如乳膏，软膏，用于皮肤、肺或口腔的释放受控贴剂或喷雾剂；(4)直肠内给药，如作为乳剂或泡沫；(5)其他：舌下含服，眼用，经皮或经鼻、肺和其它粘膜摄入。

所述化合物的药物组合物的制备方法包括用任意工序将化合物fg-4592与载体或多种辅助成分组合。通常情况下，可将化合物fg-4592与载体(液体载体、细碎固体载体或两者均有)均匀紧密地组合制备，且根据需要将产物赋形。

某些情况中，可通过减缓药物从皮下或肌肉注慢吸收的速度以延长药效，可以通过制备水溶性差的结晶或无定形物质的液体悬浮液来实现这一目的。药物的吸收速率取决于其溶解速度，其溶解速率又可能取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将药物溶解或悬浮于油性载体中以延迟胃肠外给药吸收。

可通过将所述化合物与微囊基质中可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)结合制成其可注射药物储库剂型。根据药物与聚合物的比例及所用特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。也可通过将药物包埋在脂质体或微乳中，以制备与身体组织相容的可注射药物储库剂型。

本发明的药物成分可以任意口服可接受剂型口服给药，剂型包括但不限于：胶囊，片剂，以及水悬浮液和溶液。对于口服片剂而言，其常用包膜有乳糖和玉米淀粉，通常还会加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于口服胶囊制剂而言，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当以水悬浮液和溶液及丙二醇制剂口服给药时，药物活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如有需要，可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

可通过将本发明的药物成分制成气雾剂或吸入剂给药。这样的药剂可根据制药配方领域中广泛应用的技术制备，也可将其制备为盐水溶液。这类现有技术常使用苄醇或其它适当的防腐剂、碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂、吸收促进剂以提高其生物利用率。

透皮贴剂的额外优势是实现本发明化合物对机体的受控递送。可将该化合物溶解或分散在适当的介质中制作这种剂型。可以用吸收增强剂增加皮肤对化合物的吸收。也可通过采用速率控制膜或者将化合物分散于聚合物基质或凝胶中的方式，实现化合物通过皮肤速率的控制。

本发明通过高通量筛选得到fg-4592是thr的特异性配体。通过alphascreen生物化学方法检测化合物诱导thr与辅激活因子或辅抑制因子的作用。

基于细胞转染实验中荧光素酶报告基因活性分析及分子结构水平阐述这种受体与配体间的特异的选择性识别，进一步验证化合物对thr的转录激活作用。

选择多型产生甲状腺激素抵抗综合征的thrβ受体蛋白位点病变体，甲状腺激素t3对所有表中突变体的报告基因的转录均失去显著激活，但fg-4592对这些thrβ突变体转录活性有显著激活。

将thrβ/fg-4592制备复合物，通过结晶学手段，对该复合物进行结晶、x射线晶体衍射以及结构解析，从原子水平阐明了thrβ与fg-4592相互结合的结合模式。因此，本发明通过结合生物化学，分子生物学和结构生物学等多种方法，发现并验证fg-4592是一种新型thr的激动剂。同甲状腺激素t3一样，fg-4592能够激活thr介导的转录活性，也能显著激活甲状腺激素t3有抵抗的thrβ突变体转录活性。

附图说明

图1为fg-4592促进src辅激活因子lxxll模序与thrα与thrβ的相互作用。

图2为fg-4592与thrβ结合的复合体三维晶体结构图。带状图表示核受体thrβ蛋白质的结构，标注有相关α螺旋的名字。棒状图表示配体fg-4592化合物的结构。

图3为fg-4592与甲状腺激素受体thrβ配体结合域中氨基酸相互作用二维示意图。配体疏水的烃基端与附近的非极性氨基酸形成疏水相互作用，而配体羧基端主要直接与极性氨基酸形成氢键或通过水与极性氨基酸形成氢键网络。其中灰色箭头与黑色直线分别表示配体与氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用。

具体实施方式

实施例1，证明fg-4592增强了thrα与thrβ募集辅激活因子，是甲状腺激素受体thr的激动剂。

图1为fg-4592促进src辅激活因子lxxll模序与thrα与thrβ的相互作用。利用alphascreen技术检测终浓度为1μm的fg-4592对thrα与τηrβ的lbd与包括srclxxll基序内的多种辅调节因子相互作用的影响。

n－端生物素化的辅因子多肽序列是：

src1-2：spsshsslterhkilhrllqegsp；

src2-3：qepvspkkkenallrylldkddtkd；

src3-3：pdaaskhkqlsellrggsg；

ncor-1：gqvprthrlitladhicqiitqdfarnq；

ncor-2：ghsfadpasnlglediirkalmgsf。

蛋白纯化：人源thrαlbd(氨基酸残基数148-410)和thrβlbd(氨基酸残基数202-461)基因分别构建于novagen公司的含有6聚组氨酸融合标签的pet24a载体中。构建后的载体转化于大肠杆菌bl21(de3)中，并在30℃培养至od600约为0.8时降温至22℃，加入0.1mm异丙基1-硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导靶蛋白表达6h。大肠杆菌细胞随后离心(4200r.p.m.)30min后，冰上重悬于缓冲液(25mmtrisph7.5,25mm咪唑，150m氯化钠)中并-70℃冷冻2h后超声破碎细胞。裂解的细胞液在4℃离心(>20000r.p.m.)30min后，取上清上柱于ge公司的镍离子交换柱(niso4-loadedhitraphpcolumn，gehealthcare)。随后，装载样品的镍柱于ge公司的aktapure中使用25～500mm咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱。洗脱出的蛋白进一步使用阴离子交换柱(q-sepharosecolumn)纯化。

在寻找thr配体的过程中，将thrα与thrβ的lbd蛋白当做“诱饵”利用alphascreen技术对化合物库进行筛选。用alphascreen试剂盒(perkins-elmer)实验能够检测出thrlbd蛋白与配体结合所需的各种不同基序的多肽(jinetal.,naturecommunications2013,4,1937)。该实验的反应体系是20-80nm的受体lbd蛋白，20nm生物素化的辅因子多肽，5μg/ml的供体和受体玻璃珠，缓冲液(25mmhepes,100mmnacland0.1mg/mlbovineserumalbumin，ph7.0)。这一技术目前已经广泛应用于基于核受体与配体相互作用的药物研发中。

fg-4592诱导thrs结合lxxll模序的半最大效应浓度(ec50)如表1所示，相对于对照dmso(二甲基亚砜)，fg-4592极大地增强了thrα与thrβ对辅激活因子src1,src2和src3的募集，但是对辅抑制因子的募集没有影响,说明fg-4592是thrα与thrβ的激动剂。而且fg-4592分别诱导thrβ募集多型辅激活因子的效应均比thrα明显要强。

表1

进一步用浓度梯度fg-4592alphascreen检测表明，fg-4592诱导thrβ结合lxxll模序的半最大效应浓度(ec50)比thrα明显要低，因而fg-4592对thrβ有更强的选择性激活。

实施例2，证明fg-4592增强了thr报告基因的转录激活，是甲状腺激素受体thr的激动剂。

为了进一步给出fg-4592对thr的激活作用，将编码gal4dna结合域、报告基因、thrlbd的质粒共转染到cos7细胞中。使用含有10％胎牛血清的dmem培养基进行cos-7细胞培养，使用lipofectamine2000(invitrogen)试剂盒进行瞬时转染。在gal-4驱动的报告基因实验中，使用200ng的gal4-lbd与200ng的pg5luc(promega)进行共转染。转染后5h加入激动剂化合物。处理24h后，收集细胞用于荧光素酶检测实验。荧光检测实验通过共转染renilla报告基因来做内源参照。实验结果与alphascreen检测结果一致，fg-4592可以显著增强thrα与thrβ的报告基因的转录激活，化合物(5μm)分别诱导thrα和thrβ野生型及突变体报告基因转录活性的效能(efficacy)参见表2，再一次在细胞水平说明fg－4592甲状腺激素受体thr的激动剂，能激活thr介导的基因表达。

表2

实施例3，证明fg-4592对thrβ突变体的转录活性有显著激活，可以用来治疗甲状腺激素抵抗综合征。

表2列出选择多型产生甲状腺激素抵抗综合征的thrβ受体蛋白位点病变体(thehumangenemutationdatabase，http://www.hgmd.cf.ac.uk)。由于这些突变体使thr配体结合域(lbd)构象变化，失去了与甲状腺激素t3、t4的强结合能力。使用quick-changesite-directedmutagenesis试剂盒(stratagene)进行thrβ质粒突变，进行如实施例2的gal-4驱动的报告基因实验。如表2所示，甲状腺激素t3对所有表中突变体的报告基因的转录均失去显著激活。但因为fg-4592与甲状腺激素t3、t4结构显著不同，因而fg-4592能够结合这些thrβ受体蛋白位点病变体，并显著激活它们的转录活性，因而fg-4592可以用来治疗甲状腺激素抵抗综合征。

实施例4，证明fg-4592对thrβ有更强的选择性激活。

如上所述，甲状腺激素受体(thrs)有thrα和thrβ两种亚型，而thrα的激活对心血管系统等有一定的副作用。因此，天然甲状腺激素t3在结合两个thr亚型(thrα和thrβ)方面未显示出任何选择性，现有的甲状腺激素激动剂研发主要是提高对thrβ选择性激活而降低对thrα的激活。针对thrα和thrβ进行如实施例2的gal-4驱动的报告基因实验来获得化合物激活效能(efficacy)，并用全剂量曲线分别计算出效价强度(potency)ec50，化合物分别诱导thrβ和thrα报告基因转录活性的效能比值和效价强度ec50比值参见表3。效能是药物药理学上的一个术语，是指药物产生最大效应的能力，用于评价不同药物的最大效应强弱。效价(potency)：又称效价强度，是指药物产生一定效应所需的剂量或浓度。ec50是半数效应浓度,即引起受试对象50％个体产生一种特定效应的药物剂量。ec50越小表示活性越好、强度越大。如表3所示，与t3相比，fg-4592在效能和效价强度上对thrβ均有更强的选择性激活，因而是thrβ选择性激动剂。

表3

实施例5，证明fg-4592与thrβ结合的复合物的晶体结构解析。

为了从原子水平揭示fg-4592和thrβ相互识别和结合的分子机制，按常规方法解析了fg-4592和thrβ形成复合物的晶体结构(图2)。如实施例1中方法获得thrβ蛋白，加入5倍于纯化后的thrβlbd蛋白量的fg4592，以及2倍于thrβlbd蛋白量的辅激活因子src2-3多肽(enallrylldkd)，待此冰上孵育1h后,浓缩至10mg/ml。结晶时使用hampton公司结晶筛选试剂盒，样品复合物与筛选缓冲液1︰1混合后悬滴法结晶筛选。晶体于室温下约48h长至最好，最好条件为：0.2m柠檬酸钠，20％体积比聚乙二醇3350，晶体在加入冷冻保护剂后直接液氮冻存。冻存的晶体在上海国家同步辐射中心采集数据，数据在被hkl3000处理还原后，结构确定使用ccp4工具软件。手动修饰于coot软件后使用refmac等修饰，待结构参数评估完成后完成结构解析。

结构显示fg-4592与thrβ配体结合域的结合符合经典的“三明治”构象。从三维结构图看，fg-4592清晰地存在于thrβ的配体结合口袋(图2)。在复合物结构中，与fg-4592结合的thrβaf-2螺旋与螺旋h3、h4和h5共同构成一个“口袋”，与辅激活因子src2的lxxll基序发生相互作用。这是一种核受体与激动剂相互作用的典型模式。详细的构效关系分析显示，fg-4592与甲状腺激素受体thrβ配体结合域中氨基酸形成一系列疏水、氢键和范德华力等相互作用(图3)，这些相互作用调控着fg-4592与甲状腺激素受体thrβ的结合。这些结构分析有力地证明了fg-4592调控甲状腺激素受体thr激活作用的典型机制。

本发明涉及一种羟基奎宁化合物，给出在制备一种甲状腺激素受体(thr)的激动剂中，以及在制备预防或治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂中的应用。本发明涉及调节甲状腺激素受体的活性，特别是甲状腺激素受体β(thrβ)的活性，用于预防或治疗甲状腺激素受体介导疾病诸如甲状腺功能低下、甲状腺激素抵抗和抑郁症中的应用。

序列表

<110>厦门大学

<120>化合物fg-4592在制备治疗甲状腺激素受体介导疾病的药物制剂中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>人类(human)

<400>1

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20

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<213>人类(human)

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2025

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<213>人类(human)

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2025