专利名称：疫苗及其制备方法
本申请是美国专利申请909，964号的部分继续申请。
本发明涉及一种疫苗，更确切地说涉及一种含有细菌鞭毛的疫苗，该细菌鞭毛与抗原部分结合时，可增强对抗原的免疫应答。
疫苗在此被定义为一种抗原部分的悬浮液，通常包括侵染剂，或侵染剂的某些部分，注入机体可产生自动免疫。组成疫苗的抗原部分可以是从微生物提纯而来的天然产品，也可以是一种合成产品或通过遗传工程生产的蛋白质，肽或类似的产品。佐剂在此被定义为任何与所注射的免疫原相混合即可增强免疫应答的物质。半抗原在此被定义为一种可选择性地与适宜的抗体反应的物质，但半抗原本身通常不是免疫原。大多数半抗原都是小分子，但有些大分子也能起半抗原的作用。结合在此被定义为两个或多个分子的共价或其它形式的连接。
60年前，证实了通过接种作为与化脓菌或与各种添加化合物的混合物的疫苗有可能增强对白喉和破伤风的抗毒素反应。从那时起，医务人员和免疫学家就试图用佐剂加强免疫应答，同时试图减小经常出现的副作用。
生物合成和重组DNA技术使具有抗原决定簇的疫苗发展起来，抗原决定簇以前是不可能产生的。例如，目前可使用的疫苗包括在致免疫方面模仿链球菌，淋球菌和口蹄疫，爱滋病(HIV-1病毒)和疟性抗原的合成肽。
对寄生物病疟疾的研究尤为重要。这种疾病每年在世界范围内侵袭2亿以上的人，从发病率和失业率来看它是世界上最严重的疾病。遗传工程技术已被用于鉴定，并且已经大量生产出几种疟原虫的蛋白。特别是，一种来自子孢期的12个氨基酸的肽已被确定为担负着重要的抗原位点。抗该特殊肽的抗体在注射后可立即杀死寄生物。令人遗憾的是，这种肽本身不能产生适当的免疫应答。
为了诱导对子孢子肽的有效的免疫应答，与肽同时注入了佐剂。然而，到目前为止，与肽一起使用的佐剂尚未产生令人满意的结果。因此，在发展可增强半抗原的抗原决定簇的免疫原性的有效，无毒性佐剂方面已引起人们的关注。此外，还需要与常规的疫苗一起使用时，能引起更早的，更有效的，或更持久的应答的佐剂。当抗原的供给受到限制或生产抗原较昂贵时，这种佐剂也将是很有用的。
直到最近，佐剂的开发一直是以经验为根据的。已经发现了大量可调节免疫应答的化合物。这些化合物在物质和功能方面显然是多种多样的，即很难发现统一的佐剂作用机制。这些机制的阐明落后于目前在了解免疫系统方面的进展。
佐剂的这种多样性给其分类上带来了困难。这些佐剂有时可按其来源分类，如为矿物质细菌产物，植物产物，合成产物，或宿主产物。按此分类法第一类是非细菌佐剂，如铝化物。1926年描述了铝化物作为佐剂的首次应用。从那时起，用铝盐沉淀的抗原或与铝化物混合的抗原或吸附到铝化物上的抗原就一直广泛用于增强动物和人的免疫应答。铝化物和类似的佐剂可能通过下列机制起作用使抗原的分泌减慢，从而延长抗原与出现抗原的细胞(如巨噬细胞或滤泡-树状细胞)之间的相互作用时间。此外，使免疫活性细胞聚集到感染区域。在免疫后7天兔的局部淋巴结中已证实了铝颗粒的存在，并且另一个重要功能可能是抗在淋巴结本身含T细胞区域的抗原。佐剂的效价显示出与淋巴结的炎症相关联。许多研究已进一步证实与铝盐一起给药的抗原导致体液免疫增强，而细胞免疫只稍有增强，这一点可通过延迟型超敏反应来测定。氢氧化铝也已被描述为可激活补充途径。这一机制在局部炎症应答以及免疫球蛋白生产和B细胞记忆方面可起一定作用。疏水物部分的平均集合分子量在大约4000至8000道尔顿之间;b是使聚氧丙烯(POP)占八嵌段共聚物总分子量约60%至90%的数。
鞭毛可用作引导抗体对小的抗原决定簇如半抗原，药物，肽类起长期，高效价和高亲合力的反应的非常有效的佐剂。肽类可以是合成性或遗传工程制成的。遗传工程制成的肽举例有那些现在可获得的用于疟疾病的肽。改进的疫苗包括小的抗原决定簇与鞭毛的结合物，它可用来透导强烈并长期的胸腺依赖IgG抗体反应。
因此，本发明的一个目的是提供一种疫苗，它对产生对小免疫原性决定簇的长期并强烈的免疫反应特别有效。
本发明的另一个目的是提供一种有效的疫苗，它可以应用一种合成肽，如疟疾病肽，以产生能使个体免受疟原虫侵袭的持久性的免疫反应。
本发明的另一目的是提供一种有效的疫苗，它可以利用爱滋病毒的合成性肽以产生有效地防治该疾病的免疫反应。
本发明的另一目的是提供一种疫苗，它能刺激动物或人的免疫系统产生对小的免疫原决定簇如肽或半抗原的强烈并长期的IgG反应。
本发明的另一目的是提供一种很少或不引起局部变态反应的疫苗。
本发明的另一目的是提供一种可以被冷冻干燥的疫苗。
本发明的另一个目的是提供可以与疫苗制剂一起使用的佐剂。
本发明的这些目的以及其它目的，特点以及优点，在阅读了以下的发明详述和权利要求书后会变得更加明显的。
图1显示了用结合有沙门氏菌鞭毛蛋白的三硝基酚(TNP)所免疫的小鼠的抗体效价。
图2显示了用结合有沙门氏菌鞭毛蛋白的TNP所免疫的小鼠的剂量反应。
图3显示了用结合有鸡胚清蛋白(hEA)的TNP免疫的小鼠与用结合有沙门氏菌鞭毛蛋白的TNP所免疫的小鼠之间的免疫反应比较结果。
首先由于铝化物非常安全，所以目前它们是最常用的人类佐剂。然而，它们并非没有问题。含有铝的疫苗有时可引起局部反应。虽然变应性现象通常不是临床问题，但据说铝化物还是通过依赖T细胞的机制将嗜曙红细胞吸引到感染区域，如果在抗原活化后注射铝化物，则可诱导IgE应答，并可得到对IgE应答具有辅助功能的带特异性菌体的细胞群。此外，不能将含有铝的疫苗冻干，因而必须冷藏运输和贮存，因而有被污染的危险。
最后，最重要的问题是，铝化物在诱导持久的防御疾病能力方面不总是成功的。因此尽管铝盐一直是对只需抗体应答的强免疫原来说足以产生保护作用的佐剂，但当其与弱免疫原类的疟疾合成肽一起用来引导许多感染所需类型的细胞免疫应答时是无效的。
另一大类佐剂是细菌来源的佐剂。近来这类佐剂已被纯化和合成(如胞壁酰二肽，类脂A)并且宿主介体已被克隆(白细胞介素1和2)，提供了用于研究的化学特征化产品。近十年已在细菌来源活性成分的三种佐剂的化学纯化方面取得很大进步，这三种佐剂是百日咳博代氏杆菌(Bordetellapertussis)，脂多糖和弗氏完全佐剂。
由于百日咳博代氏杆菌能够通过对T-淋巴细胞群的作用增强细胞免疫，所以是值得关注的。对于脂多糖和弗氏完全佐剂，佐剂的有效部分已被鉴定并合成，这些有效部分可用来研究结构与功能的关系和有可能修饰原始佐剂以产生一个更有益的毒性治疗比例。
已经发现脂多糖及其各种衍生物(包括类脂A)在与脂质体或其它脂类乳剂结合时是强效佐剂。这些具有足够慢的毒性用于人类的衍生物是否能够生产尚无定论。弗氏完全佐剂是多数试验研究的标准。然而，它可引起严重的局部或全身性发炎反应，其严重程度足以使宿主丧失活动能力或杀死宿主。所以不能将它用于人。
佐剂也可以通过其所推荐的作用机制来分类。这种分类类型必然有几分任意性，因为多数佐剂可能通过一个以上的机制起作用。佐剂可通过抗与天然蛋白分子结合的决定簇也已被证明分别有利于协助作用和抑制作用。免疫原载体与抗原的结合能够改变在对该抗原的应答中产生的同型抗体。来自各种被囊细菌的纯化多糖是胸腺依赖抗原，这是由于其具有多重抗原决定簇的多出性。当它们代表这些细菌的保护性抗原时，所产生的IgM抗体就限制了预防疾病的效能。因此，来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)和流感嗜血杆菌(Haemophilnsinfluenza)b型的多糖已与蛋白(如破伤风类毒素)结合。这些结合制剂以胸腺依赖抗原的身份而起作用并诱导对多糖部分的IgG应答以及免疫记忆。同样，非胸腺依赖多糖载体对增强小肽的免疫原性没有多大潜力，例如对于需要胸腺依赖IgG免疫应答的疟疾来说所涉及的那些小肽。
Feldmann和Lee的出版物阐述了沙门氏菌的鞭毛抗原是典型的可刺激强烈的IgM抗体应答的非胸腺依赖抗原(见Feldmann，M，etal.，“TheRelationshipbetweenAntigenicStmcetureandtheRequirementforThymus-derivedcellsintheImmuneResponse”，J.Exp.Med.，Vol.134，pp103-119，1971;andLee，etal.，“DeclineandSpontaneousRecoveryoftheMonoclonalRerponsetoPhosphorylineduringRepeatedInmunization”J.Immun.，Vol.113，pp1644-1646，1974)。这一公开的资料将使人们相信对于需要胸腺依赖IgG抗体应答的疟疾肽或其它小抗原来说非胸腺依赖抗原作为佐剂或载体没有多大潜力。
很可能没有区分载体与佐剂的精确转变点。显然，载体部分有助于被称为固有佐剂性的抗原特性。通过使蛋白聚集或吸附到免疫原载体或惰性载体上可增加抗原的大小，从而增强佐剂性。因此吸附抗原和增强免疫应答的物质，如氢氢化铝，乳汁粒，皂土，或脂质体都被称为佐剂。然而，这一抗原聚集的观察结果只代表有限的佐剂作用的观察，而佐剂作用现被公认为是相当复杂的。原定位和释放，或通过对构成免疫系统的细胞(如肥大细胞和淋巴细胞)的直接作用而起作用。佐剂可借以增强免疫应答的另一种机制是通过造成抗原贮存而起作用。这将有助于铝化物，油乳剂，脂质体，和合成聚合物的佐剂活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐剂活性似乎主要通过巨噬细胞的激活作为媒介，而百日咳博代氏杆菌同时侵袭巨噬细胞和淋巴细胞。最近推测的免疫增强法，如单核细胞激活素和淋巴激活素的利用，和抗原，载体，增强免疫应答的佐剂的操作是普遍盛行的。
小的免疫原，如疟疾合成肽，可与较大的蛋白或其它载体连接增强免疫应答。分子大小和与免疫原性有关的抗原的复杂性之间的关系影响分子上抗原决定簇的有效性。这种关系首先是由Landsteiner注意到的，那时他证实了为了刺激免疫应答需要复杂的具有较大(载体)分子的小基团。然而，所需要的机制基础有待于试验，试验结果证实了载体的作用和用来表达免疫原性的分子上的两个抗原决定簇的需求。这些决定簇代表着可分别与T和B淋巴细胞相互作用的载体和半抗原决定簇。然而，载体的影响除了简单的抗原性之外通过在T-依赖性体液应答中T细胞的激活而扩大。
抗原分子上决定簇的结合能够通过T助细胞和T抑制细胞的差别激活影响免疫应答。证实这一结果的模式系统是通过基因控制应答小鼠(C57B1/6)和非应答小鼠(DBA/1)对合成三元共聚物L-谷氨酸60-L-丙氨酸30-L-酪氨酸10(GAT)的体液应答。C57 B1/6小鼠可应答该多肽，而DBA/1小鼠只有在GAT与甲基化牛血清白蛋白(MBSA)偶联条件下才会应答。然而，如果在用GAT-MSBA免疫之前用GAT给小鼠注射，则不会出现可检测的对GAT的抗体应答。对这些观察的解释是GAT可刺激应答小鼠中的T助细胞，但更可能是激活非应答小鼠中的T抑制细胞。抑制细胞的这一优势甚至当与MBSA偶联时也可防止对GAT的应答。然而，如果初次免疫是用GAT-MBSA，则T助细胞被载体部分的激活将有助于使由GAT激活的任何抑制细胞不起作用。
小肽和其它半抗原在不使用佐剂情况下不能引起强烈的免疫应答。目前可用的多数佐剂都不能引起有效地保护动物或人不受感染剂感染的免疫应答。因此，所需要的是一种能够用于动物或人的疫苗，该疫苗应导致免疫系统向能够保护动物或人免受感染的肽或其它半抗原进行持久和有效的免疫应答。
根据本发明提供了一种人或动物对肽或其它小的半抗原进行免疫特别有效的疫苗。这种改进了的疫苗对肽或其它小的半抗原具有长期有效的免疫反应。
本发明包括与小的抗原决定簇如肽或其它小的半抗原相结合的一种细菌蛋白。本发明中所用的细菌蛋白是细菌鞭毛。鞭毛可来自任何具鞭毛的微生物;但优选来自沙门氏菌(Salmonella)的鞭毛。然而，应当理解的是，为某一目的所优选的鞭毛菌应该依据其特定抗原的要求而进行，在本发明中并没有严格限制。细菌鞭毛可以是天然的聚合化形式，也可以是再次聚合化的鞭毛蛋白。
本发明还包括将结合的鞭毛和肽与佐剂如嵌段共聚物一起施用。可与本发明的疫苗一起使用的佐剂优选嵌段共聚物，该共聚物包括在乙二胺起始物上接上亲水性聚氧乙烯(POE)而成的共聚物。然后，将疏水性聚氧丙烯(POP)的聚合物加到亲水性POE嵌段上。这样就得到一种八
其中，a是使聚氧乙烯(POE)所代表的亲水物部分占该化合物总分子量的约10%至40%的数;由聚氧丙烯(POP)所组成的八嵌段共聚物的该图还显示了两种化合物在加有和不加有佐剂Polyphore32∶5(CyRxCorporation，Atlanta，Geogia)的比较结果。
本发明包括一种疫苗，它在免疫动物和人抵抗小肽或其它半抗原方面特别有用。根据本发明，小肽或半抗原与从微生物得来的鞭毛相结合。鞭毛可以得自任何具鞭毛的微生物，但优选得自沙门氏菌的鞭毛。应当理解的是，对任何特殊目的所优选的细菌(从其获取鞭毛)应依据该目的特殊抗原要求，本发明并没有严格限制。
有效细菌具有单根鞭毛，而另一些则具有鞭毛丛，再有一些细菌则在整个细胞表面都分布有鞭毛。细菌鞭毛的直径在10至35nm之间，其长度有时会超过10至15μm，或者是细胞直径的许多倍。大多数细菌鞭毛表现出规则的和独特的卷曲，波长约2.5μm。
当本质为蛋白质的细菌鞭毛在pH3被酸化时，它们被解离为称作鞭毛蛋白的相同的单体亚单位，其分子量在大多数种类中约为40000。在适当的pH和盐浓度条件下，鞭毛蛋白单体将同时再聚集，所形成的结构与原来的鞭毛相同，具有与天然鞭毛波长相同的周期性的卷曲。
在实践本发明时，可以使用天然形式的完整细菌鞭毛，或被一些固定剂所固定的完整细菌鞭毛。此外，重新聚合的鞭毛蛋白适合用于本发明的实践中。据信，本发明的一个要点是，制剂中包括一种聚合物，它由鞭毛蛋白分子规则地排列成几何形式而组成，产生具特定微生物典型结构的延长的鞭毛。
抗原是化合物，当引入导哺乳动物中时，其结果是会形成抗体。根据本发明，可用的抗原的代表是蛋白质、糖蛋白和核蛋白，如肽荷尔蒙，血清蛋白，补体蛋白，结合因子，以及病毒或细菌产物。病毒或细菌的产物可以是生物通过酶切所产生的组分，或是由本专业领域普通技术人员所熟知的重组DNA技术所产生的生物的组分。以下是抗原的部分代表的名单蛋白质糖蛋白核蛋白肽荷尔蒙血清蛋白补体蛋白结合因子微生物产物病毒产物细菌产物真菌产物特异免疫原清蛋白血管紧张素舒缓激肽降钙素癌胚抗原绒膜促乳素绒膜促腺性激素促皮质激素促红细胞生成素因子Ⅷ纤维蛋白原α-2H球蛋白促滤泡素胃泌素硫酸盐胃泌素胰高血糖素促性腺激素结合珠蛋白乙肝表面抗原免疫球蛋白胰岛素促脂解激素促黑激素催产素肠促胰酶素胎盘催乳激素prathryin血管紧张素原促乳素生长激素促生长因子生长激素抑制素促甲状腺激素加压催产素胸腺生成素后叶加压素α-1-胎蛋白α-2H球蛋白髓磷脂髓磷脂碱性蛋白半抗原是化合物，当与致免疫载体相结合并引入到脊索动物体中时，将会激发形成对该半抗原为特异性的抗体。半抗原的代表有类固醇，如雌激素及可的松类，小分子量的肽，其它小分子量的生物化合物，药品，如抗生素，化疗化合物，工业污染物，香料，食品添加剂，食物的污染物，和/或它们的代谢物或衍生物。
本专业领域的普通技术人员已经熟知了一些被揭示的由细菌培养物中制备鞭毛的方法。优选的方法是如在此所述的Kobayashi，Rinker，和Koffler方法的改进[Arch.Biochem.Biophys，84，342-362(1959)]。
伤寒沙门氏菌(Salmonekkatyphi)TY2菌株在游动性琼脂中生长。应选择出高度游动的生物，因为它们产生大量的鞭毛。然后将这些生物接种到20升的类胰蛋白酶豆汁培养基中，以37℃培养大约30小时，直至Log生长期的终止。此时，加入甲醛产生0.3%的悬浮液可以杀死这些生物。最好用离心法收集生物体，但应注意避免产生过量的剪切力。然后在摇瓶中剧烈摇动20分钟将鞭毛从生物体上取下。同样，也可以使用那些既能产生剪切力以切下鞭毛而同时又不破坏生物体的混合器或装置。
用差速离心法将鞭毛与细胞体分开。用标准的实验用离心机以约2000rpm离心可以将细胞体除去。然后以30000rpm超速离心收集鞭毛。鞭毛再经重悬浮，再超速离心，倒去可溶性污染物。大的污染物将在透明的鞭毛滤饼的底部形成黑点，将其用物理方法除去。由20升细菌培养物中得到的终产物为大约100mg纯净的鞭毛。
将未固定的鞭毛以约pH2过夜酸化可以产生鞭毛蛋白。这一处理解离子鞭毛蛋白，产生了分子量约为30000的鞭毛蛋白单体。当单体在中性pH放置至少24小时，它们会集合成聚合化的鞭毛。。作为小抗原的佐剂或载体，重新聚合成的鞭毛具有与天然鞭毛相近的效力。鞭毛蛋白单体或其蛋白水解片段的效力就差得多。
用本专业领域普通技术人员熟知的任何一种标准方法都可以将抗原半抗原或肽化学结合到鞭毛上。其中之一最有效和最简单的方法是使用戊二醛。戊二醛是二价的交联化合物，它以共价键将肽与鞭毛连起来并进而固定鞭毛制剂。其它化学交联剂或化学抗原衍生物和二硝基费苯也是有效的。
连到鞭毛上的抗原量依具体的情况而不同，本发明对此并不严格限制。优选的是每个鞭毛蛋白单体有2-10个单位的肽或半抗原，这样的鞭毛制剂是有效的。
结合鞭毛制剂用透析，离心或其它标准方法纯化。然后以约100μg/ml的浓度将该材料重悬浮于盐水中。这种制剂以每次1～100μg的低剂量注射是有效的。在很多情况下，10μg的剂量就产生令人满意的反应。可以任何方便的途径注射，如静脉内，皮下，肌肉或腹膜内。对许多疫苗来讲，皮下或肌肉方式一般是最方便的。
例如，注射20μg结合有二硝基苯酚的伤寒沙门氏菌鞭毛，其结果是对半抗原DNP的特异性IgG抗体效价在注射后第一周末上升并保持几个月。
对鞭毛和结合有鞭毛的抗原的免疫反应的持续现象是没有预料到的和不寻常的。这种材料并不在注射部位形成抗原的局部沉积。所注射的鞭毛剂量的约90-95%均被分解并在24小时内被排泄出。在局部淋巴结的生发中心内有一部分该材料被保留较长时间。据信，这种抗原存在于生发中心的现象是负责抗体的长期生产的。
本发明具有许多超过以往佐剂制剂的优点。它在注射部位几乎不引起发炎并且是完全可被生物降解的。这正与油乳剂或无机盐，如铝的情况相反。只需很小剂量的抗原就可产生长期的免疫反应。很大部分的抗体是固体补体的IgG，它是抗疟疾，子孢子和其它重要感染所需要的。当与固定剂如戊二醛相结合制备时，则产物更加稳定。毫无疑问，它可以被冷冻干燥和在室温储存。当用盐水重新配制后，在冰箱内可以稳定几周，在室温下可以稳定几天。
同可能在敏感宿主中产生感染的活减毒疫苗不同，本发明的疫苗制剂仅包括聚合的蛋白，仅含有痕量的多糖。
本发明疫苗制备剂的优选剂量是5-500μg。每种疫苗的最适剂量依据的是结合有鞭毛蛋白的抗原和被免疫的动物或人的免疫条件。
本发明的疫苗还包括将该疫苗与佐剂一起使用以增强免疫反应。优选的可与本发明疫苗一起使用的佐剂(PolyphoreTM32∶5 Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)是一种嵌段共聚物，它包括在乙二胺起始物上建立亲水性聚氧乙烯(POE)所形成的聚合物。然后在亲水性聚氧乙烯嵌段上加上疏水性聚氧丙烯(POP)聚合物。结果形成一种八嵌段共聚物，其通式如下疏水物-亲水物-疏水物
其中，a是使POE所代表的亲水物部分占化合物总分子量约10%～40%的数;
由POP组成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量为约4000～9000道尔顿;
b是使POP占总八嵌段共聚物分子量的约60%～90%的数。
优选的佐剂具有下列通式疏水物-亲水物-疏水物
其中a约等于5，b约等于32。
另一种可与本发明疫苗共用的共聚物具下述通式
其中疏水物(C3H6O)的分子量约为2000～5000，化合物的总分子量约为2300～6000(Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)。
优选的佐剂具下式通式
其中疏水物(C3H6O)的分子量约为4300，亲水部分(C2H4O)a的重量百分比约为10%(Cyt Rx，Corporation，Atlanta，Georgia)。
聚合物的嵌段是在碱性催化剂存在下，以高温和高压的条件将氧化乙烯和氧化丙烯缩合到四功能乙二胺起始物上而形成的。依统计学而言，在每个共聚物中用以形成聚合物链的单体单位的数目是可以变化的。所给出的分子量是在每种制剂中共聚物分子重量的近似平均值。对这些嵌段共聚物的进一步描述请参见美国专利2674619号和2979528号，通过在此引述，将它们合并于本文(还可参见“AReciewofBloekPolymerSurfactans”，Schmolka，I.R.，J.Am，OilChemists′Soc.，54∶110-116，(1977)和BlockandGraftCopolymerization，Volume2，editedbyR.J.Ceresa，JohnWiley&Sons，NewYork，(1976)，通过在此引述，将它们也合并于本文)。
本发明的疫苗与八嵌段共聚物相混合并施用给人或动物。优选的与本发明疫苗一起使用的佐剂的数量约为0.1mg至5.0mg，更好的是约0.5mg至2.0mg。
以下的具体实施例将进一步说明本发明的增强生物体对小半抗原的免疫反应的情况。应当理解的是，对本专业领域的普通技术人员是明显的其它实施例也均包括在本发明中，而且本发明也不仅限于这些具体的实施例。
实施例1伤寒沙氏菌TY2菌株在游动性琼脂中生长。然后将生物体接种到20升类胰蛋白酶豆汁培养其中以37℃培养30小时，直至Log生长期的终止。加入甲醛杀死生物体以形成0.3%的悬浮液。离心收集生物体。此时要小心避免过度剪切力。然后在摇瓶中剧烈摇动20分钟将鞭毛从生物体上取下。其它的既能产生使鞭毛脱离的剪切力并同时又不破坏生物体本身的混合器或装置也都可使用。
用差速离心将鞭毛与细胞体分开。用标准实验用离心机以2000rpm离心除去细胞体。再以30000rpm超速离心收集鞭毛。超速离心后，将鞭毛重悬浮，再用超速离心机离心，倒掉可溶性污染物。大的污染物在透明的鞭毛滤饼的底部形成黑点，将其用物理方法除去。从20升细菌培养物中获得的终产物约为100mg纯净的鞭毛。
实施例2将鞭毛在pH约为2的条件下酸化12小时产生鞭毛蛋白。这一处理解离了鞭毛蛋白以产生三个鞭毛蛋白单体，它们的分子量约为30000。当将单体在中性pH放置至少24小时，则它们重新结合形成聚合化的鞭毛。
实施例3戊二醛是二价交联化合物，它将肽与鞭毛共价结合并进一步固定鞭毛制剂。这些将功能团结合到蛋白质上的方法是本专业领域的普通技术人员所熟知的。其它的化学交联剂或化学抗原衍生物，如二硝基氟苯均是有效的。
实施例4结合鞭毛制剂用透析，离心或任何其它的标准方法提纯。将该材料以约100μg/ml的浓度重新悬浮于盐水中。这一制剂在每次注射1-100μg的低剂量时就是有效的。在许多情况下，10μg的剂量就可产生令人满意的反应。该材料可以任何方便的方式注射，如静脉内，皮下，肌肉和腹膜内。通常对许多疫苗来讲，最方便的是皮下和肌肉注射。
实施例5
用酶联免疫检测法(ELISA)来确定抗三硝基苯酚半抗原的抗体。它是Saunder(见Saunders，G.C.，“Theartofsolidphaseenzymeimmunoassayincludingselectedprotocds”，inImmuassaysintheClinicalLaboratory，AlanR.Liss，NewYork，pp.111-112，1979)原来公开的方法的一种改进。
该检测法中使用了蛋白质，牛血清清蛋白，冰凝胶减小了粘附在塑料基质上的蛋白质的变性，并且使用蛋白质的表面活性剂减小了导致本底值升高和灵敏度降低的非特异性蛋白吸附。用戊二醛将抗原连到BSA包被的96孔微滴板上。洗去未结合的戊二醛。加到板上的抗原通过戊二醛的游离醛基共价结合到板上。
剩下的醛基用赖氨酸封闭，该板处于备用。用各种稀释度的抗血清接种这些板，冲洗，然后接种第二抗体，如结合有过氧化酶的山羊抗鼠IgG或其一种亚成分。清洗这些板并加入底物(例如带过氧化物的正苯二胺)。再用TitertekMultiscan光度计在429nm处读出吸收值。计算抗体的效价，为产生1/3至1/2最大本底O.D值所需的抗血清稀释值。通过与样品同时进行的抗血清参考对比使之标准化。这样有利于比较在不同天所测的效价。各种抗体的相对亲合力可以从分析由O.D值对血清稀释度所作的曲线的斜率来估计出。
实施例6在以下实验中，将平均每根鞭毛结合有4个TNP分子的鞭毛25μg给小鼠在后足垫接种。注射时配以0.5ml盐水。接种后的第8，19，30，50和90天，测定抗TNP的特异性抗体。实验的结果见图1。正如可见到的那样，对结合TNP的鞭毛的免疫反应在90天后仍然很显著。对常规TNP结合物如结合TNP的鸡胚清蛋白的反应期就短得多，而且抗体较价也低得多。仅注射一次在可溶性蛋白质载体上的半抗原，动物经常都不产生可检测量的抗该半抗原的抗体。
实施例7通过注射不同剂量的结合TNP的鞭毛来测定小鼠的反应剂量。给小鼠后足垫接种平均每个鞭毛蛋白分子(分子量约40000)结合有4个TNP分子的鞭毛。注射时配以0.5ml盐水。给小鼠注射的浓度如下4μg，10μg，25μg和50μg。接种后的第8和第19天测定在对TNP结合鞭毛的反应中所产生的抗体。实验结果见图2。
实施例8图3比较了小鼠对结合有TNP的鸡胚清蛋白(hEA)与结合有TNP的细菌鞭毛蛋白的免疫反应。在本实验中，按与鞭毛相同的方式用反应衍生性三硝基苯磺酸(TNBS)将TNP与hEA相结合。给小鼠后足垫注射100μg结合含有TNP和hEA或25μg结合有TNP的鞭毛。注射后的第10天，根据实施例5测定抗体较价。如图3所示，根据所测定的抗体效价可知，结合有TNP的鞭毛比结合有TNP的hEA所引起的免疫反应显著很多。应当注意的是，在本实验中，所用的TNP-hEA的量是结合有TNP的鞭毛的4倍(100μg-hEA对25μg结合有TNP的鞭毛)。
实施例9
给小鼠施以与实施例9相同的制剂，但为外加入1.0mgPolyphore32∶5佐剂(CytRxCorporation，Atlanta，GA)。给小鼠后足垫施以100μgTNP-hEA或25μg结合有TNP的鞭毛。10天后，按实施例5测定抗体的效价。实验的结果列于图3。如图所示，佐剂提高了对TNP-hEA和结合有TNP的鞭毛的免疫反应。然而，由结合有TNP的鞭毛所引起的免疫反应比由TNP-hEA所引起的更显著得多。
应当理解的是，以上所述仅是本发明的优选实施方案，并且在不脱离权利要求书中所述的本发明的范围和精神的条件下，还可作出许多改型和变化方案。
权利要求
1.一种疫苗，该疫苗含有有效量的与抗原结合的细菌鞭毛蛋白。
2.权利要求1的疫苗，其中的细菌鞭毛从沙门氏菌种中分离。
3.权利要求2的疫苗，其中沙门氏菌种是伤寒沙门氏菌。
4.权利要求1的疫苗，其中抗原选自下列一组物质半抗原、药物、肽、蛋白质、多糖、脂类、糖脂和糖肽。
5.权利要求1的疫苗，其中抗原来源于疟原虫。
6.权利要求1的疫苗，其中抗原来源于人的免疫缺乏病毒。
7.权利要求1的疫苗，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所组成。
8.权利要求1的疫苗，其中疫苗与佐剂一起给药。
9.权利要求8的疫苗，其中佐剂的结构式如下
其中a为用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的亲水物部分的数目，聚氧乙烯约占该化合物总分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)组成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量约为5000～7000道尔顿;和b为聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的数目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分约占该化合物总分子量的60%～90%。
10.权利要求8的疫苗，其中佐剂的结构式如下
其中a约等于5，b约等于32。
11.权利要求8的疫苗，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量约为2000～5000，该化合物的总分子量为2300～6000。
12.权利要求8的疫苗，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量为4300，亲水物(C2H4O)a的重量百分比约为10%。
13.一种使人或动物免疫的方法，该方法包括施用有效量的与抗原结合的细菌鞭毛蛋白的步骤。
14.权利要求13的方法，其中的细菌鞭毛从沙门氏菌种中分离。
15.权利要求14的方法，其中沙门氏菌种是伤寒沙门氏菌。
16.权利要求13的方法，其中抗原选自下列一组物质半抗原、药物、肽、蛋白质、多糖、脂类、糖脂和糖肽。
17.权利要求13的方法，其中抗原来源于疟原虫。
18.权利要求13的疫苗，其中抗原来源于人的免疫缺乏病毒。
19.权利要求13的方法，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所组成。
20.权利要求13的方法，其中疫苗与佐剂一起给药。
21.权利要求20的方法，其中佐剂的结构式如下
其中a为用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的亲水物部分的数目，聚氧乙烯约占该化合物总分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)组成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量约为5000～7000道尔顿;和b为聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的数目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分约占该化合物总分子量的60%～90%。
22.权利要求20的方法，其中佐剂的结构式如下
其中a约等于5，b约等于32。
23.权利要求20的方法，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量约为2000～5000，该化合物的总分子量为2300～6000。
24.权利要求20的方法，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量为4300，亲水物(C2H4O)a的重量百分比约为10%。
25.一种生产改进疫苗的方法，该方法包括(a)从细菌中分离鞭毛蛋白;和(b)使所说的鞭毛与抗原结合。
26.权利要求25的方法，其中的鞭毛蛋白从沙门氏菌种中分离。
27.权利要求26的方法，其中沙门氏菌种是伤寒沙门氏菌。
28.权利要求25的方法，其中抗原选自下列一组物质半抗原、药物、肽、蛋白质、多糖、脂类、糖脂和糖肽。
29.权利要求25的方法，其中抗原来源于疟原虫。
30.权利要求25的疫苗，其中抗原来源于人的免疫缺乏病毒。
31.权利要求25的方法，其中鞭毛由重新聚合的鞭毛蛋白所组成。
32.权利要求25的方法，其中疫苗与佐剂一起给药。
33.权利要求32的方法，其中佐剂的结构式如下其中a为用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的亲水物部分的数目，聚氧乙烯约占该化合物总分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)组成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量约为5000～7000道尔顿;和b为聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的数目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分约占该化合物的总分子量60%～90%。
34.权利要求32的方法，其中佐剂的结构式如下
其中a等于5，b等于32。
35.权利要求32的方法，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量约为2000～5000，该化合物的总分子量为2300～6000。
36.权利要求32的方法，其中佐剂的结构式如下其中疏水物(C3H6O)的分子量为4300，亲水物(C2H4O)a的重量百分比约为10%。
37.一种疫苗佐剂，该佐剂含有具有下式的共聚物
其中a为用聚氧乙烯(C2H4O)a(POE)表示的亲水物部分的数目，聚氧乙烯约占该化合物总分子量的10%～40%;由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)组成的八嵌段共聚物的疏水物部分的平均聚集分子量约为5000～7000道尔顿;和b为聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)的数目，八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分约占该化合物总分子量的60%～90%。
38.权利要求37的疫苗佐剂，其中佐剂的结构式如下
其中a等于5，b等于32。
全文摘要
本发明涉及一种与小的抗原决定簇结合的细菌蛋白，如肽或其它小的半抗原。用于本发明的细菌蛋白是细菌鞭毛。该鞭毛可来源于任何具有鞭毛的微生物，但最好是来自沙门氏菌种的鞭毛。细菌鞭毛可以天然聚合的形式存在或可为重新聚合的鞭毛蛋白。该疫苗对接种给人或动物以抵抗肽或其它小的半抗原是尤为有效的。改进的疫苗可提供对肽或小的半抗原持久和有效的免疫应答。
文档编号A61K39/39GK1030019SQ87106498
公开日1989年1月4日 申请日期1987年9月22日 优先权日1986年9月22日
发明者罗伯特·L·胡恩特 申请人:埃默里大学