活性无细胞真皮基质的制作方法

专利名称:活性无细胞真皮基质的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，更具体地涉及用于皮肤移植的活性无细胞真皮基质及其制备方法。
背景技术：
全层皮肤缺损创面的现代治疗仍以移植刃厚自体皮(即薄皮)为主。由于刃厚自体皮含有较少的真皮成分，创面愈合后会产生不同程度的疤痕增生。若移植较厚的自体皮，则往往在供皮区造成明显的疤痕增生。
1981年Bell等人利用提取的天然胶原蛋白与成纤维细胞按一定的比例混合，形成一个真皮层。再将表皮细胞悬液接种在这个真皮层上，制成一个类似正常皮肤的复合皮。
Hznsbrough也利用可被生物降解的聚合物作为细胞生长的基质框架，在体外将新生儿成纤维细胞接种于基质框架内。随着细胞在框架上的生长，它们不断地分泌出许多蛋白质和糖蛋白等成分，充填在网状框架中，形成一个天然的细胞外基质。经过实验表明这个具有生命活性的真皮替代物覆盖在深度创面上能够迅速血管化，并且覆盖在其上的自体表皮也随之上皮化。
Heck于1985年报道，以同种异体真皮作为自体表皮的移植载体并应用于大鼠和人体上。他采用经过冷冻处理过的天然同种异体皮肤通过真空吸引法将所得的自体皮覆盖在异体真皮表面。
上述的一些复合移植方法，已部分建立具有类似真皮的结构和功能。植皮区创面变得光滑、平整；减少了疤痕增生，愈后功能也较为完善。
Cuono等人借助体外培养后的单层表皮细胞，覆盖于去除表皮的异体真皮表面。这种方法虽然已初步应用于临床，但效果难以肯定。原因是这种方法虽然脱除了表皮，从而降低了免疫抗原性，不会招致急性排斥反应，但是由于保留了真皮层内含有的表皮细胞成分、成纤维细胞和血管内皮细胞等，它们依然会引发机体产生免疫排斥反应。
1995年美国生命细胞公司的Livesey[Livesey SA，Herndon DN，Hollyoak MA，et alTransplanted Acellular Allograft Dermal Matrix.Transplantation，1995，60(l)1～9]等首先报道了无细胞真皮基质的制备方法。同年美国的Wainwright[Wainwright DJUse of an Acellular Allograft Dermal Matrix(AlloDerm)in the Management of Full-thickness Burns.Burns，1995，21(4)243～248]首先报道了无细胞真皮基质的临床应用，引起了国际烧伤学界的广泛重视；国内许多单位也相继开展了临床应用，其应用范围扩大到整形外科，领面外科等，取得了较好的临床效果。
无细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix，ADM)是一种用于全层皮肤缺损创面的真皮替代物，来源于天然皮肤。它是天然皮肤经过一定的理化方法处理后，去除了表皮和真皮中所有细胞成分，但保留了真皮的胶原成分和其三维空间结构，同时也保留了基底膜复合物。由于去除了皮肤中具强抗原性的细胞成分，而仅残留具微弱抗原性的胶原蛋白等细胞外基质成分，同时由于它具有天然真皮结构，可以诱导移植后宿主的细胞成分(如成纤维细胞、内皮细胞等)循其支架结构生长，真皮基质还可支持成纤维细胞的浸润、新生血管形成，使成纤维细胞合成和分泌具有正常结构和功能的细胞外基质如胶原，使肉芽组织快速成熟及真皮深层再生，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并与其上移植的自体表皮成分融合，形成较为完整的皮肤结构，基本恢复了皮肤原有的功能，从而产生了良好的少疤或无疤的临床效果。无细胞真皮基质与自体表皮复合移植是目前治疗需要植皮的全层皮肤缺损中很有前途的方法。
然而，无细胞真皮基质应用过程中遇到的突出问题是无细胞真皮基质移植后，在短时间(3～5天)内，如未能与创面基底建立良好的血液循环，则可引起严重的不良后果，表现为(1)移植物抗感染能力差，易因发生感染导致移植失败；(2)未能为其上移植的自体表皮提供足够的营养，从而影响后者的存活。
因此，本领域迫切需要提供新的、有效治疗全层皮肤缺损创面的移植物。

发明内容
本发明的目的就是提供一种新的有效治疗全层皮肤缺损创面的移植物及其制法。
在本发明的第一方面，提供了一种移植物，它包括(a)真皮基质，所述的真皮基质基本上不含细胞；(b)有效量的选自下组的细胞因子成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物。
在一优选例中，所述的真皮基质还含有基底膜复合物。
在另一优选例中，所述的真皮基质中细胞数量小于5％，较佳地小于1％，更佳地小于0.5％，最佳地小于0.1％，按真皮基质的体积计。
在另一优选例中，所述的细胞因子选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子或其混合物。
在另一优选例中，所述的有效量是100-30000AU/立方厘米。
在另一优选例中，所述的真皮基质的厚度是0.2-2mm，且所述的细胞因子是碱性成纤维细胞生长因子。
在另一优选例中，所述的真皮基质来自下列动物的皮肤猪、牛、人、鼠。
在本发明的第二方面，提供了一种制备移植物的方法，包括步骤(a)提供一真皮基质，所述的真皮基质中基本上不含细胞；(b)将真皮基质与选自下组的细胞因子接触，从而使真皮基质中含有浓度为100-30000AU/立方厘米的所述细胞因子成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物。
在一优选例中，在步骤(b)中，用无针高压注射枪用所述细胞因子的溶液注入真皮基质中；且所述的溶液的浓度是240-24000AU/ml或0.1-10ng/ml。
在另一优选例中中，所述的细胞因子是碱性成纤维细胞生长因子。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，它含有本发明所述的移植物和任选的其他试剂和说明书。
具体实施方式
针对上述本领域存在的问题，本发明人经过深入而广泛的研究，发现通过加入能促进血管生成的生长因子，可促使无细胞真皮基质移植后在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善其移植效果。在此基础上完成了本发明。
术语术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子或分离的细胞因子。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某病人中取出并再施用于另一不同病人的方法。
术语“同基因移植”指在遗传上相同的人之间发生的细胞移植。
无细胞真皮基质可用于本发明的无细胞真皮基质没有特别限制，可以是用来源人、猪、牛等哺乳动物的天然皮肤，通过已知方法制备的无细胞真皮基质。
就无细胞真皮基质的主要成分而言，为去除了正常皮肤中的表皮成分和真真皮中所有细胞成分，而保留了真皮中的胶原成分和其三维空间结构，同时较佳地还保留了基底膜复合物。无细胞真皮基质中的胶原为存在于基质中的III型胶原，存在于基底膜中的III型、VII型胶原。另外，基质中还有弹力纤维、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、氨基聚糖。
在本发明的真皮基质中，细胞数量小于5％，较佳地小于1％，更佳地小于0.5％，最佳地小于0.1％，按真皮基质的体积计。一种简便的检测方法是在光学显微镜高倍视野(×40)下观察时，细胞计数小于3只，较佳地小于2个，更佳地小于1只。
一种优选的真皮基质还含有基底膜复合物，其作用是加强真皮和表皮之间的连接，并改善皮片愈合后的质量。
无细胞真皮基质的厚度没有特别限制，通常约为0.2-2mm，更佳地约为0.30-0.50mm。
无细胞真皮基质的大小没有特别限制，可以根据创面不同而制作，也可以制作成例如100mm×100mm的特定规格，然后在使用时裁剪下所需大小的真皮基质。
促进血管生成的细胞因子如本文所用，术语“促进血管生成的因子或细胞因子”指对血管生成有促进或激活作用的物质，主要包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-o(transforming growth factor-α，TGF-α)等。优选的细胞因子是FGF(包括碱性成纤维细胞生长因子bFGF)和VEGF，最佳的是成纤维细胞生长因子bFGF。
VEGF血管内皮细胞生长因子被认为是作用最强、特异性最高的促内皮细胞增殖、迁移的调控因于。在创面愈合过程中，VEGF促进创面血管化；迄今只发现血管内皮细胞对VEGF有高特异性的增殖反应，还未见其它细胞对VEGF反应的报道。因此，创面组织中VEGF的多少与血管形成密切相关。此外，VEGF参与调节血管内皮细胞(endothelial cell，EC)迁移、增殖和管样结构的形成。VEGF不足会导致血管腔闭合、血管退化。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是哺乳动物和人体内存在的一种非常微量的多肽类物质，能刺激中胚胎层和外胚胎层来源的细胞如成纤维细胞、血管内皮细胞等的分裂和增殖，生理功能非常广泛。bFGF对创伤修复过程的三个阶段，即局部炎症反应阶段、细胞增殖分化及肉芽组织形成阶段、组织重建阶段均有显著的促进作用。在细胞增殖和修复期，最关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，bFGF正是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够强烈刺激新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质。所以，创面bFGF的含量与创面愈合中新生血管的形成密切相关。
利用bFGF和VEGF等生长因子的这种生物作用，可以提高无细胞真皮基质移植后的存活率，进而改善其移植效果。VEGF来源有限，价格昂贵，限制了其应用。
近十年多来，国内外生物学和医学工作者对bFGF进行了广泛而深入的基础和应用研究。美国、日本、法国等发达国家都投入大量力量研究和生产基因重组bFGF；中国国家科委也相继将bFGF的研究列入“八五”和“九五”攻关项目。1998年，中国自己研制的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)获得卫生部颁发的正式生产批文，标志着bFGF终于完成了从实验室到产业化的历程。
可用于本发明的各细胞因子的来源没有特别限制，可以使用天然的、分离的、重组的或合成的细胞因子，而分离、重组表达和/或人工合成各种细胞因子的技术是本领域中已知的。此外，还可从市场上购得各细胞因子，例如bFGF可购自珠海东大集团东大生物工程公司。
其他添加剂在本发明的活性无细胞真皮基质中，除了含有上述的促进血管生成的细胞因子之外，还可以含有其他一些添加剂，例如防止伤口感染发炎的抗生素、防止生长因子降解的保护剂(如肝素)。
制备方法在获得了无细胞真皮基质和纯化的细胞因子后，将真皮基质与细胞因子接触，从而使真皮基质中含有有效量的细胞因子。如本文所用，与细胞因子连用的术语“有效量”指为了实现所需水平的细胞增殖而所需要的增殖因子的量。特定的细胞增殖因子的有效量取决于各种变量因素，其中包括，所需的增殖水平、某个因子是否与其他因子一起使用以及待增殖的细胞类型。例如，对于bFGF而言，其有效量通常为为100-30000AU/立方厘米，较佳地200-10000AU/立方厘米，更佳地500-7500AU/立方厘米，最佳地1000-5000AU/立方厘米。
在本发明中，制备方法没有特别限制，只要该方法能使细胞因子均匀地分布在真皮基质之中和或之上即可。例如，将无细胞真皮基质在含细胞因子的溶液中放置(孵育)一段时间。
有二种制备方法是特别优选的。第一种是用无针高压注射枪(例如可购自MadaJet XL，USA的无针高压注射枪)将促进血管生成的生长因子注入无细胞真皮基质中。这种方法的优点是利用压力使细胞因子均匀地渗透到真皮基质之中，并能维持一定时间(约24-48小时或更长)。
第二种方法是在无细胞真皮基质与创面基底交界处加入一定浓度的促进血管生成的生长因子。这种方法的优点是简单方便，缺点是生长因子较难渗透入真皮基质中且维持时间短。
这两种方法都能促使内皮细胞长入无细胞真皮基质并形成毛细血管，从而提高无细胞真皮基质移植成功率从而改善其移植效果。
创面愈合过程中血管化的检测，可通过检测以下指标进行。
1)VIII因子，又称血友病因子或VWF。血管内皮细胞能分泌释放VIII因子，带有标记物的VIII因子抗体与血管内皮细胞膜上的VIII因于抗原特异性结合，通过显色反应，使血管内皮细胞显色。
2)CD31血小板内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesionmolecule)。CD31是一种130Kda整合粘膜蛋白，属于免疫球蛋白超基因家族，介导细胞与细胞粘附。CD31在内皮细胞中持续表达，因此可以作为血管化标志。
3)CD34，在内皮细胞粘附过程中，扮有重要角色，是血管形成的重要标志。实验研究显示，在创面新生生成的血管，其CD34表达普遍增加，抗CD34抗体能很好标记内皮细胞，并能区分新生血管和正常组织血管。
上述这些指标可应用免疫学和组织化学原理进行检测，并对创面组织切片中血管内皮细胞带有的抗原进行显色，利用光学显微镜对创面组织中的微血管计数，从而得出创面组织中的微血管密度，反映创面的血管化程度。
本发明的实验已表明，使用本发明的活性无细胞真皮基质后，能促使无细胞真皮基质移植后在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，从而改善其移植效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1活性无细胞真皮基质的制备在该实施例中，通过以下步骤制备活性无细胞真皮基质，以下步骤均要求无菌操作。
步骤一清洁级SD大鼠，背部脱毛后24小时，切取背部全厚皮肤(大小约15×20平方厘米)；在取皮鼓上反取中厚皮；①去表皮处理加入2.5单位/ml分散酶II(Dispase II，Roche公司)，4℃条件下作用24小时，在作用结束后以弯头皮镊揭除表皮，并吸去去表皮液。②脱细胞处理加入0.5％十二烷基硫酸钠(SDS，简称去污剂)160ml，20～26℃作用24小时；吸除去污剂，用Hanks液冲洗两遍，最后，吸除Hanks液，即可得到无细胞真皮基质。然后将其置于含青霉素(100u/ml)、氯霉素(100μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的Hanks液中，4℃保存备用。
合格的无细胞真皮基质符合以下要求去除了表皮和真皮中所有细胞成分，包括完整的细胞和细胞碎屑(细胞碎屑≤1/10个高倍视野)，但保留了真皮的三维空间结构，保留了基底膜复合物。
步骤二含5毫升的240、2400、24000AU/ml(0.1、1、10ng/ml)的bFGF溶液，以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)注入无细胞真皮基质，得到含bFGF无细胞真皮基质。获得的活性无细胞真皮基质中bFGF的浓度分别约为150AU/立方厘米，1500AU/立方厘米，和15000AU/立方厘米。
实施例2活性无细胞真皮基质的动物试验在该实施例中，利用动物实验进行测试。测试方法如下选择一定数量的清洁级SD大鼠，背部脱毛后24小时，用手术刀在人鼠背部切取一定大小的全层皮肤，在鼓式取皮刀上反取刃厚皮，作为白体皮。创面随机分为三组组1创面作为实验创面，止血后，先移植在实施例1中制备的活性无细胞真皮基质，然后在其上移植自体皮，加压包扎；组2创面作为实验创面，止血后，加入浓度为240～24000AU/ml或0.1～10ng/ml的bFGF(体积为5-10毫升)，然后先后移植无细胞真皮基质和自体皮，加压包扎；
组3创面作为对照创面，止血后，不加入bFGF，但同样先后移值无细胞真皮基质和自体皮，加压包扎。
二周后，上述每组动物均于取材后处死。取材时每组动物再随机分为二小组。第一小组动物打开创面，取标本，其石蜡切片免疫组织化学检测VIII因子(vonWillebrand因子)、CD31和CD34；第二小组动物，静脉注射Evans Blue(EB)染料后处死动物，取标本，石蜡切片，HE染色后光镜下观察[按Record R，Tuttle P，Tullius R，et alQuantitative Assessment of Angiogensis in Response toImplants.Tissue Engineering，2001，7(5)637中所述的方法]。利用光学显微镜对上述切片创面组织中所标记的微血管计数，可以得出创面组织中的微血管密度。
根据创面组织中所标记的微血管计数值，比较添加与不加细胞因子，以及不同添加方法所产生的创面不同血管化程度。结果如下●加入促进血管生成的生长因子后的活性无细胞真皮基质，能促使无细胞真皮基质移植后在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高了移植成功率、改善移植效果。
●组1的效果优于组2的效果。
实施例3活性无细胞真皮基质的制备基本上按实施例1的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于选用的皮肤是脱毛后的猪皮。
实施例4活性无细胞真皮基质的制备基本上按实施例1的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于，用浓度为2500AU/ml的VEGF替换bFGF。
实施例5活性无细胞真皮基质的制备基本上按实施例1的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于，用浓度2500AU/ml VEGF和浓度为2500AU/ml bFGF的混合溶液替换原bFGF溶液。
实施例6活性无细胞真皮基质的动物试验基本上按实施例2的方法，对实施例3-5中制备的活性无细胞真皮基质进行动物实验。结果表明，这些活性无细胞真皮基质可在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善移植效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
权利要求
1.一种移植物，其特征在于，它包括(a)真皮基质，所述的真皮基质中细胞数量小于5％，按真皮基质的体积计；(b)有效量的选自下组的细胞因子成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物，其中所述的有效量是100-30000AU/立方厘米。
2.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质还含有基底膜复合物。
3.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质中细胞数量小于1％，按真皮基质的体积计。
4.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的细胞因子选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子或其混合物。
5.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的有效量是200-10000AU/立方厘米。
6.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质的厚度是0.2-2mm，且所述的细胞因子是碱性成纤维细胞生长因子。
7.如权利要求
1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质来自下列动物的皮肤猪、牛、人、鼠。
8.一种制备移植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)提供一真皮基质，所述的真皮基质中的细胞数量小于5％，按真皮基质的体积计；(b)将真皮基质与选自下组的细胞因子接触，从而使真皮基质中含有浓度为100-30000AU/立方厘米的所述细胞因子成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物。
9.如权利要求
8所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，用无针高压注射枪用所述细胞因子的溶液注入真皮基质中；且所述的溶液的浓度是240-24000AU/ml或0.1-10ng/ml。
10.如权利要求
8所述的方法，其特征在于，所述的真皮基质中细胞数量小于1％，按真皮基质的体积计。
11.一种试剂盒，其特征在于，它含有权利要求
1所述的移植物。
专利摘要
本发明提供了一种用于皮肤移植的活性无细胞真皮基质及其制备方法。所述的基质含有(a)真皮基质，所述的真皮基质基本上不含细胞；(b)有效量的选自下组的细胞因子成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物。本发明的活性无细胞真皮基质可在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善移植效果。
文档编号A61L27/60GKCN1274370SQ02112455
公开日2006年9月13日 申请日期2002年7月10日
发明者陆树良, 向军, 贾生贤 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan