CXCL16蛋白及其单克隆抗体在制备预防和/或治疗肠道损伤性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种放射性肠炎的分子标志物及其单克隆抗体的应用，具体涉及趋化因子CXCL16作为放射性肠炎分子标志物在制备预防和/或治疗肠道损伤性疾病的药物中的应用。

背景技术：

放射治疗是盆腹腔恶性肿瘤包括宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌和膀胱癌等最有效的治疗手段之一，能显著延长中晚期肿瘤患者的生存时间。然而放疗对盆腹腔正常脏器和组织造成的放射性损伤，会引起多种严重的并发症，极大地影响患者的生活质量。其中，放射性肠炎(Radiation enteritis，RE)是最常见的并发症之一，出现在放疗结束后数月甚至数年，发生率高达5％-20％。据国家癌症中心的最新统计数据，我国每年新增盆腹腔恶性肿瘤约73万例，由此带来的RE发病率也将逐年增加。RE以进行性的组织纤维化为特征，其临床症状的多样性及非特异性、辅助检查的局限性，使得临床诊断难度增加，诊疗迁延，最后常出现大出血、直肠坏死和穿孔等严重并发症。然而，目前国内外尚缺乏对RE规范的诊疗指南，故诊疗策略不规范，疗效差，缺乏能有效预防和治疗的靶向药物。针对目前RE的诊疗困境，临床急需能够有效预测和诊断RE的分子标记物并研发预防和治疗RE的靶向分子药物。

趋化因子CXCL16是近年被发现的表达在单核/巨嗜细胞表面的跨膜蛋白，能被基质金属蛋白酶剪切成游离形式。膜结合形式的CXCL16能够调控细菌的粘附和吞噬作用，而游离形式的CXCL16能够趋化和招募表达其特异性受体CXCR6的T和NK细胞调节机体免疫应答。已报道CXCL16在炎症性肠病的发生发展中起着重要的作用，但是CXCL16在放射性肠炎中的作用在现有技术中未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供了CXCL16蛋白及其单克隆抗体在制备预防和/或治疗肠道损伤性疾病的药物中的应用。

本发明第一方面提供了CXCL16单克隆抗体在制备预防或/和治疗肠道损伤性疾病的药物中的应用。

本发明第二方面提供了预测或/和诊断放射性肠炎严重程度的分子标记物。

本发明第三方面提供了预测或/和诊断放射性肠炎严重程度的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

CXCL16单克隆抗体在制备预防或/和治疗肠道损伤性疾病的药物中的应用。

本发明的CXCL16单克隆抗体购于R&D Systems公司，产品信息为：Mouse CXCL16Antibody，MAB503，Monoclonal Rat IgG2A Clone#142417。

优选地，所述肠道损伤性疾病为放射性肠炎。

优选地，所述放射性肠炎为放射性肠炎纤维化。

一种预测或/和诊断放射性肠炎严重程度的分子标记物，所述分子标记物为CXCL16蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

一种预测或/和诊断放射性肠炎严重程度的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测CXCL16 mRNA表达水平的引物，所述引物包括如SEQ ID NO.2～3、SEQ ID NO.6～7和SEQ ID NO.10～13所示的核苷酸序列；以及包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5和SEQ ID NO.8～9所示的内参引物。

本发明的有益效果：放射性肠炎因其症状的多样性及非特异性，临床诊断难度大，目前其病变的严重程度评估主要依靠内镜下评分，然而内镜下评分与临床表现的严重程度往往不一致，目前临床上并没有一种简单、高效的检测手段。本发明可通过检测病人外周血血清中CXCL16 mRNA的表达水平高低就可以判断病人发生放射性肠炎的严重程度，简单、快速、患者顺应性好且费用低。

放射性肠炎的治疗目前以姑息性的对症治疗或手术为主，临床缺乏针对其发病机理研发的能够有效预防和治疗放射性肠炎的靶向药物。本发明经过一系列的人体标本和动物实验验证发现针对CXCL16的单克隆抗体能有效预防和减轻放射性肠道损伤和纤维化。具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为CXCL16在肿瘤放疗病人血液和肠组织中的表达示意图(A为ELISA检测33例放射性肠炎轻的病人和30例放射性肠炎重的病人放疗后血清CXCL16蛋白的浓度；B为RT-PCR检测放射性肠炎轻和重病人肠组织中CXCL16的mRNA相对表达量，管家基因GAPDH的表达值设为内源性对照)。

图2为CXCL16在放射性肠炎小鼠模型中的表达示意图(A为小鼠接受25Gy的直肠电离辐射，ELISA检测辐射组小鼠与正常对照小鼠在照射后4小时、1天、3天、2周、8周和6个月时血清中CXCL16的浓度变化；B为RT-PCR检测照射后不同时间点辐射组小鼠与对照组小鼠直肠组织CXCL16 mRNA表达变化，管家基因GAPDH的表达值设为内源性对照)。

图3为CXCL16基因全身敲除小鼠放射性肠炎纤维化程度降低示意图(A为野生型(WT)和CXCL16基因敲除(KO)小鼠接受25Gy直肠电离辐射8周后直肠组织切片HE染色和马松染色结果：马松染色显示KO组直肠粘膜下层纤维化程度较WT组明显减轻，n＝10只/组；B为RT-PCR检测显示KO组小鼠直肠组织中纤维化标记物I型胶原纤维(COL1A1)和a-SMA(ACTA2)mRNA表达水平较WT组显著降低；管家基因GAPDH的表达值设为内源性对照)。

图4为CXCL16单克隆抗体治疗放射性肠炎动物模型效果示意图(A为野生型小鼠接受25Gy直肠电离辐射，分别进行CXCL16单克隆抗体或对照IgG抗体腹腔注射治疗，8周后直肠组织切片马松染色，结果显示CXCL16单克隆抗体治疗组粘膜下层纤维化层度较IgG对照组显著减轻；B为RT-PCR检测显示CXCL16单克隆抗体治疗组小鼠直肠组织中纤维化标记物a-SMA(ACTA2)mRNA表达较对照组显著降低；管家基因GAPDH的表达值设为内源性对照)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1 CXCL16在放射性肠炎病例中的表达情况

实验对象：

为了检测CXCL16在放射性肠炎病例中的表达，本发明人从中山大学附属第六医院收集了30例直肠癌患者放疗后经临床影像学诊断为放射性肠炎重及33例影像学诊断为放射性肠炎轻的病人手术切除癌旁肠组织标本和放疗后的血清样本。分别用ELISA和qRT-PCR检测其中的CXCL16表达。

实验方法：

1、检测样本血清中CXCL16蛋白表达情况

ELISA检测血清中CXCL16表达实验方法和步骤：CXCL16 ELISA试剂盒购自广州瑞博奥生物科技有限公司，将已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后，在对应的孔加入100μL配制好的标准品及样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜；每孔加入300μL洗液清洗板条4次，每孔加入100μL配制好的检测抗体，室温孵育1h；加300μL洗液清洗4次；每孔加入100μL配制好的HRP-链霉亲和素室温孵育45min；加300μL洗液清洗4次；加入100μLTMB显色液至每孔中，室温避光孵育30min；加入50μL终止液至每孔中，立即在酶标仪450nm读数。采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值。

2、检测样本肠组织中CXCL16 mRNA表达情况

收集上述组织，用Trizol方法提取RNA，使用反转录酶(Toyobo)进行反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行qRT-PCR检测。所用q-PCR引物为：

CXCL16正向：5’-CAATCCCCGAGTAAGCATGT-3’(SEQ ID NO.2)

CXCL16反向:5’-CTACACGAGGTTCCAGCTCC-3’(SEQ ID NO.3)

GAPDH正向：5’-AGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’(SEQ ID NO.4)

GAPDH反向:5’-GTCATGAGTCCTTCCACGATAC-3’(SEQ ID NO.5)

实时荧光定量PCR反应体系和反应程序如表1、2所示：

表1：Q-PCR反应体系

表2：Q-PCR反应程序

CXCL16在放射性肠炎病例中的表达情况结果，如图1所示，放射性肠炎表现重的患者血清CXCL16蛋白的浓度显著高于放射性肠炎表现轻的患者(图1A)；荧光定量PCR结果显示，放射性肠炎表现重的患者其肠组织中CXCL16的mRNA表达显著高于放射性肠炎表现轻的患者(图1B)。

实施例2 CXCL16在放射性肠炎动物模型中的表达情况

1、放射性肠炎动物模型的构建

C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物研究所。小鼠8周龄时，用X射线直线加速器进行单次照射(25Gy)。将小鼠麻醉后固定，暴露照射范围自耻骨联合至肛门(肛门往上长1.5cm、宽1.0cm的矩形面积)，其他部位以4mm厚铅块屏蔽，以8MV-X线直加速器照射。分别在照射后4小时、1天、3天、2周、8周和6个月每个时间点处死5只照射小鼠及5只未照射的正常对照小鼠，处死前眼球一次性采血，并收集小鼠直肠组织放RNA later液保存。

2、动物模型血清和肠组织中CXCL16蛋白和mRNA表达水平检测

(1)ELISA检测小鼠血清CXCL16蛋白表达试剂盒购买及实验方法采用实施例1人血清标本检测方法。采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值。

(2)QPCR检测小鼠直肠组织中CXCL16 mRNA表达水平：用Trizol法提取上述收集的肠组织RNA，使用反转录酶(Toyobo)进行反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行qRT-PCR检测。逆转录反应体系配置如表3所示：

表3：逆转录反应体系

将以上反应液轻轻地混匀后，在37℃条件下温育5min后，取逆转录反应体系的反应液8ul加入5×RT Master MixⅡ2ul，总体积10ul，将反应液轻轻混匀后，按以下条件进行逆转录反应：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，hold。

将上述小鼠肠组织cDNA样本进行荧光定量PCR反应，检测CXCL16mRNA的表达情况。引物信息如表4：

表4：Q-PCR检测肠组织中CXCL16表达水平引物信息

荧光定量PCR反应体系配置和反应程序如表5、6所示：

表5：荧光定量PCR反应体系

表6：荧光定量PCR反应程序

数据分析：读取每个样品的CT值，并用公式计算：2^{-[(Ctof CXCL16)–(Ctof GAPDH)]}计算每个样品中CXCL16的相对表达量。

动物模型血清和肠组织中CXCL16蛋白和mRNA表达水平检测结果，如图2所示，每个时间点辐射组小鼠血清中的CXCL16蛋白浓度显著高于正常对照组小鼠(图2A)；荧光定量PCR结果显示，每个时间点辐射组小鼠直肠组织中CXCL16的表达显著高于正常对照组小鼠(图2B)。

实施例3 CXCL16基因敲除显著抑制放射性肠炎纤维化

1、CXCL16基因全身敲除小鼠的构建

CXCL16基因全身敲除小鼠委托上海南方模式生物有限公司构建，利用CRISPR/Cas9技术，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成CXCL16基因蛋白读码框移码，功能缺失。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配，获得CXCL16基因敲除的F1杂合子小鼠。

2、CXCL16基因敲除小鼠放射性肠炎纤维化模型建立

将获得的CXCL16基因敲除的F1杂合子小鼠自交得到的F2代野生型(WT)和纯合子敲除鼠(KO)各10只，使用前述方法构建放射性肠炎动物模型，照射8周后处死实验小鼠，收集直肠组织标本分别放入福尔马林固定液中固定和RNA later液中保存。将固定组织进行石蜡包埋、切片，进行HE和马松染色观察直肠损伤和纤维化情况；对RNA later液保存组织进行Trizol法提取RNA、逆转录、荧光定量PCR检测纤维化标记物I型胶原纤维(COL1A1)和a-SMA(ACTA2)mRNA表达水平，实验方法同实施例2中RT-PCR检测方法。引物信息如表7：

表7：Q-PCR引物信息

结果如图3所示，说明CXCL16基因敲除小鼠直肠损伤程度和纤维化程度明显比野生型小鼠轻，纤维化标记物表达水平较野生型明显低。

实施例4CXCL16单克隆抗体对放射性肠炎的治疗效果

C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物研究所。使用实施例3的方法进行照射构建放射性肠炎动物模型后，随机分成两组，在照射后前三周进行每周一次的CXCL16单克隆抗体液或对照组IgG(购自美国R&D systems)腹腔注射，CXCL16单克隆抗体治疗组10只动物，IgG对照组9只动物，每只小鼠抗体注射量为100ug/次，照射8周后处死动物，收集小鼠直肠组织分别放入福尔马林固定液中固定和RNA later液中保存。对固定组织进行石蜡包埋、切片，行HE和马松染色。对RNA later液保存组织进行Trizol法提取RNA、逆转录、荧光定量PCR检测纤维化标记物ACTA2的表达水平，实验方法同实施例2中RT-PCR检测方法，引物序列见表7。

结果如图4所示，说明CXCL16单克隆抗体治疗组小鼠直肠损伤程度和纤维化程度明显比对照小鼠轻，纤维化标记物表达水平较对照小鼠明显低。

以上实验数据均足以证明血清CXCL16蛋白表达可以作为放射性肠炎严重程度的预测和诊断指示剂，同时CXCL16单克隆抗体可以作为预防和治疗放射性肠炎纤维化和肠道损伤的有效药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学附属第六医院

<120> CXCL16蛋白及其单克隆抗体在制备预防和/或治疗肠道损伤性疾病的药物中

的应用

<130> 6.11

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Met Ser Gly Ser Gln Ser Glu Val Ala Pro Ser Pro Gln Ser Pro Arg

1 5 10 15

Ser Pro Glu Met Gly Arg Asp Leu Arg Pro Gly Ser Arg Val Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Tyr Leu Thr Gln Pro Gly Asn Gly

35 40 45

Asn Glu Gly Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser

50 55 60

Ser Asp Ser Pro Pro Ser Val Gln Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His

65 70 75 80

Leu Arg Ala Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu

85 90 95

Ser Trp Ser Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu

100 105 110

Met Ser Cys Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly Ile

115 120 125

Val Ala His Gln Lys His Leu Leu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Ser Gln

130 135 140

Ala Ser Glu Gly Ala Ser Ser Asp Ile His Thr Pro Ala Gln Met Leu

145 150 155 160

Leu Ser Thr Leu Gln Ser Thr Gln Arg Pro Thr Leu Pro Val Gly Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Asp Lys Glu Leu Thr Arg Pro Asn Glu Thr Thr Ile His

180 185 190

Thr Ala Gly His Ser Leu Ala Ala Gly Pro Glu Ala Gly Glu Asn Gln

195 200 205

Lys Gln Pro Glu Lys Asn Ala Gly Pro Thr Ala Arg Thr Ser Ala Thr

210 215 220

Val Pro Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile Ile Phe Ile Leu Thr Ala Ala

225 230 235 240

Leu Ser Tyr Val Leu Cys Lys Arg Arg Arg Gly Gln Ser Pro Gln Ser

245 250 255

Ser Pro Asp Leu Pro Val His Tyr Ile Pro Val Ala Pro Asp Ser Asn

260 265 270

Thr

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caatccccga gtaagcatgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctacacgagg ttccagctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agcctcaaga tcatcagcaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtcatgagtc cttccacgat ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggctttggac ccttgtctct tg 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttgcgctcaa agcagtccac t 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aagggtggag ccaaaaggg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgggggtagg aacacggaa 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gagaggtgaa caaggtcccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aaacctctct cgcctcttgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gtaccaccat gtacccaggc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gctggaaggt agacagcgaa 20